PEMERIKSAAN

IMUNOLOGI

OLEH :NUGROHO

TRISTYANTO.S.Si., MM

Immunoassay

2

Sistem pemeriksaan yang mempergunakan satu atau lebih produk atau reagen imunologik

Prinsip dasar: ikatan antara molekul imunoglobulin (Ab) dengan antigen (Ag)

Hasil interaksi Ag – Ab (kompleks imun) harus terlihat dan dapat diukur

Dasar

Reaksi Ag dengan Ab spesifik

Tujuan Mendeteksi keberadaan Ag dalam serum memakai Ab spesifikMendeteksi keberadaan Ab dalam serum memakai Ag yang sesuai

4

Manfaat

1. Menentukan status imunitas

2. Memperkirakan prevalensi penyakit

3. Mengetahui adanya invasi mikroorganisme, jika isolasi kuman tidak dapat dilakukan

4. Menunjang diagnosis penyakit

Macam :1. Uji kualitatif hasil + / -2. Uji kuantitatif hasil kadar

Pengenceran tertinggi hasil +

(uji semikuantitatif)

Contoh :

pengenceran 1 dalam 8: 1 vol serum +7 vol pengencer: titer 1/ 8 sampel diencerkan 8 X

Bahan pemeriksaan

6

Serum, plasma, urinPlasma hanya untuk pemeriksaan tertentu saja.Puasa: untuk metode aglutinasi.Serum harus dihindarkan dari hemolisis, lipemik & kontaminasi bakteri (pengiriman < 2 jam) Disimpan dalam

Suhu 2 – 8oC : 48 jam -20oC s/d - 70oC: > 48 jam

Diberi label

Teknik Pemeriksaan Imunoserologi

7

1. Imunopresipitasi2. Aglutinasi, flokulasi3. Fiksasi komplemen4. Radioimmunoassay

(RIA)5. Enzyme immunoassay

(EIA) atauEnzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

6. Immunofluorescent (IF)7. Immunochromatograph

ic technique (ICT)

Non Labelling

Labelling

Interaksi Antigen-Antibodi

Interaksi primer:Pengikatan Ag-Ab tingkat molekulerMemerlukan indikator/label (isotop,

enzim, floresen)Sesuai utk pengukuran Ag/Ab dgn

kadar yg rendah

Interaksi sekunder:Reaksi Ag-Ab bisa secara langsung

atau dgn bantuan komplemenPrinsip dasar : reaksi presipitasi/

aglutinasiBila partikel Ag terikat latex atau

eritrosit → aglutinasi

Primary immune phenomena

Secondary immune phenomena

+

Ag Ab Kompleks Imun

IMUNOASSAI NON LABEL

1. Imunopresipitasi

Interaksi sekunder → Ag-Ab komplek tdk larut (presipitat)

Media : cair atau semisolid (gel)Faktor yg mempengaruhi :

Aviditas Ab → stabilitas komplek Ag-Ab

Suhu (optimal 0-37o C) pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ;

>7,5 → mudah disosiasi Molaritas (molaritas < 0,15 M) ;

>0,15 M → men-cegah presipitasi

Pembentukkan presipitat terjadi apabila konsentrasi Ag dan Ab seimbang (zona ekivalen = ZE)

Konsentrasi Ag berlebih → Komplek Ag-Ab yg terbentuk larut kembali disebut postzone effect

Konsentrasi Ab berlebih → Komplek Ag-Ab yg terbentuk tetap larut disebut prozone effect

ZE sempit → Ag bersifat mudah larut

ZE lebar → Ag bersifat tdk mudah larut, BM besar, & multikomponen Ag

Imunopresipitasi…

PR

ES

IPIT

AS

I A

NT

IGE

N-A

NT

IBO

DI

Prozone

KONSENTRASI ANTIGEN

Postzone

Ekses antibodi

Seimbang

Ekses antigen

2. Aglutinasi

Umumnya : Ag bentuk partikel + Ab spesifik → Aglutinasi

Reaksi 2 tahap :1. Ab dgn salah satu antigen binding

site (Fab) bereaksi dgn Ag2. Fab yg lainnya berikatan dgn Ag

lain yg sudah berikatan dgn Ab gumpalan (lattice)

Aglutinasi lebih mudah terjadi pada IgM o/k pentamer dibanding IgA dan IgG

+Tahap I

Ag Ab K.I

Aglutinasi

Tahap II

Contoh-contoh pemeriksaan aglutinasi

1. Aglutinasi direk

2. Aglutinasi indirek (pasif)

3. Aglutinasi pasif terbalik

4. Hambatan aglutinasi

3. Fiksasi komplemen Tahap :

1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag – Ab

2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin oleh komplemen

Interpretasi :

tidak hemolisis

hemolisis Contoh : Deteksi tripanosoma,

virus

+

_

Tes Fiksasi Komplemen

+

+c

Ag

Ab

++

+c

Ag

+

++

Fiksasi komplemen

Eritrosit

Sistem hemolitik

Hemolisin tidak hemolisis

?

Hemolisin

hemolisis

C - Komplemen

Eritrosit

Imunoassai yang menggunakan indikator utk melacak Ag atau Ab dengan konsentrasi rendah

Mampu melacak interaksi primer Ag-Ab (initial binding)

Sensitifitas analitik lebih tinggi dibanding imunoassai non label

Label yg digunakan : isotop : I125, H3, C14

non isotop : enzim (ALP, HRP), floresen (fluorescein, rhodamine), kemiluminesen

Selain uji kuantitatif, dpt digunakan pada uji kualitatif (ANA tes, antitiroid Ab)

Imunoasai berlabel

Imunoassai Berlabel

Imunoassai berlabel homogenSinyal kadar analit diperoleh langsung dari reaksi ikatan label dgn analitTidak memerlukan separasi Ag terikat dan Ag bebas (B/F)

Imunoassai berlabel heterogenSinyal kadar analit diperoleh secara tdk langsungMemerlukan seperasi B/FLebih sensitif dibandingkan imunoassai homogen

Imunoasai kompetitif●Ab label dan analit direaksikan

sekaligus terhadap Ag

Imunoasai non kompetitif●Ag analit yg diukur terikat antara

Ab phase solid & label Ab●Lebih sensitif dibandingkan

metode kompetitif

Imunoasai Berlabel

1. Radioimunoassai

(RIA/IRMA)

2. Imunofloresen (IF)

3. Enzyme Imunoassay

(EIA/ELISA)

4. Imunokromatografi (ICT)

1. Radioimunoasai

● Immunoassay berlabel radioisotop membedakan Ag yang terikat Ab dengan Ag bebas.

●Sensitif & spesifik untuk ttk kadar bahan yang amat rendah dalam serum

●Yang diukur : - γ-ray → I125

- β particle → H3

Radiolabel pada imunoassai dibagi 2 kelompok:

a.Radioimmunoassay (RIA): radiolabelisasi pada Ag

b.Immunoradiometric Assay (IRMA): radiolabelisasi pada Ab

●Kerugian: Bahaya efek radiasi bahan

radioaktif Waktu paruh reagen singkat, γ dan

β counter mahal

●Keuntungan: Presisi baik and high sensitivity Isotope conjugation lebih mudah Signal detection tanpa optimalisasi Lebih stabil terhadap interferensi

environment (pH, suhu)

Prinsip dasar RIA

+

E

E+E

E

E

E EE

Radiaton counter

cuciAb pd

fase padat

Ag berlabel

Ag

2. Imunofloresen assay (IFA)

Merupakan teknik untuk deteksi Ag/Ab pada cairan tubuh atau jaringan/sel

Prinsip : Molekul yg mampu menyerap energi radiasi dan memancarkannya kembali dlm btk cahaya (floresensi)

Memerlukan alat fluorometer/mikroskop

Menggunakan label: • Fluorescein → warna hijau• Rhodamin → warna merah

Imunofloresen assay

Enzyme immunoassay

Immunoassay dengan menggunakan label enzim

Relatif murah, banyak tersedia, reagen bertahan lama, mudah diotomatisasi, peralatan yang relatif murah

Enzim yang digunakan dipilih berdasakan jumlah molekul substrat yang dapat dirubah per satu molekul enzim, mudah dan cepat mendeteksi serta stabil.

Dibaca dengan alat :Spektrofotometer ( λ = 492 m) → microELISA reader

Fluorometer/Luminometer

Kerugian: Reaksi enzim lebih kompleks

dari pada label isotop Masih dipengaruhi faktor

environment (plasma constituents)

Keuntungan: Mudah dikerjakan Relatif murah, simultan dgn

pemeriksaan yg lain Bahaya radioaktif (-)

One-step sandwich EIA

Imunokromatografi

Imunokromatografi Lateral flow test Membacanya cukup dgn mata

saja Tidak membutuhkan substrat Penggunaan colloidal gold

waktu inkubasi pendek (<15 menit)

Kerugian : Nitrocelulose membrane tdk

stabil pada suhu ↑

Keuntungan : Prosedur cepat (<15 menit)

dan praktis Nilai diagnostik baik Stabil untuk jangka panjang Relatif tidak mahal

Prinsip dasar ICT

A. Melacak Analit (Ag)a. Reaksi langsung (Double Antibody

Sandwich)/Asai Imunometrik untuk melacak analit yang besar dan memiliki > 1 epitop (LH,hCG dan HIV)

b. Reaksi kompetitif/Hambatan kompetitif (competitive Inhibition) untuk melacak molekul kecil dengan epitop tunggal

B. Melacak Ab Indirect Assay