PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN

SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA

MUHAMMAD NAZMI

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

ABSTRAK

MUHAMMAD NAZMI. Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak

Gundul (Annona glabra) Indonesia. Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan

BUDI ARIFIN.

Sirsak gundul (Annona glabra) termasuk ke dalam famili Annonaceae.

Tanaman dari famili Annonaceae telah dilaporkan mengandung senyawa alkaloid,

flavonoid, dan asetogenin yang sangat baik sebagai antikanker. Tujuan penelitian

ini adalah melakukan fraksionasi terpandu-uji toksisitas larva udang (BSLT) dan

pencirian ekstrak aktif dari daun A. glabra Indonesia serta mengidentifikasi

kandungan fitokimianya. Fraksionasi ekstrak etanol 95% menggunakan ekstraksi

cair-cair menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi air kuning, jingga, dan gelap, fraksi

kloroform, fraksi residu, fraksi heksana, dan fraksi metanol. Berdasarkan hasil

BSLT, fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif dengan nilai LC50 98 ppm. Uji

fitokimia, fraksi teraktif tersebut menunjukkan golongan alkaloid, flavonoid,

steroid, triterpenoid, dan tanin. Fraksionasi lebih lanjut menggunakan eluen

heksana-CH2Cl2-metanol (90:40:5) menghasilkan 16 noda. Noda dengan

keterpisahan paling baik dianalisis spektrum inframerahnya dan menunjukkan

gugus-gugus fungsi dengan ikatan -OH, C=C aromatik, C-H sp2, dan C-H sp

3.

Kata kunci: Annona glabra, sirsak gundul, uji toksisitas larva udang

ABSTRACT

MUHAMMAD NAZMI. Characterization of The Cytotoxic Active Extract from

Indonesian Pond Apple (Annona glabra) Leaves. Supervised by GUSTINI

SYAHBIRIN and BUDI ARIFIN.

Pond apple (Annona glabra) is a member of Annonaceae. It has been reported that

plants from Annonaceae family contains alkaloid, flavonoid, and acetogenin having

good anticancer potency. The objectives of this research were to fractionate A. glabra

leaves assisted with brine-shrimp lethality test (BSLT), to characterize the active

extract, and to identify the phytochemical constituents. Fractionation of 95% ethanol

extract using liquid-liquid extraction gave 7 fractions, namely yellow, orange, and

dark water, chloroform, residue, hexane, and methanol fractions. Based on the BSLT

results, chloroform fraction showed the highest activity with LC50 of 98 ppm.

Phytochemical test of the most active fraction showed alkaloid, flavonoid, steroid,

triterpenoid, and tanin components. Subsequent fractionation of the chloroform

fraction by using hexane-CH2Cl2-methanol (90:40:5) eluent produced 16 spots. The

infrared spectrum of the best separated spot was analyzed and showed functional

groups with -OH, aromatic C=C, C-H sp2, and C-H sp3 bonds.

Keywords: Annona glabra, brine-shrimp lethality test, pond apple

ii

PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN

SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA

MUHAMMAD NAZMI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

iii

Judul Skripsi : Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul

(Annona glabra) Indonesia

Nama : Muhammad Nazmi

NIM : G44096002

Tanggal Lulus:

Disetujui

Pembimbing I

Dr Gustini Syahbirin, MS

NIP 19600819 198903 2 002

Pembimbing II

Budi Arifin, SSi, MSi

NIP 19830109 200604 1 004

Diketahui

Ketua Departemen Kimia

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS

NIP 19501227 197603 2 002

iv

PRAKATA

Alhamdulillah. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala

limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul

(Annona glabra) Indonesia”. Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan

kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, dan para sahabatnya serta semua

pengikutnya hingga akhir zaman.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Gustini Syahbirin, MS dan

Budi Arifin, SSi, MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan arahan,

dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama melaksanakan penelitian.

Penulis juga mengucapkan terima kasih atas bantuan serta masukan selama

penelitian berlangsung kepada staf laboran Laboratorium Organik Pak Sabur serta

kepada Dr Bagus Purwanto, MAgr, Farida Laila, MSi, Atep Dian Supardan, SSi,

Ashadi Sasongko, SSi, dan rekan-rekan laboran di Direktorat Program Diploma

Analisis Kimia IPB.

Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada kedua orang tua, istri,

kakak, dan adik serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Terima

kasih juga dihaturkan kepada Doni, Nanda, Eris, Zulia, Wahyu, Dwi Utami, Ughi,

Laras, kepada rekan-rekan mahasiswa diploma IPB dan teman-teman

seperjuangan penelitian di Laboratorium Kimia Organik atas kerja samanya, serta

rekan-rekan mahasiswa S1 Kimia Alih Jenis atas kebersamaannya.

Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, Desember 2012

Muhammad Nazmi

v

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Banyumulek pada tanggal 5 Mei 1986 dari pasangan

Bapak H Ahsanul Arifin dan Ibu Nurmah. Penulis adalah putra keempat dari lima

bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari MA Nurul Hakim Kota Kediri dan pada

tahun yang sama diterima di Direktorat Program Diploma IPB Program Keahlian

Analisis Kimia. Tahun 2007_2008 penulis melaksanakan praktik kerja lapangan di

Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Tahun 2008_2009 melaksanakan magang kerja

di Shimota Farm Provinsi Ibaraki Jepang. Tahun 2009 penulis melanjutkan

pendidikan S1 pada Program Alih Jenis Departemen Kimia Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Tahun 2009_2012 penulis aktif sebagai asisten

dosen pada Direktorat Program Diploma IPB, dan pernah bekerja sebagai staf

Quality Control pada salah satu pabrik farmasi di daerah Bogor, pada tahun

2006_2008 penulis juga aktif di dalam berbagai organisasi. Di antaranya, penulis

pernah menjabat sebagai juru bicara BEM J IPB, anggota komisi disiplin

Direktorat Program Diploma IPB, serta aktif di dalam organisasi BKIM IPB.

vi

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE ................................................................................................................. 1

Alat dan Bahan........................................................................................................... 1

Lingkup Kerja ............................................................................................................ 1

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 3

Kadar Air ................................................................................................................... 3

Ekstrak ....................................................................................................................... 3

Toksisitas dengan Metode BSLT ............................................................................... 3

Fitokimia Fraksi Kloroform ....................................................................................... 4

Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif .......................................................................... 4

Analisis Spektrum FTIR ............................................................................................ 5

SIMPULAN DAN SARAN ..................................................................................... 6

Simpulan .................................................................................................................... 6

Saran .......................................................................................................................... 6

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 6

LAMPIRAN ............................................................................................................. 8

vii

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak gundul ...................................................... 4

2 Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi kloroform daun sirsak gundul ........................ 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Ekstrak hasil fraksionasi daun sirsak gundul ...................................................... 3

2 Hasil partisi ekstrak kloroform dengan berbagai campuran eluen ..................... 4

3 Hasil partisi fraksi kloroform dengan heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) pada λ

366 nm. ............................................................................................................... 5

4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) untuk

elusi pertama dan heksana-metanol (90:10) untuk elusi kedua. ......................... 5

5 Spektrum IR noda teratas fraksi kloroform daun sirsak gundul (warna hitam)

dibandingkan dengan kloroform (warna merah). ............................................... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram alir penelitian ........................................................................................ 9

2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul................................................... 10

3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan rendemen yang

dihasilkan .......................................................................................................... 11

4 Spektrum FTIR hasil pengukuran ..................................................................... 12

5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009) ........................................................... 13

viii

1

PENDAHULUAN

Salah satu tanaman berkhasiat obat yang

hidup di iklim tropis ialah sirsak gundul

(Annona glabra) yang termasuk famili

Annonaceae. Namun, di Indonesia sirsak

umumnya masih sebatas dimakan buahnya

(Wirakusumah 1995). Padahal, seluruh bagian

tanaman sirsak dapat dimanfaatkan lebih luas,

misalnya sebagai antitumor dan pestisida

(Kintzios dan Barberaki 2004).

Famili Annonaceae, termasuk A. glabra,

banyak dipelajari karena kemampuannya

sebagai antikanker. Senyawa antikanker yang

telah ditemukan meliputi golongan alkaloid,

flavonoid (Kintzios dan Barberaki 2004,

Maria et al. 2007), dan asetogenin.

Asetogenin merupakan senyawa antikanker

yang paling banyak ditemukan. Terdapat 2100

spesies di dalam famili Annonaceae, dan

senyawa asetogenin telah ditemukan pada

beberapa spesies antara lain A. squamosa

(serikaya), A. muricata (sirsak), A. bullata, A.

longifolia, A. reticulata, A. glabra, A. jahnii,

A. cherimolia, Asimina triloba, Asimina

pariflora, Goniothalamus giganteus, Xylopia

aromatica, Rollinia mucosa, dan R.

emarginata (McLaughlin 2008).

Khasiat atau manfaat tanaman famili

Annonaceae di antaranya dapat menurunkan

kadar darah dari antigen tumor, memperkecil

ukuran tumor, dan menghambat pembelahan

sel tumor. Selain itu, dapat meningkatkan

pergerakan tubuh, menambah energi, dan

memperpanjang waktu hidup (McLaughlin

2008).

Sebelum digunakan untuk produk

antikanker, senyawa antikanker harus diuji

sitotoksisitas terlebih dahulu. Uji ini

digunakan untuk memprediksi keberadaan

senyawa yang bersifat toksik terhadap sel

(Kurnijasanti et al. 2008).

Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan

untuk mengetahui aktivitas farmakologi suatu

senyawa. Prinsipnya, komponen bioaktif

bersifat toksik jika diberikan dengan dosis

tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Uji

toksisitas antara lain dilakukan dengan

menggunakan metode uji kematian larva

udang (BSLT) dengan larva Artemia salina

Leach sebagai hewan uji (Zebua 2011). Pada

metode BSLT, sifat toksik ekstrak ditentukan

dengan menghitung jumlah kematian larva

udang pada setiap konsentrasi yang diujikan.

Suatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki

nilai LC50 kurang dari 1000 ppm setelah

waktu kontak 24 jam (Meyer et al. 1982).

Kandungan metabolit sekunder tanaman

beragam bergantung pada tempat tumbuhnya.

Hal ini mendorong pentingnya penelitian

kandungan dan khasiat tanaman A. glabra

Indonesia. Pada penelitian ini, dilakukan

fraksionasi-terpandu uji toksisitas terhadap

ekstrak etanol dari daun A. glabra. Salah satu

noda dengan keterpisahan yang baik dari

fraksi teraktif yang didapat dicirikan

kelompok senyawanya dengan

spektrofotometer inframerah transformasi

Fourier (FTIR).

METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan selama

penelitian ini ialah alat-alat kaca, mikropipet,

neraca analitik, oven, penguap putar,

multiwell 24 sumur, dan alat FTIR Perkin

Elmer seri SpectrumOne Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Bahan-

bahan yang digunakan ialah daun sirsak

gundul dari kawasan Kampus IPB Dramaga,

etanol 95%, larva A. salina Leach, heksana,

kloroform, pelat kromatografi lapis tipis

(KLT) aluminium, silika gel G60F254 dari

Merck, diklorometana, metanol, dan air

suling.

Lingkup Kerja

Metode penelitian yang dilakukan

mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yang

meliputi preparasi sampel daun sirsak gundul,

penentuan kadar air, ekstraksi daun sirsak,

partisi ekstrak etanol, uji toksisitas fraksi-

fraksi ekstrak, serta uji fitokimia dan pencirian

gugus fungsi dari salah satu komponen fraksi

teraktif.

Penentuan Kadar Air

Cawan porselen dikeringkan di dalam

oven bersuhu 105 °C selama 60 menit.

Selanjutnya cawan didinginkan dalam

eksikator selama 30 menit, dan ditimbang

bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel

dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan

dikeringkan di dalam oven selama 24 jam

pada suhu 105 °C. Setelah didinginkan dalam

eksikator sekitar 30 menit, cawan ditimbang

sampai diperoleh bobot tetap. Penentuan

kadar air dilakukan sebanyak 3 kali ulangan

(triplo) dan ditentukan dengan persamaan

berikut (AOAC 1984):

Kadar air (%) = 100%A

B

2

Keterangan:

A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g)

B = bobot bahan setelah dikeringkan (g)

Preparasi dan Ekstraksi Daun Sirsak

Gundul

Daun sirsak gundul segar dipotong kecil-

kecil kemudian dicuci dengan air dan

dikering-udarakan. Sebanyak kira-kira 1 kg

sampel yang sudah kering dimaserasi dengan

etanol 95% dengan nisbah 1:8 selama 3×24

jam. Ekstrak dipekatkan dengan penguap

putar. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang

dan dihitung rendemennya dengan persamaan

berikut:

Keterangan:

a = bobot ekstrak (g)

b = bobot contoh awal (g)

fk = faktor koreksi [(100+kadar air) /100]

Partisi Ekstrak (Rupprecht et al. 1990)

Ekstrak pekat etanol dipartisi dengan

pelarut kloroform-air 1:1. Mula-mula ekstrak

dilarutkan dengan kloroform, dimasukkan ke

corong pisah, lalu diekstraksi dengan air. Fase

organik dan fase residu dipisahkan dari fase

air. Fase air hasil ekstraksi dibagi jadi 3

bagian, yaitu fase air dengan wadah gelap,

fase air berwarna jingga, dan fase air

berwarna kuning. Masing-masing dipekatkan

dengan penguap putar dan freeze dry.

Selanjutnya ekstrak pekat kloroform dipartisi

dengan pelarut heksana-metanol dengan

nisbah 1:1, dan setiap fraksi yang didapat juga

dipekatkan dengan penguap putar.

Uji Toksisitas Fraksi-Fraksi Ekstrak

Penetasan Kista A. salina. Sebanyak 50

mg kista A. salina dimasukkan ke dalam

wadah berisi air laut yang sudah disaring dan

diaerasi. Kista dibiarkan selama 48 jam di

bawah pencahayaan lampu agar menetas

sempurna. Larva yang sudah menetas

digunakan untuk uji toksisitas.

Uji Toksisitas terhadap A. salina. Larutan stok ekstrak kloroform, ekstrak air,

residu, ekstrak heksana, dan ekstrak metanol

dibuat dalam konsentrasi 2000 ppm dengan

pelarut air laut kemudian diencerkan hingga

diperoleh konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000

ppm. Ke dalam multiwell dimasukkan 400 μL

air laut, 10 ekor larva udang dalam 600 μL air

laut, dan 1 mL ekstrak. Ulangan dilakukan

sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dengan

aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam.

Nilai LC50 ditentukan dengan menggunakan

perangkat lunak SPSS.

Uji Fitokimia Fraksi Teraktif (Harborne

1987)

Alkaloid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak

teraktif dilarutkan dalam 10 mL kloroform

lalu ditambahkan 4 tetes NH4OH dan disaring.

Filtrat yang diperoleh ditambahkan 10 tetes

H2SO4 2 M, kemudian dikocok hingga

terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam diteteskan

pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi

Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji positif

jika berturut-turut didapatkan endapan

berwarna jingga, putih, dan cokelat.

Saponin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak

teraktif dilarutkan dalam 10 mL air suling

panas dan dididihkan selama 5 menit.

Campuran disaring dan dikocok kuat selama

10 menit hingga timbul busa. Apabila busa

stabil selama 10 menit, maka filtrat positif

mengandung saponin.

Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak 0.1

g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 25

mL etanol panas (50 ⁰C), kemudian disaring

ke atas kaca arloji dan diuapkan sampai

kering. Residu dilarutkan dalam eter dan

ditambahkan 3 tetes pereaksi Lieberman-

Buchard (3 tetes anhidrida asam asetat dan 1

tetes H2SO4). Uji positif triterpenoid ditandai

dengan terbentuknya warna merah atau ungu,

sedangkan uji positif steroid ditandai dengan

terbentuknya warna hijau atau biru.

Tanin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak

teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades

panas kemudian disaring. Filtrat ditambahkan

dengan FeCl3 1%. Bila dihasilkan warna

hijau, biru, atau hitam, maka filtrat positif

mengandung tanin.

Flavonoid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak

teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades

panas kemudian disaring. Sebanyak 5 mL

filtrat ditambahkan 0.05 g serbuk Mg, 1 mL

HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, kemudian

dikocok kuat. Adanya flavonoid ditunjukkan

dengan terbentuknya warna merah, jingga,

atau kuning pada lapisan amil alkohol.

Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif Fraksi ekstrak teraktif ditotolkan pada

pelat KLT sebanyak 5 kali totolan. Setelah

kering, langsung dielusi dalam bejana

kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap

eluen pengembang. Eluen yang digunakan

ialah campuran CHCl3-MeOH (9:1), CH2Cl2-

MeOH (19:1), C6H6-EtOAc-MeOH (5:4:1)

(Rupprecht et al. 1990), CH2Cl2-MeOH (2:1),

heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) (Gleye et

3

al. 2000), dan heksana-metanol (90:1) (Wu et

al. 1995). Noda yang dihasilkan dari proses

elusi diamati di bawah lampu UV pada

panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen

yang menghasilkan noda paling banyak

dengan keterpisahan baik dipilih sebagai eluen

pada proses pemisahan dengan KLT

preparatif.

Analisis Spektrum FTIR

Salah satu noda dengan keterpisahan

paling baik hasil pemisahan dengan KLT

preparatif diukur dengan spektrofotometer

FTIR. Spektrum yang dihasilkan dianalisis

untuk menentukan golongan senyawanya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar Air

Kadar air dapat digunakan untuk

menentukan jumlah sampel awal yang harus

disediakan sampai keseluruhan proses isolasi

berakhir. Selain itu, kadar air dapat digunakan

untuk mengukur ketahanan sampel terhadap

kontaminan jamur atau mikrob. Menurut

Winarno (1992), suatu sampel dapat disimpan

dalam jangka waktu yang lama jika memiliki

kadar air di bawah 10%. Sampel daun sirsak

gundul segar yang digunakan pada penelitian

ini mengandung air yang cukup banyak, yaitu

75.45%, sedangkan sampel yang sudah

dikeringudarakan (serbuk) mengandung air

9.64% (Lampiran 2).

Berdasarkan hasil di atas, sampel daun

yang masih basah tidak boleh dibiarkan dalam

jangka waktu lama karena dapat menyebabkan

tumbuhnya jamur atau mikrob. Sampel dapat

disimpan dalam jangka waktu lama jika sudah

dikeringudarakan. Selain itu, diperlukan

sampel daun segar dalam jumlah banyak

karena sebagian besar komponen yang

terkandung merupakan air yang terikat secara

fisik.

Ekstrak

Proses ekstraksi pada penelitian ini

dilakukan dengan metode maserasi atau

perendaman dengan pelarut etanol 95%.

Metode ini dipilih untuk mengurangi

kemungkinan hilangnya komponen-komponen

yang tidak tahan terhadap proses pemanasan.

Perendaman sampel pada pelarut organik akan

memecah dinding sel tumbuhan akibat

perbedaan tekanan di dalam dan luar sel

sehingga metabolit sekunder yang ada dalam

sitoplasma akan terlarut pada pelarut organik

(Darwis 2000).

Pelarut alkohol lazim digunakan dalam

proses ekstraksi awal karena kemampuannya

melarutkan komponen polar maupun nonpolar

(Harbone 1987). Selain itu, penggunaan

alkohol pada ekstraksi awal dapat menambah

rendemen senyawa asetogenin (Rupprecht et

al. 1990). Penelitian senyawa asetogenin

sebelumnya juga banyak melakukan ekstraksi

awal dengan pelarut alkohol seperti metanol

(Gleye et al. 1998; Chang dan Wu 2001) dan

etanol (Wu et al. 1995; Zang et al. 1996; Kim

et al. 1998). Etanol digunakan karena lebih

aman dibandingkan dengan metanol. Bagan

alir proses ekstraksi dan partisi yang

dilakukan dapat dilihat pada Lampiran 3.

Partisi ekstrak pekat etanol 95% hasil

maserasi menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi

air kuning, fraksi air jingga, fraksi air gelap,

fraksi kloroform, fraksi residu, fraksi heksana,

dan fraksi metanol (Gambar 1). Rendemen

setiap fraksi yang dihasilkan dapat dilihat

pada Lampiran 3.

Gambar 1 Ekstrak hasil fraksionasi daun

sirsak gundul: fraksi etanol 95%

(a), fraksi air gelap (b), fraksi

air jingga (c), fraksi air kuning

(d), fraksi kloroform (e), fraksi

heksana (f), fraksi residu (g),

dan fraksi metanol (h).

Toksisitas dengan Metode BSLT

Uji toksisitas dilakukan untuk menguji

potensi sitotoksik dari keseluruhan fraksi hasil

partisi ekstrak etanol 95% dengan parameter

nilai LC50 yang diperoleh dengan metode

BSLT. LC50 merupakan konsentrasi senyawa

bioaktif yang dapat menyebabkan kematian

50% populasi hewan uji.

Hasil uji BSLT menunjukkan bahwa

semua fraksi memiliki nilai LC50 di bawah

1000 ppm (Tabel 1). Menurut Krisnaraju et al.

(2005), suatu fraksi dikatakan aktif dan

berpotensi sebagai antikanker jika nilai LC50

kurang dari 1000 ppm. Oleh karena itu, dapat

disimpulkan bahwa keseluruhan fraksi aktif

dan berpotensi sebagai antikanker.

4

Perhitungan LC50 dilakukan dengan metode

SPSS pada selang kepercayaan 95%.

Tabel 1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak

gundul

Fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif

dengan nilai LC50 paling rendah, yaitu 98

ppm. Oleh karena itu, fraksi tersebut

difraksionasi lebih lanjut. Uji fitokimia

dilakukan terhadap fraksi kloroform untuk

memastikan golongan senyawa yang ada.

Fitokimia Fraksi Kloroform

Pengujian fitokimia bertujuan menentukan

golongan metabolit sekunder yang terdapat di

dalam tanaman. Uji fitokimia fraksi kloroform

menunjukkan kandungan alkaloid, flavonoid,

triterpenoid, steroid, dan tanin (Tabel 2).

Rahayu et al. (1993) telah meneliti kandungan

senyawa metabolit sekunder bagian daun

tumbuhan A. squamosa. Fraksi kloroform

daun didapat mengandung senyawa alkaloid,

flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin.

Hasil tersebut sama dengan yang diperoleh

pada penelitian ini. Senyawa alkaloid dalam

fraksi kloroform diduga terkandung paling

banyak, berdasarkan intensitas warna yang

dihasilkan dari uji fitokimia.

Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi

kloroform daun sirsak gundul

Golongan senyawa Hasil Keterangan

Alkaloid (++) terjadi endapan

Flavonoid (+) berwarna kuning

Triterpenoid (+) berwarna merah

Steroid (+) berwarna hijau

Saponin (-) tidak berbusa

Tanin (+) berwarna cokelat

Keterangan: (++) terdeteksi banyak, (+) terdeteksi sedikit, (-)

(-) tidak terdeteksi

Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif

Partisi fraksi ekstrak teraktif diawali

dengan menguji beberapa eluen campuran

yang lazim digunakan untuk isolasi

asetogenin. Eluen CHCl3-MeOH (9:1)

(Gambar 2a) dan CH2Cl2-MeOH (19:1)

(Gambar 2b) menghasilkan 2 noda dengan

keterpisahan yang tidak baik. Eluen C6H6-

EtOAc-MeOH (5:4:1) (Gambar 2c)

menghasilkan 7 noda dengan keterpisahan

yang kurang baik. Campuran CH2Cl2-MeOH

(2:1) (Gambar 2d) tidak menghasilkan

keterpisahan yang baik, semua noda melebar

dan memanjang. Eluen heksana-CH2Cl2-

MeOH (90:40:5) (Gambar 2e) menghasilkan

16 noda dengan keterpisahan yang relatif baik

dibandingkan dengan eluen-eluen

sebelumnya. Eluen heksana-metanol (90:1)

(Gambar 2f) menghasilkan 6 noda dengan

keterpisahan yang baik, tetapi totolan noda

masih terlihat pekat yang menunjukkan bahwa

masih banyak komponen belum terpisahkan

(Gambar 2).

a b c d e f

Gambar 2 Hasil partisi ekstrak kloroform

dengan campuran eluen CHCl3-

MeOH (9:1) (a), CH2Cl2-MeOH

(19:1) (b), C6H6-EtOAc-MeOH

(5:4:1) (c), CH2Cl2-MeOH (2:1)

(d), heksana-CH2Cl2-MeOH

(90:40:5) (e), dan heksana-

metanol (90:1) (f).

Campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH

(90:40:5) memberikan noda paling banyak

dengan keterpisahan relatif baik dibandingkan

dengan eluen lainnya. Eluen ini kemudian

digunakan dalam KLT preparatif. Didapatkan

noda dengan keterpisahan yang paling baik

berwarna merah dengan nilai retardation

factor (Rf) 0.66 (Gambar 3). Pemilihan noda

tersebut didasarkan sifat nonpolar dari

asetogenin yang aktif sebagai antikanker.

Oleh karena itu, penggunaan eluen yang

nonpolar akan memisahkan senyawa tersebut

paling jauh.

Ekstrak LC50 (ppm)

Fraksi air kuning 828

Fraksi air jingga 297

Fraksi air gelap 304

Fraksi residu 884

Fraksi kloroform 98

Fraksi methanol 350

Fraksi heksana 377

5

Gambar 3 Hasil partisi fraksi kloroform

dengan heksana-CH2Cl2-MeOH

(90:40:5) pada λ 366 nm.

Analisis Spektrum FTIR

Noda dengan keterpisahan paling baik

hasil KLT preparatif diperiksa lebih lanjut

kemurniannya dengan KLT analitik 2

dimensi. Elusi pertama menggunakan

campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH

(90:40:5), dilanjutkan elusi kedua dengan

campuran heksana-metanol (90:10). Proses

elusi pertama dan kedua menghasilkan noda

tunggal (Gambar 4).

E1

E2

Gambar 4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen

heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5)

untuk elusi pertama dan heksana-

metanol (90:10) untuk elusi

kedua.

Noda hasil KLT preparatif selanjutnya

dilarutkan dengan kloroform dan diukur

spektrumnya, dibandingkan dengan spektrum

kloroform p.a. Spektrum masing-masing dapat

dilihat pada Lampiran 4, sedangkan spektrum

gabungan ditunjukkan pada Gambar 5.

Spektrum IR kloroform dicirikan oleh

bilangan gelombang ( ) 757.9 cm-1

yang

merupakan daerah vibrasi ulur C-Cl. Selain

itu, terdapat vibrasi ulur C-H di 3019.20 cm

-1. Spektrum kloroform tersebut sama

dengan spektrum kloroform yang dirujuk dari

Pavia et al. (2009) (Lampiran 5). Menurut

Mistry (2009), puncak khas untuk pelarut

kloroform berada pada kisaran 3060_2960,

1250_1180, 945

_935, dan 830

_600 cm

-1. Oleh

karena itu, serapan dalam spektrum noda

teratas hasil KLT preparatif di 626.97,

669.35, 849.42, 877.38, 928.66, 1216.01,

1421.00, 1475.11, 1522.74, dan 2400.11 cm-1

juga berasal dari pelarut kloroform.

Gambar 5 Spektrum IR noda teratas fraksi

kloroform daun sirsak gundul

(warna hitam) dibandingkan

dengan kloroform (warna

merah).

Spektrum FTIR noda setelah dikoreksi

dengan spektrum kloroform memberikan

pendugaan bahwa terdapat gugus fungsi

alkohol (-OH) pada 3433.57 (ulur O-H

berikatan hidrogen), 3630.31, dan 3682.01

cm-1

(ulur O-H bebas). Kemunculan pita

serapan tajam O-H bebas di 3650_3600 cm

-1

bersamaan dengan pita serapan lebar O-H

berikatan hidrogen di 3400_3300 cm

-1 lazim

dijumpai ketika spektrum senyawa ditentukan

dalam pelarut (Pavia et al. 2009). Hal tersebut

diperkuat dengan adanya puncak pada

1016.70 cm-1

yang menunjukkan vibrasi ulur

C-O untuk alkohol primer (Mistry 2009).

Selain gugus tersebut, diduga terdapat C=C

aromatik berdasarkan serapan pada 1475.11 dan 1602.36 cm

-1. Serapan kuat pada

3019.20 cm-1

diperkirakan berasal dari C-H

sp2 (alkena atau aromatik). Terdapat beberapa

serapan gugus C-H, yaitu pada 2837.86

(ulur C-H alifatik alkana), 2944.84 (ulur C-H

alifatik alkana), dan 928.66 (tekuk C-H

alkena) cm-1

.

Spektrum FTIR tersebut tidak memberikan

puncak pada 1770 dan 1745 cm-1

yang

merupakan ciri khas lakton jenuh dan

takjenuh dari asetogenin (Rupprecht et al.

1990). Oleh sebab itu, dapat disimpulkan

bahwa noda yang diisolasi tersebut bukan

golongan asetogenin. Selain itu, tidak terdapat

serapan (puncak) untuk gugus karbonil (C=O)

4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0

-2.0

10

20

30

40

50

60

70

80.0

cm-1

%T

C HC l3 pa

spot merah teratas

C HC L3 pa

Laborato ry T es t Result

6

sebagai ciri umum kebanyakan flavonoid

(Sukadana 2010). Oleh sebab itu, noda

tersebut juga bukan termasuk golongan

flavon, flavonol, atau golongan flavonoid lain

dengan gugus karbonil di C-4.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Uji toksisitas BSLT menghasilkan fraksi

kloroform sebagai fraksi teraktif dari ekstrak

daun sirsak gundul (A. glabra) dengan nilai

LC50 98 ppm. Berdasarkan hasil uji fitokimia,

fraksi tersebut mengandung golongan

senyawa alkaloid, flavonoid, steroid,

triterpenoid, dan tanin.

Eluen campuran heksana-CH2Cl2-MeOH

(90:40:5) menghasilkan noda paling banyak

dengan keterpisahan yang baik. Spektrum

FTIR dari salah satu noda dengan

keterpisahan yang paling baik menunjukkan

keberadaan gugus alkohol (-OH), C=C

aromatik, serta C-H sp2 dan sp

3.

Saran

Semua noda hasil KLT preparatif harus

diuji dengan BSLT untuk menentukan noda

teraktif. Penentuan struktur noda teraktif

dilanjutkan dengan spektometer resonans

magnet inti dan spektometer massa.

DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical

Chemists. 1984. Official Methods of

Analysis. Ed ke-14. Arlington: AOAC.

Chang FR, Wu YC. 2001. Novel cytotoxic

Annonaceous acetogenins from Annona

muricata. J Nat Prod. 64:925-931.

Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium

dalam Penelitian Senyawa Bahan Hayati.

Padang: FMIPA Universitas Andalas.

Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller

R, Cave A. 1998. cis-Monotetrahydrofuran

acetogenins from the roots of Annona

muricata. J Nat Prod. 61:576-579.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia.

Padmawinata K, penerjemah. Bandung:

ITB. Terjemahan dari: Phytocemical

Methods.

Kim G et al. 1998. Two new mono-

tetrahydrofuran ring acetogenins,

annomuricin E and muricapentocin, from

the leaves of Annona muricata. J Nat

Prod. 61:432-436.

Kintzios SE, Barberaki MG, editor. 2004.

Plants That Fight Cancer. New York:

CRC Pr.

Krishnaraju AV et al. 2005. Assessment of

bioactivity of Indian medicinal plants

using brine shrimp (A. salina) lethality

assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134.

Kurnijasanti R, Hamid IS, Rahmawati K.

2008. Efek sitotoksik in vitro dari ekstrak

buah mahkota dewa (Phaleria

marcocapra) terhadap kultur sel kanker

mienoma. J Penel Med Eksakta. 7(1):48-

54.

Maria RGV et al. 2007. Flavonoids from

Annona dioica leaves and their effects in

Ehrlich carcinoma cells, DNA-

topoisomerase I and II. J Braz Chem Soc.

18:1554-1559.

McLaughlin JL. 2008. Paw Paw and cancer:

Annonaceous acetogenins from discovery

to commercial products. J Nat Prod.

71:1311-1321.

Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982.

Brine shrimp: a convenient general

bioassay for active plant constituent.

Planta Medica. 45:31-34.

Mistry BD. 2009. A Handbook of

Spectroscopic Data Chemistry (UV, IR,

PMR, 13

C NMR, and Mass Spectroscopy).

Jaipur: Oxford.

Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, Vyvyan

JR. 2009. Introduction to Spectroscopy.

Ed ke-4. Belmont: Brooks/Cole.

Rahayu RD, Chairul, Harapini M. 1993.

Penelitian fitokimia dan efek mikrobial

ekstrak serikaya terhadap E. coli. Di

dalam: Proyek Litbang Sumber Daya

Hayati. Prosiding Seminar Hasil

Penelitian dan Pengembangan; Bogor, 14

Jun 1993. Bogor: Puslitbang Biologi-LIPI;

1993. hlm 154-164.

7

Rupprecht JK, Hui YH, McLaughlin JL. 1990.

Annonaceous acetogenin: a review. J Nat

Prod. 53:237-278.

Sukadana IM. 2010. Aktivitas antibakteri

senyawa flavonoid dari kulit akar Awar-

Awar (F. septica). J Kim. 4:63-70.

Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi.

Jakarta: Gramedia.

Wirakusumah ES. 1995. Buah dan Sayur

untuk Terapi. Jakarta: Swadaya.

Wu FE et al. 1995. Two new cytotoxic

monotetrahydrofuran Annonaceous

acetogenins, annomuricins A and B, from

the leaves of Annona muricata. J Nat

Prod. 58:830-836.

Zebua NI. 2011. Aktivitas hambatan

gabungan ekstrak kunyit (Curcuma

domestica Va), temulawak (Curcuma

xanthorriza Roxb), dan lempuyang

(Zingiber zerumbet) terhadap poliferasi sel

kanker usus besar HCT (ATCC-CCL 116)

[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor.

7

LAMPIRAN

9

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

KLT analitik

KLT preparatif

Uji fitokimia

Uji toksisitas (BSLT)

Ekstrak H2O Ekstrak CHCl3

Ekstrak etanol

Penentuan kadar air Daun sirsak

Pengeringan sampel

Maserasi dengan etanol

95%

Ekstrak teraktif

Noda dengan keterpisahan paling baik

Spektrofotometer FTIR

Partisi dengan heksana-

metanol

Ekstrak metanol Ekstrak heksana

Ekstrak residu

Partisi dengan CHCl3-H2O

10

Segar

Lampiran 2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul

Setelah dikeringkan

Ulangan Massa awal (g) Massa akhir (g) Bobot sampel

kering (g)

Kadar air

(%) cawan sampel cawan + sampel

1 3.4490 1.9508 5.2052 1.7562 9.98

2 3.3200 1.5594 4.7320 1.4120 9.45

3 3.1550 1.7661 4.7536 1.5986 9.48

Rerata 9.64

Ulangan Massa awal (g) Massa akhir (g)

cawan + sampel

Bobot sampel

kering (g)

Kadar air

(%) Cawan sampel

1 6.5050 3.0034 7.2456 0.7406 75.34

2 6.4353 2.9670 7.1482 0.7129 75.97

3 6.1543 3.0750 6.9217 0.7674 75.04

Rerata 75.45

11

Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan

rendemen yang dihasilkan

Serbuk daun A. glabra (505.52 g)

Partisi heksana-

MeOH 90%

(1:1)

Zat larut etanol 95% (5.07%) Ampas/sisa (94.93%)

Partisi CHCl3-H2O (1:1)

Zat larut H2O (22.50%) Residu (5.04%) Zat larut CHCl3 (72.46%)

Zat larut heksana

(13.60%)

Zat larut MeOH 90%

(86.40%)

Air kuning

(21.62%)

Air gelap

(32.44%)

Air jingga

(45.94%)

12

Lampiran 4 Spektrum FTIR hasil pengukuran

4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0

-2.0

10

20

30

40

50

60

70

83.0

cm-1

%T

C HC l3 pa

spot merah teratas

C HC L3 pa

Laborato ry T es t Result

3689.00

3621.12

3019.65

2399.79

1522.76

1475.62

1420.48

1215.63

1045.98

928.69

757.55

669.24

626.96

4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0

-3.0

10

20

30

40

50

60

70

80

85.0

cm-1

%T

C HC l3 pa

spot merah teratas

Laborato ry T es t Result

3682.01

3630.32

3433.57

3019.20

2944.84

2837.86

2400.11

1602.36

1522.74

1475.11

1421.00

1333.68

1216.01

1016.70

928.66

877.38

849.42

757.95

669.35

626.97

495.17

Spektrum FTIR kloroform p.a

Spektrum FTIR noda teratas dari fraksi kloroform A. glabra dengan pelarut kloroform p.a

13

Lampiran 5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009)