PEMBERIAN EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) PADA

KULTUR IN VITRO SEL TULANG TIKUS (Rattus norvegicus)

FITRI SUSANA

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemberian Ekstrak

Jintan Hitam (Nigella sativa) pada Kultur In Vitro Sel Tulang Tikus (Rattus

norvegicus) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan

belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014

Fitri Susana

NIM B04100030

ABSTRAK

FITRI SUSANA. Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) pada Kultur In

Vitro Sel Tulang Tikus (Rattus norvegicus). Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO

dan WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak Nigella

sativa terhadap proliferasi dan diferensiasi sel tulang tikus yang ditumbuhkan

secara kultur in vitro. Kultur dilakukan pada sel tulang tikus berumur lima hari

dalam dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM). Penelitian terdiri atas tiga

perlakuan yakni kontrol (mDMEM), dan dua konsentrasi NS: mDMEM + NS

0.05% dan mDMEM + NS 0.5%. Parameter yang diamati adalah konsentrasi sel,

persentase sel, dan diameter osteoblas serta osteosit. Komposisi osteoblas dan

osteosit ditentukan berdasarkan pengamatan morfologi dengan menggunakan

mikroskop setelah diwarnai dengan Alizarin red. Data dianalisis menggunakan

analisis varians dan uji Duncan. Hasil penelitian ini menunjukkan pemberian

ekstrak Nigella sativa pada konsentrasi 0.05% dan 0.5% menurunkan nilai

population doubling time (PDT) secara signifikan (p<0.05) dibandingkan kontrol.

Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Nigella sativa dapat meningkatkan proliferasi

sel tulang. Diferensiasi dapat dilihat dengan adanya peningkatan diameter

osteoblas (p<0.05), meskipun persentase osteoblas dan osteosit tidak berbeda

secara nyata (p>0.05) antar kelompok perlakuan. Meskipun demikian, nilai

persentase dan diameter osteoblas dan osteosit pada konsentrasi NS 0.05% dan

0.5% menunjukkan peningkatan dibandingkan kontrol. Pemberian ekstrak Nigella

sativa dalam medium kultur dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi sel

tulang.

Kata kunci: diferensiasi, Nigella sativa, osteoporosis, proliferasi, sel tulang

ABSTRACT

FITRI SUSANA. Enrichment of Black Seed (Nigella sativa) Extract in In Vitro

Culture of Rat (Rattus norvegicus) Bone Cells. Supervised by ARIEF

BOEDIONO and WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS

The aims of this study are to examine the proliferation and differentiation of

rat bone cells after in vitro culture in medium supplemented by Nigella sativa

extract. The cultures has been conducted of five days old rat (Rattus norvegicus)

bone cells in dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM). The experiment was

set in three groups of treatment, consisted of control (mDMEM), and two

concentrations of Nigella sativa (NS) extracts: mDMEM + NS 0.05% and

mDMEM + NS 0.5 %. The parameters observed were cells concentration,

percentage, and diameter of osteoblasts and osteocytes. Osteoblast and osteocyte

were determined based on morphology after Alizarin red staining. Data were

analyzed using statistical ANOVA and Duncan test. The results showed that

Nigella sativa extract at concentration of 0.05% and 0.5% increased the bone cells

proliferation (p<0.05). Differentiation could be seen with an increase in the

diameter of osteoblasts (p<0.05), although the percentage of osteoblasts and

osteocytes were not significantly different (p>0.05) between treatment groups.

Nevertheless, the percentage value and the diameter of osteocytes at concentration

of NS 0.05 % and NS 0.5 % showed an increase compared to the control. In

conclusion, addition of Nigella sativa extract in the culture medium could increase

the osteoblasts and ostocytes proliferation also differentiation rate of bone cells.

Keywords: bone cells, differentiation, Nigella sativa, osteoporosis, proliferation

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

pada

Fakultas Kedokteran Hewan

PEMBERIAN EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) PADA

KULTUR IN VITRO SEL TULANG TIKUS (Rattus norvegicus)

FITRI SUSANA

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul skripsi : Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) pada Kultur In

Vitro Sel Tulang Tikus (Rattus norvegicus)

Nama : Fitri Susana

NIM : B04100030

Disetujui oleh

Prof Drh Arief Boediono, PhD PAVet(K)

Pembimbing I

Drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, MSi PAVet

Pembimbing II

Diketahui oleh

Drh Agus Setiyono, MS PhD APVet

Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2014 ini ialah kultur in

vitro, dengan judul Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) pada Kultur In

Vitro Sel Tulang Tikus (Rattus norvegicus).

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Drh Arief Budiono, PhD

PAVet(K) dan Ibu Drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, MSi PAVet selaku

pembimbing, serta Ibu Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet(K) (Alm.) dan Bapak Drh

Kusdiantoro Mohamad, MSi PAVet yang telah banyak memberikan saran. Di

samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Mas Wahyu selaku staf

Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Penulis juga

mengucapkan terimakasih kepada Mbak Devi, Mbak Ria, dan teman-teman peneliti

di Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB: Deni, Fatimah, Ijah,

Juju, Mas Boy, Putri atas bantuan dan kerjasama selama penelitian ini berlangsung.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayahanda, ibunda, alak, cikwo,

ayuk, adek, empat bidadari kecil, dan keluarga besar atas doa, dukungan, dan

kepercayaannya. Tak lupa ucapan terimakasih kepada sahabat-sahabat tercinta:

Susan, Etri, Nindi, Riena; keluarga SQ, keluarga SUIJI, Acromion, alumni SMAN1

Muaradua, yayasan KSE, serta seluruh teman-teman atas segala doa dan

dukungannya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2014

Fitri Susana

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL x

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN x

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 1

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

TINJAUAN PUSTAKA

Tulang 2

Perkembangan Tulang 2

Jintan Hitam (Nigella sativa) 3

Kultur In Vitro 4

METODE

Waktu dan Tempat 5

Bahan 5

Alat 5

Tahapan dan Prosedur Kerja 5

Evaluasi Hasil Kultur Sel Tulang 6

Rancangan Percobaan dan Analisis Data 7

HASIL DAN PEMBAHASAN 7

SIMPULAN DAN UCAPAN TERIMAKASIH

Simpulan 12

Ucapan Terimakasih 12

DAFTAR PUSTAKA 12

RIWAYAT HIDUP 15

DAFTAR TABEL

1 Komposisi biji jintan hitam 4 2 Population Doubling Time (PDT) sel tulang yang tumbuh dalam

kultur yang diberi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) 8 3 Persentase osteoblas dan osteosit yang tumbuh dalam kultur yang

diberi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) 10 4 Diameter osteoblas dan osteosit yang tumbuh dalam kultur yang

diberi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) 11

DAFTAR GAMBAR

1 Morfologi osteoblas dan osteosit yang telah diwarnai Alizarin red 9

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tulang merupakan jaringan ikat khusus yang berfungsi sebagai alat

penyokong, perlekatan, perlindungan, dan penyimpanan mineral. Jaringan ini

dilengkapi dengan rigiditas atau kekakuan, kekuatan yang sangat besar, serta

elastisitas yang terbatas. Tulang terdiri atas material interseluler terkalsifikasi,

matriks tulang, dan tiga tipe sel yaitu osteosit yang dapat ditemukan di ruang

(lakuna) diantara matriks, osteoblas yang merupakan tempat sintesis komponen

organik dari matriks, serta osteoklas yang merupakan sel raksasa multinuklear

yang terlibat dalam proses reabsorpsi dan pembentukan jaringan tulang (Junqueira

dan Carneiro 2005).

Berbagai kelainan dapat terjadi pada tulang, antara lain osteoporosis,

osteomalasia, dan riketsia. Osteoporosis adalah penyakit tulang sistemik yang

ditandai dengan kepadatan tulang yang rendah dan kerusakan jaringan tulang pada

struktur mikro tulang yang menyebabkan terjadinya kerapuhan pada tulang (WHO

2003). Osteoporosis umumnya terjadi pada individu dewasa, terutama pada wanita

pascamenopause. Osteomalasia dan riketsia terjadi akibat defisiensi kalsium per

unit dari matriks tulang sehingga kalsifikasi tulang terganggu. Riketsia terjadi

pada individu muda, sedangkan osteomalasia terjadi pada individu dewasa (Ott

2002).

Kepadatan tulang sangat ditentukan oleh keutuhan mikroarsitektur tulang

sebagai hasil keseimbangan antara proses remodeling tulang (proses pembentukan

tulang) dan reabsorpsi tulang. Kepadatan tulang yang didapat selama masa

pertumbuhan merupakan faktor yang menentukan terjadinya kasus osteoporosis di

kemudian hari. Individu dengan kepadatan tulang yang tinggi pada masa

pertumbuhan sampai masa pramenopause akan terhindar dari osteoporosis pada

masa pascamenopause (Compston et al. 1993).

Parhizkar et al. (2011) menyatakan bahwa jintan hitam (Nigella sativa)

memiliki aktivitas estrogenik yang mampu membantu menanggulangi tanda-tanda

menopause sehingga dapat digunakan sebagai terapi alternatif pengganti hormon.

Pencegahan osteoporosis dengan mengonsumsi Nigella sativa diharapkan mampu

menginduksi proliferasi dan diferensiasi sel tulang, serta meningkatkan aktivitas

estrogenik sehingga kepadatan tulang akan meningkat dan kejadian osteoporosis

dapat dihindari.

Perumusan Masalah

Jintan hitam (Nigella sativa) atau dikenal luas dengan nama habatussauda

telah banyak dikonsumsi masyarakat karena dipercaya memiliki berbagai khasiat.

Sebagian masyarakat percaya bahwa jintan hitam adalah obat dari semua jenis

penyakit dan baik dikonsumsi pada masa pertumbuhan. Efek pemberian jintan

hitam pada sel tulang tikus muda (prapubertas) secara in vitro belum diketahui

sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui efek ekstrak jintan hitam

terhadap proliferasi dan diferensiasi sel tulang tikus secara in vitro.

2

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak Nigella

sativa terhadap proliferasi dan diferensiasi sel tulang tikus secara in vitro pada

beberapa konsentrasi ekstrak Nigella sativa 0.05% dan 0.5%.

Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi kemampuan

sel tulang tikus mengalami proliferasi dan diferensiasi dalam medium dengan dan

tanpa penambahan ekstrak Nigella sativa yang diharapkan dapat berguna untuk

mengatasi gangguan pada tulang.

TINJAUAN PUSTAKA

Tulang

Tulang merupakan bagian tubuh yang memiliki fungsi utama sebagai

pembentuk rangka dan alat gerak tubuh, pelindung organ-organ internal, serta

tempat penyimpanan mineral (kalsium-fosfat). Proses pembentukan tulang disebut

dengan osifikasi. Proses osifikasi terjadi pada masa perkembangan fetus (prenatal)

dan setelah individu lahir (postnatal). Pada tulang panjang perkembangan terjadi

sampai individu mencapai dewasa (Djuwita et al. 2012).

Secara makroskopis tulang tersusun atas beberapa bagian, yakni diafise,

epifise, metafise, tulang rawan artikular, periosteum, ruang medular, dan osteum.

Secara mikroskopis tulang terbentuk atas tiga jenis sel tulang, matriks

ekstraselular tulang, dan saluran-saluran yang tersusun secara sempurna dan

kompak (Djuwita et al. 2012). Tiga jenis sel utama penyusun tulang yaitu

osteoblas, osteosit, dan osteoklas. Osteoblas berasal dari sel pluripoten mesenkim

dan menyimpan osteoid, yakni matriks organik yang tidak termineralisasi pada

tulang. Osteoblas berfungsi untuk menginisiasi dan mengontrol proses

mineralisasi osteoid (Kierszenbaum 2002). Ketika aktivitas sintesis matriks

berhenti dan osteoblas telah memasuki matriks tersebut maka osteoblas berubah

nama menjadi osteosit.

Beberapa osteoblas akan dikelilingi matriks dan menjadi osteosit. Osteosit

berada di dalam lakuna dan hanya satu osteosit yang dijumpai dalam dalam satu

lakuna. Proses metabolisme sitoplasma dalam matriks tulang dibantu melalui

pejuluran kanalikuli yang berbentuk silindris dan kecil (Junqueira dan Carneiro

2005).

Perkembangan Tulang (Osteogenesis)

Proses pembentukan tulang disebut osteogenesis atau osifikasi. Osifikasi

(osteogenesis) berdasarkan asal embriologisnya terdapat dua jenis, yaitu osifikasi

intramembran yang terjadi pada sel mesenkim yang berdiferensiasi menjadi

3

osteoblas di pusat osifikasi secara langsung, tanpa pembentukan kartilago terlebih

dahulu, dan osifikasi endokondral yaitu mineralisasi jaringan tulang yang

dibentuk melalui pembentukan kartilago terlebih dahulu (Leeson et al. 1996;

Junqueira dan Carneiro 2005).

Osifikasi intramembran merupakan proses perkembangan tulang yang

terjadi secara langsung. Selama osifikasi intramembran, sel mesenkim

berproliferasi ke dalam area yang memiliki vaskularisasi yang tinggi pada

jaringan penghubung embrionik dalam pembentukan kondensasi sel atau pusat

osifikasi primer (Leeson et al. 1996; Junqueira dan Carneiro 2005). Sel ini akan

mensintesis matriks tulang pada bagian periperal dan sel mesenkimal berlanjut

untuk berdiferensiasi menjadi osteoblas. Setelah itu, tulang akan dibentuk kembali

dan semakin digantikan oleh tulang lamela matang atau dewasa. Proses osifikasi

ini merupakan sumber pembentukan tulang pipih, salah satu diantaranya yaitu

tulang pipih kepala. Pada awal perkembangan tulang pipih atap kepala, tulang

yang baru dibentuk diendapkan pada pinggir dan permukaan tulang tersebut.

Semua tulang di dalam tubuh selain tulang pipih, dibentuk melalui proses

osifikasi endokondral. Proses ini terjadi secara tidak langsung yaitu melalui

pembentukan model tulang rawan terlebih dahulu dan kemudian mengalami

penggantian menjadi tulang dewasa. Pada proses pertumbuhan tulang panjang

akan terbentuk pusat osifikasi primer dimana penulangan pertama kali terjadi

yaitu proses dimana kartilago memanjang dan meluas melalui proliferasi

kondrosit dan deposisi matriks kartilago. Setelah pembentukan tersebut, kondrosit

di daerah sentral kartilago mengalami proses pemasakan menuju hipertropik

kondrosit (Leeson et al. 1996; Junqueira dan Carneiro 2005). Setelah pusat

osifikasi primer terbentuk maka rongga sumsum mulai meluas ke arah epifise.

Perluasan rongga sumsum menuju ke ujung-ujung epifisis tulang rawan dan

kondrosit tersusun dalam kolom-kolom memanjang pada tulang dan tahapan

berikutnya pada osifikasi endokondral berlangsung pada zona-zona pada tulang

secara berurutan (Leeson et al. 1996; Junqueira dan Carneiro 2005).

Jintan Hitam (Nigella sativa)

Tanaman Nigella sativa merupakan salah satu spesies dari genus Nigella

yang memiliki kurang lebih 14 spesies tanaman yang termasuk dalam famili

Ranunculaceae. Tanaman ini berasal dari Eropa Selatan, Afrika Utara, dan Asia

Selatan. Kandungan kimia jintan hitam antara lain: thymoquine,

thymohydroquinone, dithymoquinone, thymol, carvacrol, nigellicine, nigellidine,

nigellimine-N-oxide dan α-hedrin (Al-Jabre et al. 2003). Sedangkan menurut

Suryo (2010) kandungan biji jintan hitam antara lain: minyak atsiri, minyak lemak,

saponin, polifenol, nigelin (zat pahit), nigellone, dan thymoquinone. Kandungan

tokoferol dan polifenol dalam biji jintan hitam menunjukkan adanya senyawa

fenolik yang merupakan faktor utama yang berkhasiat sebagai obat dan zat

pembentuk rasa. Kandungan tokoferol dan polifenol dari minyak biji jintan hitam

tersaji pada Tabel 1.

4

Tabel 1 Kandungan tokoferol dan polifenol dari minyak biji jintan hitam Komposisi Jumlah (μg/gr)

Total tokoferol 340 ± 8,66

α-tokoferol 40 ± 10,00

β-tokoferol 50 ± 15,00

γ-tokoferol

Total polifenol

250 ± 13,00

1744 ± 10,60

Sumber : Nergiz dan Ötles (1993)

Berbagai manfaat dapat dirasakan dengan mengkonsumsi jintan hitam,

antara lain jintan hitam mampu menstimulasi sumsum tulang dan sel imun,

mampu melindungi sel normal dari kerusakan oleh agen penyakit, serta

peningkatan total jumlah sel darah dan diferensiasinya (Meral et al. 2004). Fungsi

lain dari Nigella sativa adalah dapat meningkatkan kesehatan tubuh, menyediakan

energi dengan cepat, meningkatkan metabolisme, melancarkan pencernaan,

memperlancar peredaran darah, menurunkan tekanan darah, menurunkan tingkat

gula darah, menstimulasi periode menstruasi, meningkatkan jumlah sperma,

antihelmintik, meredakan bronchitis dan batuk, menurunkan demam, iritasi kulit,

serta dapat meningkatkan pengeluaran susu ibu (Agrawala et al. 1971).

Jintan hitam diketahui memiliki berbagai macam khasiat antara lain anti

bakteri, anti jamur, anti kanker, antioksidan, antiparasit, analgesik, anti koagulan,

dan juga agen hipoglikemik (Salama dan Raaga 2010). Aktivitas antimikroba

jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan

longifolene. Dalam sebuah penelitian disebutkan bahwa thymoquinone dan

longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengan nilai IC50

1.8μM (0.3μg/ml) dan 3.0 μM (0.6 μg/ml) (Bourgou et al. 2010). Thymoquinone

juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomycin dan gentamycin.

Kultur In Vitro

Kultur sel didefinisikan sebagai teknik untuk menumbuhkan dan

memelihara sel-sel dari organisme multisel di luar tubuh dengan menggunakan

wadah khusus yang ditempatkan pada kondisi lingkungan menyerupai kondisi

tubuh, seperti temperatur, kelembaban, nutrisi, dan kondisi bebas kontaminasi.

Menurut Butler (2004) riset kultur sel asal hewan memiliki beberapa tujuan,

antara lain: mengetahui fisiologi normal atau proses biokimia yang terjadi di

dalam sel, misalnya metabolisme sel, menguji pengaruh senyawa kimiawi ataupun

obat pada tipe sel yang spesifik, misalnya senyawa metabolit, hormon, senyawa

toksik, senyawa mutagenik, dan lain-lain. Kultur sel juga berfungsi untuk

mempelajari kombinasi variasi tipe sel sehingga menghasilkan jaringan buatan,

seperti menghasilkan jaringan buatan serta mensintesis produk biologis bernilai

pada kultur sel skala besar.

Menurut Halim et al. (2010) untuk keberhasilan suatu kultur in vitro, maka

komponen-komponen utama perlu diperhatikan, antara lain medium, serum,

antibiotik, dan faktor pertumbuhan. Medium berperan penting untuk menciptakan

suatu kondisi lingkungan yang memiliki pH, tekanan osmotik, dan faktor

pendukung lainnya yang dapat membantu pertumbuhan sel untuk tumbuh dan

berkembang. Serum berperan penting sebagai sumber nutrisi sel untuk tumbuh

5

dan berkembang. Antibiotik dan anti jamur diperlukan untuk menghindari

kontaminasi mikroorganisme yang dapat mengganggu pertumbuhan dan mampu

bersifat patogen jika diperuntukkan untuk terapi. Faktor pertumbuhan dapat

ditambahkan untuk menginduksi pertumbuhan, mempertahankan pluripotensi,

atau merangsang terjadinya diferensiasi, maka.

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan bulan Juli

2014 di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi Histologi dan Embriologi,

Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,

Institut Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain anak tikus (Rattus norvegicus)

strain Sprague Dawley (SD) umur lima hari. Serbuk jintan hitam (kapsul Kurma

Ajwa®

100% jintan hitam), medium kultur DMEM yang dimodifikasi dengan

penambahan asam amino non-esensial (NEAA Sigma, USA), new born calf

serum (NBCS Sigma, USA), NaHCO3 (Sigma, USA), insulin transferring

selenium (ITS Sigma, USA), pewarna Alizarin red, alkohol 70%, Dubelcco

Phosphate Buffered Saline (DPBS Sigma, USA), preparat ketamin serta xylazin,

dan gentamycin.

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting bedah, pinset,

mortar beserta penggerus, timbangan digital, micropipet, incubator, laminar air

flow (clean bench), mikroskop manipulator Olympus Ix70-S8F2 yang dilengkapi

dengan kamera tuscen 3.0 MP, cawan petri, gelas obyek, gelas penutup,

mikrofilter 0.22 µm, spoit 1 mL dan 10 mL, gelas ukur, gelas piala, improved

haemositometer Neubaeur, counter, centrifuge rotor fixed, hot plate, dan vortex.

Tahapan dan Prosedur Kerja

Persiapan Ekstrak jintan hitam (Nigella sativa)

Pembuatan ekstrak Nigella sativa dilakukan dengan cara menggerus serbuk

jintan hitam menggunakan mortar hingga halus, kemudian dimasukkan ke dalam

tabung kaca. Larutan jintan hitam dibuat dengan cara mendididihkan masing-

masing 0.01 g/mL dan 0.1 g/mL jintan hitam dalam aquabides dan dihomogenkan

menggunakan pipet. Setelah homogen, larutan difilter dengan menggunakan

membran filter berukuran 0.22 µm dan siap untuk digunakan.

6

Persiapan Cawan Petri

Cawan petri steril dilapisi gelatin 0.1% (Sigma, USA) sebanyak 1 mL

dengan menggunakan mikro pipet kemudian didiamkan selama satu jam. Setelah

satu jam gelatin dibuang kemudian cawan petri dibilas menggunakan dulbecco

phosphate saline buffered (DPBS) yang telah ditambahkan Gentamycin 50 µg/mL.

Cawan petri didiamkan selama 5 menit hingga kering. Medium kultur dulbecco

modified eagle medium (DMEM) yang ditambahkan NaHCO3 1%, non-essential

amino acids (NEAA) 1%, gentamycin 50 µg/mL, neonatal calf bovine serum 10%,

dan isulin transferrin selenium (ITS) yang mengandung 5 µg/mL insulin, 10

µg/mL transferin, 5 µg/mL selenium dimasukkan ke dalam cawan petri masing-

masing sebanyak 2 mL. Sebagai perlakuan ke dalam cawan petri 1 dan 2 masing-

masing ditambahkan esktrak Nigella sativa dengan konsentrasi 0.05% dan 0.5%

ke dalam medium masing-masing sebnyak 100 µL/2 mL medium.

Isolasi dan Kultur Sel Tulang

Tikus (Rattus norvegicus) umur lima hari dikorbankan dengan cara

dieuthanasi dengan preparat ketamin-xylazin kemudian didislokasi servikalis

(cervicalis dislocation). Sel tulang diisolasi dari tulang femur, tibia, dan fibula.

Sumsum tulang dibersihkan dengan cara diflushing. Tulang dicacah hingga halus

menggunakan blade dan disuspensi di dalam mPBS. Suspensi tulang

disentrifugasi dengan kecepatan 200 G selama 10 menit, sentrifugasi ini dilakukan

dengan mPBS sebanyak empat kali dan mDMEM sebanyak satu kali. Sebelum

dikultur, jumlah sel dihitung menggunakan hemositometer. Sel dengan

konsentrasi 1 x 104

sel/mL dalam 100 µL dimasukkan ke dalam cawan petri yang

telah berisi medium sebanyak 2 mL. Setiap kultur dilakukan rangkap dua, terdiri

dari cawan petri yang dialasi cover glass sebagai tempat perlekatan sel dan yang

tidak dialasi cover glass. Kultur diinkubasi di dalam inkubator CO2 5% pada suhu

37 °C. Medium mDMEM diganti setiap 2 hari sekali sebanyak 2 mL setiap

penggantian. Perlakuan diberikan dimulai sejak kultur hari ke-2, 4, dan 6.

Pewarnaan Osteosit dan Osteoblas

Identifikasi jumlah dan diameter sel-sel tulang yang dikultur dilakukan

secara pengamatan morfologi setelah sel diwarnai dengan pewarnaan Alizarin red

(Kiernan 1990). Setelah hari ketujuh, sel difiksasi dengan glutaraldehid 2.5%

selama 48 jam pada suhu 4 °C. Selanjutnya sel dicuci dengan mPBS pH 4.2 dan

diwarnai dengan larutan Alizarin red. Sel diinkubasi pada suhu 37 °C selama dua

jam lalu dicuci dengan PBS sebanyak dua kali, kemudian sel diamati dengan

mikroskop.

Evaluasi Hasil Kultur Sel Tulang

Evaluasi hasil kultur sel tulang dilakukan dengan mengukur population

doubling time (PDT) untuk mengetahui tingkat proliferasi serta menghitung

jumlah dan diameter osteoblas dan osteosit untuk mengidentifikasi tingkat

diferensiasi sel tulang.

7

Population Doubling Time (PDT)

Population doubling time (PDT) ditentukan dengan menghitung jumlah sel

pada saat sebelum dikultur dan setelah dikultur hari ketujuh. Penghitungan

dilakukan pada sel yang telah terdisosiasi dengan menggunakan improved

hemositometer Neubauer dengan rumus: Total sel = jumlah sel pada 5 kotak x

faktor pengenceran x 104.

Selanjutnya PDT dihitung dengan menggunakan rumus menurut Davis

(2011):

PDT= 1

(log jumlah sel akhir- log jumlah sel awal) x 3.32

Waktu (hari)

Pengukuran persentase Osteosit dan Osteoblas

Penghitungan persentase osteoblas dan osteosit dilakukan menggunakan

mikroskop dengan perbesaran 40 x 10. Penghitungan dilakukan terhadap 100 sel

osteoblas dan osteosit yang diamati dan dilakukan masing-masing sebanyak tiga

kali ulangan.

Pengukuran diameter Osteosit dan Osteoblas

Pengukuran diameter osteoblas dan osteosit dilakukan pada 10 osteoblas

dan 10 osteosit dari masing-masing perlakuan menggunakan mikroskop yang

dilengkapi dengan mikrometer eyepiece pada pembesaran 40 x 10. Masing-

masing penghitungan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Perlakuan terdiri atas kontrol negatif (mDMEM), dan dua konsentrasi jintan

hitam (Nigella sativa) yaitu 0.05% dan 0.5%. Masing-masing kelompok perlakuan

memiliki tiga kali ulangan. Parameter yang diamati yaitu tingkat proliferasi

population doubling time (PDT), persentase osteoblas dan osteosit, serta diameter

osteoblas dan osteosit. Data PDT, jumlah osteoblas dan osteosit, serta diameter

osteoblas dan osteosit dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan

dilanjutkan dengan uji Duncan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tingkat Proliferasi Sel Berdasarkan Population Doubling Time (PDT)

Nilai PDT pada kontrol adalah 2.54 ± 0.28 hari, sedangkan nilai PDT pada

pemberian ekstrak Nigella sativa 0.05% dan 0.5% masing-masing adalah 2.17 ±

0.05 hari dan 1.98 ± 0.11. Hasil PDT sel tulang yang diberi perlakuan ekstrak

Nigella sativa dapat dilihat pada Tabel 2.

8

Tabel 2 Population Doubling Time (PDT) sel tulang tikus yang dikultur dengan

dan tanpa penambahan ekstrak jintan hitam (Nigella sativa)

Ulangan

Population Doubling Time

Kontrol NS 0.05% NS 0.5%

1 2.21 2.21 2.11

2 2.27 2.11 1.89

3 2.27 2.21 1.95

Rata-rata 2.25 ± 0.28a

2.21 ± 0.05a,b

1.98 ± 0.11b

Ket: Ket: kontrol (dMEM); ekstrak Nigella sativa (NS): NS 0.05% (dMEM + NS 0.05%); NS

0.5% (dMEM + NS 0.5%). Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama

menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf uji 5% (uji Duncan).

Population Doubling Time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh

populasi sel untuk menjadi dua kali dari jumlah populasi sel awal (Pellegrini et al.

2008). Tingkat proliferasi ditunjukkan berdasarkan perbandingan jumlah sel awal

dan akhir. Semakin kecil nilai PDT, maka semakin cepat sel tersebut

berproliferasi. Pemberian ekstrak Nigella sativa pada kultur sel tulang dengan

konsentrasi 0.05% dan 0.5% mampu menurunkan nilai PDT jika dibandingkan

dengan kontrol (p<0.05). Nilai PDT yang semakin kecil menandakan pemberian

ekstrak dapat meningkatkan terjadinya proliferasi pada sel tulang yang dikultur

secara in vitro. Menurut Binderman et al. (1974) sel tulang memiliki nilai PDT

sekitar 2-4 hari. Nilai tersebut tidak berbeda dengan hasil yang diperoleh pada

penelitian ini.

Identifikasi Morfologi Osteoblas dan Osteosit

Morfologi osteoblas dan osteosit telah diamati dengan mikroskop dengan

pewarnaan Alizarin red. Pewarnaan ini mendeteksi deposit kalsium yang

dihasilkan oleh sel tulang sehingga sel tulang akan tampak berwarna merah

(Kiernan 1990). Osteoblas yang teramati tempak berbeda dengan osteosit, baik

ukuran maupun warnanya. Osteosit memiliki ukuran yang lebih kecil dan

berwarna lebih merah dibandingkan osteoblas. Gambar 1 menunjukkan morfologi

osteoblas dan osteosit yang telah diwarnai dengan Alizarin red.

9

Gambar 1 Morfologi osteoblas dan osteosit pada kultur sel tulang tikus yang

diwarnai dengan Alizarin red. (A) osteoblas, (B) osteoid osteosit, (C) osteosit muda, (D) osteosit tua

Tanda panah menunjukkan kanalikuli. Bar = 40 µm.

Osteoblas merupakan sel yang berbentuk kubus atau kolumnar dalam

keadaan aktif dan berbentuk pipih dalam keadaan tidak aktif (Einhorn 1996;

Kierszenbaum 2002). Osteoblas yang sedang aktif mensintesis matriks tulang

akan memiliki inti yang besar, aparatus golgi, dan retikulum endoplasma yang

banyak. Osteoblas mengeluarkan kolagen tipe I dan protein matriks lainnya.

Osteoid osteosit merupakan proses transisi dari osteoblas menjadi osteosit. Sel ini

bertanggungjawab dalam proses mineralisasi. Osteoid osteosit yang mengalami

mineralisasi selanjutnya berdiferensiasi menjadi osteosit dan mengalami

penurunan volume mencapai 70% (Palumbo 1986). Osteosit merupakan sel

dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar yang lebih

sedikit tetapi memiliki jumlah lisosom yang lebih banyak serta memiliki

penjuluran pada sitoplasma (Stevenson dan Marsh 1992). Osteosit yang semakin

tua mengalami penurunan jumlah retikulum endoplasma dan aparatus golgi

sehingga ukurannya semakin mengecil. Osteosit memiliki dendritik yang disebut

kanalikuli. Sejumlah kanalikuli dapat menghubungkan satu osteosit dengan

osteosit lainnya. Karakterisrik morfologi tesebut penting agar nutrisi dan sinyal

biokimia dapat masuk ke dalam osteosit.

10

Persentase Osteoblas dan Osteosit

Persentase osteoblas pada perlakuan NS 0.05% dan NS 0.5% berturut-turut

adalah 82.00% dan 79.67%. Persentase osteoblas yang diberi ekstrak Nigella

sativa lebih kecil dibandingkan persentase osteoblas pada kontrol yang memiliki

persentase sebesar 83.00%. Sebaliknya nilai persentase osteosit pada perlakuan

NS 0.05% dan NS 0.5% lebih kecil deibandingkan dengan kontrol, dimana nilai

persentase osteosit pada perlakuan NS 0.05% dan NS 0.5% berturut-turut adalah

18.00% dan 20.30%, sedangkan nilai persentase osteosit pada kontrol 17.00%.

Komposisi jumlah osteoblas dan osteosit dalam kultur selengkapnya dapat dilihat

pada Tabel 3.

Tabel 3 Persentase osteoblas dan osteosit pada kultur sel tulang tikus dengan dan

tanpa penambahan ekstrak Nigella sativa Ulangan Kontrol NS 0.05% NS 0.5%

Persentase

osteoblas

(%)

1 84.00 83.00 81.00

2 87.00 87.00 83.00

3 78.00 76.00 75.00

Rata-rata 83.00 ± 4.58a

82.00 ± 5.56 a 79.67 ± 4.16

a

Persentase

osteosit (%)

1 16.00 17.00 19.00

2 13.00 13.00 17.00

3 22.00 24.00 25.00

Rata-rata 17.00 ± 4.58 a 18.00 ± 5.56

a 20.30 ± 4.16

a

Ket: kontrol (dMEM); ekstrak Nigella sativa (NS): NS 0.05% (dMEM + NS 0.01 g/ml); NS 0.5%

(dMEM + 0.1 g/ml). Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama

tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).

Secara uji statistik persentase osteoblas dan osteosit tidak berbeda secara

nyata (p>0.05) antar kelompok perlakuan, namun dari tabel di atas dapat terlihat

bahwa terjadi penurunan persentase osteoblas pada kelompok perlakuan NS

0.05% dan NS 0.5%. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak Nigella

sativa menginduksi terjadinya proses diferensiasi osteoblas menjadi osteosit.

Osteosit merupakan sel akhir dari proses diferensiasi osteoblas dan bukan sel hasil

dari proliferasi osteoblas (Kogianni dan Noble 2007).

Jumlah dan diameter sel dapat menggambarkan terjadinya diferensiasi sel.

Diferensiasi sel terjadi apabila adanya interaksi berbagai sinyal sel (McGeady et

al. 2006). Banyak faktor yang dapat menimbulkan ekspresi dari sifat osteoblas

dan osteosit dalam kultur, antara lain medium kultur yang digunakan, waktu

kultur, dan adanya komponen yang dapat menyebabkan sel berproliferasi dan

berdiferensiasi. Komponen tersebut dapat berupa hormon maupun faktor

pertumbuhan.

Diameter Osteoblas dan Osteosit

Diameter osteoblas pada perlakuan NS 0.05% dan NS 0.5% berturut-turut

adalah 34 µm dan 35.63 µm. Sedangkan diameter osteosit pada perlakuan NS

0.05% dan NS 0.5% berturut-turut adalah 18.5 µm dan 18.93 µm. Diameter

osteoblas dan osteosit pada masing-masing perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4.

11

Tabel 4 Diameter osteoblas dan osteosit pada kultur sel tulang tikus dengan dan

tanpa penambahan ekstrak Nigella sativa Ulangan Kontrol NS 0.05% NS 0.5%

Diameter

osteoblas

(µm)

1 29.80 36.80 33.60

2 29.40 34.80 38.80

3 30.70 30.40 34.50

Rata-rata 29.96 ± 0.66 a 34 ± 3.77

a,b 35.63 ± 2.77

b

Diameter

osteosit

(µm)

1 17.40 19.60 18.00

2 18.40 18.20 20.20

3 16.50 17.90 18.60

Rata-rata 17.43 ± 0.95 a 18.5 ± 0.9

a 18.93 ± 1.13

a

Ket: kontrol (dMEM); ekstrak Nigella sativa (NS): NS 0.05% (dMEM + NS 0.05%); NS 0.5%

(dMEM + 0.5%). Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama

tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).

Osteoblas memiliki diameter antara 20-30 µm (Kierszenbaum 2002),

sedangkan osteosit memiliki ukuran sekitar 9-20 µm (Kogianni dan Noble 2007).

Rata-rata diameter osteoblas pada penelitian ini menunjukkan hasil yang berbeda

nyata antar kelompok perlakuan (p<0.05). Hal ini membuktikan bahwa ekstrak

Nigella sativa berpengaruh secara nyata terhadap diameter osteoblas. Diameter

osteosit tidak berbeda secara nyata (p>0.05) pada semua kelompok perlakuan,

yang artinya ekstrak Nigella sativa tidak berpengaruh secara nyata terhadap

diameter osteosit secara uji statistik, namun perlakuan NS 0.05% dan NS 0.5%

tetap menunjukkan peningkatan terhadap diameter osteosit. Hal ini membuktikan

bahwa pemberian ekstrak Nigella sativa menginduksi terjadinya proses

diferensiasi osteoblas menjadi osteosit yang disertai perubahan morfologi dan

penurunan ukuran sel sehingga diameter osteosit akan semakin mengecil.

Berdasarkan nilai PDT, persentase, dan diameter osteoblas dan osteosit,

diketahui bahwa pemberian ekstrak Nigella sativa dapat meningkatkan proliferasi

dan diferensiasi terhadap sel tulang tikus yang dikultur. Menurut Nergiz dan Ötles

(1993) minyak jintan hitam mengandung senyawa aktif dalam kadar tinggi

diantaranya karoten, β-karoten, tokoferol, asam lemak, dan sterol yang dapat

mempengaruhi aktivitas sel. Senyawa-senyawa tersebut mempengaruhi kompleks

estrogen dan reseptor beta (REβ) untuk selanjutnya berdifusi ke dalam inti sel dan

melekat pada DNA. Ikatan kompleks estrogen-reseptor dengan DNA menginduksi

sintesis dan ekspresi mRNA untuk mensintesis protein sehingga meningkatkan

aktivitas sel target yang digambarkan dengan terjadinya proliferasi sel (Ganong

2005). Kandungan kalsium yang tinggi pada Nigella sativa juga dapat digunakan

dalam pembentukan tulang sehingga kepadatan tulang akan meningkat. Tingginya

kadar kalsium dalam darah akan memicu kelenjar thyroid dalam penyimpanan

kalsium ke dalam tulang. Selain itu, dapat menekan kerja kelenjar parathyroid

dalam mengaktivasi kerja osteoklas dalam perombakan tulang.

Menurut Parhizkar et al. (2011) pemberian jintan hitam memiliki aktivitas

estrogenik yang mampu membantu menanggulangi tanda-tanda menopause

sehingga mampu digunakan sebagai terapi alternatif pengganti hormon. Jintan

hitam memiliki kandungan sterol yang merupakan salah satu zat yang bermanfaat

terhadap organ reproduksi wanita karena mampu meningkatkan sintesis dan

bioaktivitas hormon-hormon dalam tubuh termasuk hormon reproduksi (Junaedi

et al. 2011). Sterol terdiri dari sterol hewani (zoosterol) dan sterol nabati

12

(fitosterol). Stigmasterol dan β-sitosterol merupakan senyawa kandungan

fitosterol yang berasal dari jintan hitam. Menurut Montgomery et al. (1993),

senyawa-senyawa tersebut memiliki kemiripan struktur dengan kolesterol yang

merupakan prekursor pembentuk hormon reproduksi, salah satunya hormon

estrogen. Menurut penelitian Ohashi et al. (1991) reseptor estrogen terdapat pada

sel osteogenik dan berperan langsung terhadap proses osteogenesis. Dosis

estrogen yang tinggi akan meningkatkan proses osteogenesis melalui ikatan

dengan reseptor estrogen dan menstimulasi proliferasi sel.

SIMPULAN DAN UCAPAN TERIMAKASIH

Simpulan

Penambahan ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) pada kultur sel tulang

secara in vitro dapat meningkatkan proliferasi dan menginduksi terjadinya proses

diferensiasi osteoblas menjadi osteosit.

Ucapan Terimakasih

Penelitian ini merupakan bagian Hibah kompetensi a.n Dr Drh Ita Djuwita,

MPhil PAVet (K) yang dibiayai oleh Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan

no. 035/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2013 tanggal Mei 2013.

DAFTAR PUSTAKA

Agrawala IP, Achar MV, Tamankar BP. 1971. Galactogogue action of Nigella

sativa. Indian J Med Sci. 25:535-537.

Al-Jabre S, Al-Akloby OM, Al-Qurashi AR, Akhtar N, Al-Dossary A, Randhawa

MA. 2003. Thymoquinone, an active principle of Nigella sativa, inhibited

Aspergillus niger. Pakistan J Med Res. 42(3): 1-2.

Binderman I, Duksin D, Harell A, Katzir E, Sachs L. 1974. Formation of bone

tissue in culture from isolated bone cells. J Cell Biol. 61:427-439.

Bourgou S, A Pichette, B Marzouk, J Legault. 2010. Bioactivities of black cumin

essential oil and its main terpenes from Tunisia. S Afr J Bot. 76(2): 210-216.

Butler M. 2004. Animal Cell Culture and Technology. Cornwall (GB): Bios

Scientific Publishers.

Chan ME, Lu XL, Huo B, Baik AD, Chiang V, Guldberg RE, Lu HH, Guo XE.

2009. A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblas co-culture for

bone mechanobiology. J Cell Mol Bioengin. 2(3):405-415.

Compston JE, Garraham NJ, Croucher PI, Wright CDP, Yamaguchi K. 1993.

Quantitative analysis of trabecular bone structure. J Bone. 14:187-1992.

Davis, JM. 2011. Basic Techniques and Media, The Maintenance of Cell Lines

and Safety. Di dalam: John MD, editor. Animal Cell Culture Essential

Methods. England (GB): John Wiley and Sons Ltd.

13

Djuwita I, Pratiwi IA, Winarto A, Sabri M. 2012. Proliferasi dan diferensiasi sel

tulang tikus dalam medium kultur in vitro yang mengandung ekstrak batang

Cissus quadrangula Salisb. (sipatah-patah). J Med Vet. 6(2):75-80.

Einhorn. 1996. Cellular control of bone homeostasis. Di dalam: Mishell’s textbook

of infertility, Contraception and Reproductive Endrocinology. Ed ke- 4.

New York (US): Blackwell Science.

Ganong WF. 2005. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed ke- 22. Andrianto P

penerjemah. Jakarta (ID): EGC. Terjemahan dari: Rev Med Phys. hlm 486-

507.

Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T, Setiawan B.2010. Stem

Cell: Dasar Teori dan Aplikasi Klinis. Jakarta (ID): Erlangga.

Junaedi E, Yuliarti S, Suty S, Kuncari ES. 2011. Kedahsyatan Habbatussauda

Mengobati Berbagai Penyakit. Jakarta (ID): Agro Media Pustaka.

Junqueira LC, Carneiro J. 2005. Basic Histology: Text and Atlas. Ed ke- 11. Poule

(Br): McGraw-Hill.

Kiernan JA. 1990. Histological and Histo Methods Theory and Practice. England

(GB): Pergamon Pr.

Kierszenbaum AL. 2002. Histology and Cell Biology: An Introduction to

Pathology. St. Louis (US): Mosby, Inc. An Affiliate of Elsevier.

Kogianni G, Noble BS. 2007. The biology of osteocytes. J Med Group LLC. 5:81-

86.

Korzynska A, Zychowicz M. 2008. A method of estimation of cell doubling time

on basis of the cell culture monitoring data. JBBE. 4(28):75-82.

Leeson RC, Leeson TS, Paparo AA. 1996. Buku Ajar Histology. Ed. 7.

Tambajong et al. Editor. Jakarta (ID). Terjemahan dari: Textbook of

Histology.

McGeady TA, Quinn PJ, Fitzpatrick ES, Ryan MT. 2006. Veterinary Embryology.

England (GB): Blackwell Publishing.

Meral I, Donmer N, Baydas B, Belge F, Kanter M. 2004. Effect of Nigella sativa

L. on heart rate and some haematological values of alloxan-induced diabetic

rabbits. Scand J Lab Anim Sci. 11(31):49-53.

Montgomery R, Robert LG, Thomas WC, Arthur AS. 1993. Biokimia: Suatu

Pendekatan Berorientasi Kasus. Ismadi, penerjemah. Yogyakarta (ID):

UGM Pr. Terjemahan dari: Biochemistry A Case-Oriented Approach.

Nergiz C, Ötles S. 1993. Chemical composition of Nigella sativa seeds. J Food

Chem. (48):259-261.

Ohashi T, Kusuhara S, Ishida K. 1991. Estrogen target cells during the early stage

of medullary boe osteogenesis: immunohistochemical detection of estrogen

reseptors in osteogenic cells of estrogen-treated male japanese quail. Calcif

Tissue Int. 49:124-127.

Ott SM. 2002. Osteoporosis and bone physiology. J Am Med. 228:334-341.

Palumbo C. 1986. A three-dimensional unstructural study of osteoid-osteocytes in

tibia of chick embryos. Cell Tissue Research. 246(1):125-131.

Parhizkar S, Latiff LA, Rahman SA, Dollah MA, Parichehr H. 2011. Assessing

estrogenic activity of Nigella sativa in ovariectomized rats using vaginal

cornification assay. Afr J Pharm Pharmacol. 5(2):137-142.

14

Pellegrini MP, Pinto RCV, Castilho LDR. 2008. Animal Cell Technology: from

Biopharmaceuticals to Gene Therapy. Castilho LR, Moraes AM, Augusto

EFP, Butler M, editor. New York (US): Taylor and Francis Group.

Salama, Raaga H M. 2010. Clinical and therapeutic trials of Nigella sativa. Taf

Prev Med Bull. 9(5): 513-522.

Sugawara Y, Ando R, Kamioka H, Ishihara Y, Honjo T, Kawanabe N, Kurosaka

H, Yamamoto TT, Yamashiro T. 2011. The three-dimension morphometry

and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse

embryonic calvaria. Calcif Tissue Int. (88):416-424.doi:10.1007/s00223-

011-9471-7.

Suryo J. 2010. Herbal Penyembuh Gangguan Sistem Pernapasan. Yogyakarta

(ID): B First.

Stevenson JS, Marsh MS. 1992. An Atlas of Osteoporosis. New Jersey (US):

Parthenon Publishing Group.

[WHO] World Health Organization. 2003. Prevention and Management of

Osteoporosis. Geneva (CH): WHO.

15

RIWAYAT HIDUP

Fitri Susana lahir di Desa Sukarami, Kecamatan Buay Sandang Aji,

kabupaten OKU Selatan, Provinsi Sumatera Selatan. Penulis adalah anak keempat

dari lima bersaudara dari pasangan bapak Alian dan Ibu Cik Intan.

Jenjang pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis adalah SDN 1

Sukarami lulus pada tahun 2004. SMPN 1 Buay Sandang Aji lulus pada tahun

2007 dan SMAN1 Muaradua lulus pada tahun 2010. Penulis melanjutkan

pendidikannya dan diterima di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian

Bogor (IPB) melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI). Selama menjadi

mahasiswi, penulis aktif dalam kegiatan organisasi himpunan profesi hewan

kesayangan dan satwa akuatik eksotik (HKSA) divisi kuda, ikatan mahasiswa

kedokteran hewan Indonesia (IMAKAHI), six university initiative Japan-

Indonesia (SUIJI), dan TRASHSURE Foundation.

Penulis mendapat kesempatan mengikuti kegiatan service learning program

(SLP) di Jepang (2013) dan pelatihan global health true leaders (GHTL) di

Makassar (2014). Selain itu penulis juga berkesempatan mengikuti pemilihan

mahasiswa berprestasi tingkat Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan meraih posisi

keempat.