Pemastian Mutu Produk Steril

di Industri Farmasi

Marlia Singgih Wibowo, PhD.

School of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung

PENDAHULUAN

• USP General Chapters : berisi chapter-chapter tentang berbagai metode analisis (Tests dan Assays) yang resmi (Official tests and assays) dan informasi penting yang berkaitan dengan metode-metode analisis terkait

• Produk obat atau bahan baku, eksipien yang termasuk dalam cakupan Farmakope harus memenuhi persyaratan dalam farmakope

• Chapter/ bab dengan nomor diatas 1000 merupakan informasi yang tidak memuat standard ataupun spesifikasi

Bahan/Produk Steril

• Bahan baku obat, Bulk, (non-complex Active Drug Substances, Biotechnology-derived Drug Substances, dietary supplement Ingredients)

• Produk Obat, Vaksin(non-complex active drug, biotechnology-derived drug products, Blood-blood products, Gene and Cell Therapy products, Dietary supplement products)

• Compounding Sterile Preparations

• Bahan eksipien obat

• Alat (devices) , containers,

• Alat kesehatan (medical divices)

Jenis analisis yang utama untuk produk

steril (USP 30 Chart 10 page 25)

• Endotoxin Limits : <85> Bacterial Endotoxins

test

• Sterility Tests : <71> Sterility tests dan

<1208> Sterility testing-Validation of Isolator

Systems

• Aseptic processing : <1116> Microbiological

Evaluation of Clean Rooms and Other

Controlled Environments, <1208>, <1211>

Sterilization and Sterility Assurance of

Compendial Articles

• Filtration : <1211>

• Assembly : <1116>, <1207> Sterile product

Packaging-Integrity Evaluation

– BFS : <1116>

– FFS : <1116>

– SFS : <1116>

– Others : <1072> Desinfectans and Antiseptics,

<1112> Application of Water Activity

Determination to Non-sterile Pharmaceutical

Products, <1116>, <1117> Microbiological Best

Laboratory Practices

– <1223> Validation of Alternative Microbiological

Methods

Preparasi sediaan steril di RS atau

health centre lain

• Mulai 1 Januari 2004 USP menetapkan bab <797>Pharmaceutical Compounding: Sterile Preparations

• Di published pertama kali pada USP 27 dan NF 22 tahun 2004 sampai saat ini

• Bab <797> berisi tentang prosedur, persyaratan dan penetapan standar2 yang dapat diterapkan pada seluruh aktivitas pembuatan produk steril

Penetapan tingkat risiko(Risk-level Determination)

pada pembuatan produk steril

• Low-risk

• Medium Risk

• High Risk

Pemastian Mutu produk steril

• Bahan baku, intermediate, produk akhir

• Production process : teknik aseptik, sterilisasi akhir

• Equipments

• Quality Control

• Environment : monitoring, validasi

• Personnel : skill, training

• Documentation : kelengkapan, arsip

• Sales : monitoring, evaluasi

QA Program

• Monitoring

• Evaluating

• Correcting

• Improving

• Maintaining

Fokus pembahasan

• Uji Sterilitas

• Uji Endotoksin

UJI STERILITAS

Pembuatan produk farmasi steril

Tujuan uji sterilitas:

Untuk menetapkan apakah bahan

farmakope yang harus steril memenuhi

syarat berkenaan dengan uji sterilitas

seperti yang tertera pada masing-masing

monografi

Suatu produk dikatakan STERIL

• Bila memenuhi persyaratan dalam uji

sterilitas

• Kemungkinan hasil positif dapat terjadi

karena teknik yang salah atau kontaminasi

lingkungan pada waktu pengujian.

Mikroba yang Digunakan:

(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633)

(2) Candida albicans (ATCC No. 10321)

(3) Bacteroides vulgatus (ATCC No. 8482)

• Jika terdapat kontaminasi mikroba dengan

menggunakan prosedur farmakope, maka

ditentukan bahwa bahan tersebut tidak

memenuhi syarat.

• Jika terdapat kegagalan menunjukkan adanya

kontaminasi mikroba dengan menggunakan

prosedur dalam farmakope, maka ditentukan

bahwa bahan tersebut memenuhi syarat.

Ketentuan hasil:

Media yang digunakan :

Media yang digunakan mempunyai sifat merangsang pertumbuhan bagi mikroba yaitu:

• Fluid Thioglycolate Medium (FTM) dan / atau Alternative Thioglycolate Medium (ATM)

• Soybean-Casein Digest Medium (SCDM)

Cairan Pengencer dan pembilas :

Cairan A

Cairan D = Cairan A + 1mL polisorbat 80/L

Cairan K

Cairan A

• 1 gram jaringan hewan yg telah diuraikan oleh

enzim pepsin, dilarutkan dlm air smp 1 liter,

saring atau sentrifuga, pH diatur 7,1

• Jika akan digunakan untuk uji sediaan yang

mengandung senyawa gol.penisilin/sefalosporin

(beta laktam), maka media tsb harus

ditambahkan enzim penisilinase utk proses

inaktivasi

Cairan D

• Adalah 1 L Cairan A + 1 mL Tween 80

• Digunakan bila sediaan mengandung

lesitin, atau minyak

• Atau utk uji peralatan steril dengan

menggunakan penyaring membran

Cairan K

• Cairan yang mengandung Jaringan hewan

yg telah diuraikan oleh enzim lambung

(peptic digest), beef extract, dan Tween 80

• Semua cairan pembilas harus disterilkan

dengan otoklaf

Penambahan penisilinase

• Untuk sediaan mengandung pengawet antimikroba golongan penisilin

• Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menggunakan sediaan penisilinase yang sebelumnya telah diuji daya penginaktif penisilin atau sefalosporin atau tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menambahkannya ke dalam tabung FTM dan sejumlah antibiotik dalam spesimen uji1. Inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 : 1000)

biakan 18 jam-24 jam Staphylococcus aureus (ATCC 29737) dalam FTM.

2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 30o – 35o

Uji Fertilitas

• Tujuan?

• Untuk memastikan bahwa media yang

digunakan dapat menumbuhkan mikroba

uji sampai waktu 7 hari

• Dilakukan sebelum uji sterilitas thp sampel

Uji Fertilitas

Media Mikroba Uji

Inkubasi

Suhu (oC) Kondisi

Fluid Tioglikolat

Medium

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

(2) Candida albicans (ATCC10321)

(3) Bacteroides vulgatus

(ATCC8482)

30 – 35

30 – 35

30 – 35

Aerobik

Tioglikolat

alternative

(1) Bacteroides vulgatus

(ATCC8482)

30 – 35 Anaerobik

Soybean – casein

digest

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

(2) Candida albicans (ATCC No.

10321)

20 – 25

20 – 25

Aerobik

METODE UJI STERILITAS

• INOKULASI LANGSUNG KE

DALAM MEDIA UJI

• TEKNIK PENYARINGAN

MEMBRAN

Hal yang perlu dilakukan sebelum

Prosedur Inokulasi langsung:

Uji Aktivitas Bakteriostatik dan Fungistatik

Jika pertumbuhan mikroba uji dalam campuran media bahan secara visual sebanding dengan pertumbuhan dalam tabung kontrol, gunakan jumlah bahan dan media seperti yang tertera pada Tabel jumlah untuk bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi

Penetapan perbandingan bahan dan media yang tidak merugikan pertumbuhan mikroba uji

Jumlah untuk bahan cair

Volume minimum tiap media

Jumlah wadah per

mediaIsi wadah (mL)

Volume minimum

diambil dari wadah

untuk tiap media

Digunakan untuk

inokulasi langsung ke

volume yang diambil

dari tiap wadah (mL)

Digunakan untuk

membrane atau setengah

bagian membrane yang

mewakili volume total dari

jumlah wadah yang sesuai

(mL)

Kurang dari 10 1mL, atau seluruh isi

jika kurang dari

1mL

15 100 20 (40 jika volume tiap

wadah tidak

cukup untuk

kedua media)

10 sampai kurang dari

50

5mL 40 100 20

50 sampai kurang dari

100

10mL 80 100 20

50 sampai kurang dari

100 dimaksudkan

untuk pemberian

intravena

Seluruh isi - 100 20

100 sampai 500 Seluruh isi - 100 10

Di atas 500 500mL - 100 10

Ketentuan Penambahan atau pengurangan dalam

menentukan perbandingan bahan dan media

• Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250mL media masih mempunyai daya bakteriostatik atau fungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperoleh jumlah maksimum yang tidak menghambat pertumbuhan uji dalam 250mL media.

• Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya kurang dari 1mL, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan dan mencegah hambatan pertumbuhan.

• Untuk bahan padat yang tidak segera larut atau dapat terdispersi, jika jumlahnya kurang dari 50mg, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan untuk mencegah hambatan pertumbuhan.

PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG

KE DALAM MEDIA UJI

Untuk:

• Cairan

• Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat

• Zat padat

• Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya

• Alat kesehatan steril

• Alat suntik kosong atau terisi steril

Bahan uji Bahan uji + media

Prinsip pengujian:

Inkubasi minimal 14 hari

dengan pengamatan pada

hari ke 3,4,atau 5, hari ke 7

atau 8, dan pada hari

terakhir pengujian.

Catatan:

Perlakuan awal berbeda untuk masing-masing produk farmasi dan kesehatan.

Bahan uji merupakan larutan yang pada produk farmasi dan kesehatan kecuali yang berbentuk cairan digunakan untuk membilas atau mendispersi produk tersebut.

Cairan

1. Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril.

2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media.

3. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan.

Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat

Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut:

1. Secara aseptik pindahkan 100mg dari tiap wadah dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100mL pembawa air steril yang dapat mendispersi homogen bahan uji dalam seluruh campuran cairan.

2. Campur 10mL alikot dari campuran cairan yang diperoleh dengan 80mL tiap media.

Perlakuan awal untuk berbagai sediaan

Zat padat Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau

yang sudah dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) tidak kurang dari 300mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari 300mg.

Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40mL FTM dan SCDM.

Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya

Dari setiap kemasan, ambil secara aseptik 2 bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500mg dari bagian paling dalam.

Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlah tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi.

Alat kesehatan steril Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan

keseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000mL media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai.

Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran

berlubang

1. seperti alat transfusi atau infus atau yang

ukurannya menyebabkan pencelupan tidak

dapat dilakukan dan hanya saluran cairannya

yang harus steril, Bilas lumen masing-masing

dengan sejumlah FTM dan SCDM hingga

diperoleh kembali tidak kurang dari 15mL

setiap media.

2. Inkubasi dengan tidak kurang dari 100mL

masing-masing media.

Prosedur untuk:

Alat suntik kosong atau terisi steril

• Uji dilakukan sama seperti uji untuk produk

steril dalam ampul atau vial.

• Cara inokulasi langsung dapat dilakukan jika

penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah

menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan

dalam kondisi pengujian.

UJI STERILITAS DENGAN

TEKNIK PENYARINGAN

MEMBRAN

Kegunaan uji sterilitas dengan teknik

penyaringan membran

• Berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat pertumbuhan.

• Berguna untuk bahan seperti minyak, salep atau krem yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan bakteriostatik atau bukan fungistatik.

• Berguna untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan.

Prosedur awal:

• Buat perbandingan yang sama menggunakan sejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer dan pembilas yang sesuai.

• Bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan pengencer dan pembilas.

Pertumbuhan mikroba uji dari membran yang digunakan untuk menyaring bahan diikuti cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi secara visual sebandingdengan pertumbuhan dari membran yang hanya digunakan untuk menyaring cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi.

UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN

MEMBRAN

Untuk:

• Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air

• Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah)

• Zat padat yang dapat disaring

• Salep dan minyak yang larut dalam Isopropil Miristat

• Zat padat yang tak dapat disaring

• Alat kesehatan

Peralatan: porositas 0,45µm, diameter ±47mm, kecepatan penyaringan 55mL-75mL/mnt pada tekanan 70cmHg.

Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

• Tahap I

Amati adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan / atau pertumbuhan pada permukaan pada isi semua wadah dalam interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi.

Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat.

• Tahap II

Jumlah spesimen yang diuji minimal 2 kali jumlah tahap I.

Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat.

Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji tidak memenuhi syarat.

UJI ENDOTOKSIN

Pendahuluan

Produk farmasi parenteral

Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian

langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah.

Salah satu tahap : Sterilisasi

Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN

Bagaimana produk parenteral

dapat terkontaminasi endotoksin?

• Pada proses sterilisasi produk parenteral

(menggunakan panas), bakteri gram negatif

yang mungkin ada dalam produk, akan mati dan

lisis terjadi, endotoksin akan terlepas dan tetap

tinggal di dalam produk

• Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)

Endotoksin dan Pirogen

• Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif

• Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena

• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin

• Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida (LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran luar bakteri gram negatif.

Struktur LPS

• Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari

bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat

pada suatu daerah inti yang mengandung

molekul KDO (2-keto-3-deoksioktonat)

Struktur LPS Salmonella

Mannose-Abequose

Rhamnose

Galactose

Glucose-N-acetylglucosamine

Galactose

Glucose-Galactose

Heptulose

Heptulose-P-P-Ethanolamine

KDO

KDO-KDO-P-Ethanolamine

P-GlcN-GlcN-P

n

Lipid A

Inti polisakarida

Rantai samping

Efek endotoksin bagi tubuh

• demam

• aktivasi sistem sitokin

• rusaknya sel-sel endotelial

• permeabilitas pembuluh darah berubah

sehingga menyebabkan turunnya tekanan

darah

• dll.

Perkembangan regulasi tentang

uji pirogen• Bacterial endotoxin test (BET) merupakan

salah satu uji yang penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan

• 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test)

• Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun kemudian

• 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus amoebocyte lysate (LAL) test

LAL-test

• The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri.

• LAL diperoleh dari ekstrak cair amebosit Horseshoes crab (Limulus polyphemusatau Tachypleus tridentatus)

• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)

Mengapa LAL test?

• Limulus amebocyte lysate (LAL) test

adalah metode alternatif terhadap rabbit

pyrogen test yang difokuskan pada deteksi

senyawa pirogen dalam produk, untuk

menghindari penggunaan hewan/binatang

dalam percobaan

• Metode lebih akurat

Limulus amebocyte lysate

• Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus

• Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.

• Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.

• Solum (1970, 1973) dan Young (1972),

melakukan pemurnian dan karaterisasi protein

yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan

menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin

merupakan reaksi enzimatik.

Reaksi pembentukan gel (clot) spontan

antara endotoksin (LPS) bakteri dan

protein dalam amebosit.

Limulus polyphemus

(horseshoe crab)

African Wolf Spider

Horseshoe crab

• Pembentukan gel padat pada titik akhir reaksi sebagai hasil reaksi antara LAL dan endotoksin.

• Reagen LAL + larutan uji dalam tabung reaksi dengan volume yang sama.

• Inkubasi 37°C±2°C selama 60 menit±1 menit.

• Reaksi (+) : gel stabil dan melekat pada dasar tabung bila dibalikkan 180º.

• Reaksi (-) : gel kental, terlepas dari dasar tabung bila dibalikkan 180º.

Alat

Tabung reaksi,

pipet ukur,

pengocok vorteks,

oven, inkubator.

Alat-alat gelas dibuat

bebas pirogen : oven

200ºC selama 4 jam.

• ekstrak amebosit

dalam kepiting

landam kuda,

Limulus

polyphemus

(Atlantic horseshoe

crab)

REAGEN LAL

• Tachypleus

Amebocyte Lysate

(TAL): ekstraksi

Amebocyte

Tachypleus

tridentatus

(Japanese

horseshoe crab

atau Chinese

horseshoe crab)

REAGEN TAL

Bahan :

• Reagen TAL 0,125 EU/ml ,

• Control Standar Endotoksin (CSE) 10 EU/ml,

• Reagent Water (RW),

• Sampel : Aqua pro injeksi.

Tahapan Sebelum Uji LAL terhadap

sampel

• Uji konfirmasi kepekaan lisat

• Optimasi kondisi percobaan

• Verifikasi atau Validasi metode (*sesuai

keperluan di Laboratorium uji)

• Uji terhadap sampel

• Untuk mengecek kepekaan/sensitivitas

reagen TAL, apakah sesuai dengan yang

tercantum pada label.

• Dibuat 4 seri pengenceran (2λ; λ; 0,5λ dan

0,25λ) dari CSE dalam 4 replikasi dan

kontrol negatif (RW)

• Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik

titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ .

Penyiapan Kontrol Negatif (LRW)

Penyiapan Sampel1. Sampel

2. Sampel Tercemar

Penyiapan Larutan CSE

Penyiapan Kontrol Positif (CSE)

Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit

Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE)

Penambahan Reagen LAL

CSE 10 EU/ml

(10/0,125 x λ =

80 λ)

8 λ =1 EU/ml

4 λ =0,5EU/ml

2λ =0,25

EU/ml

λ = 0,125 EU/ml

0,5 λ = 0,0625 EU/ml

0,25 λ =0,03125 EU/ml

1,0 ml RW 0,2ml

1,0ml 0,5ml

0,2ml 0,1ml 0,1ml

1,8 mlRW

1,0 mlRW

1,5 mlRW

1,4 mlRW

1,5 mlRW

3,1 mlRW

Batas kadar endotoksin

PMA = Kepekaan (λ)

0,25 EU/ml

0,125 EU/ml

= 2Jadi, sampel ini hanya dapat diencerkan

maksimal 1: 2

Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA=MVD)

• Optimasi kondisi dilakukan dengan

melakukan variasikan suhu dan atau

waktu inkubasi.

Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi

metode

Parameter

Performa

Analitik

Kualitatif (ID) Perhitungan

Kembali

Kategori I

Perhitungan Kembali

Kategori III

Perhitunga

n Kembali

Kategori IIIKuantitatif Batas Tes

Akurasi tidak ya ya * *

Presisi Tidak ya ya tidak ya

Spesifisitas ya ya ya ya *

Batas Deteksi ya tidak tidak ya *

BatasiKuantit

asuTidak tidak ya tidak *

Linearitas tidak ya ya tidak *

Rentang Tidak Ya ya tidak *

Ketangguhan ya ya ya ya ya

* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik

Contoh

LAL Reagent

• Sensitivitas : 0,125 EU/ml

• Lot No. : Y4661L

• Exp. Date : 09 – 2011

• Kemasan : Vial @ 5,2 ml

• CSE Potency :

500 NG/Vial (2,5 ml)

• Lot No. : EM 84632

• Exp. Date : 03 -2012

• Kemasan : Vial @ 2,5 ml

Hasil Uji Konfirmasi Kepekaan (λ)

Repli

kasi

K (-)

RWCSE E

(EU/ml)

Log E

2λ λ 0,5λ 0,25λ

1 - + + + - 0,0625 -1,204

2 - + + - - 0,125 -0,903

3 - + + - - 0,125 -0,903

4 - + + - - 0,125 -0,903

Jumlah -3, 913

Perhitungan Rata- Rata Geometrik kadar Titik Akhir

GM = antilog Σe/f

Σe = jumlah logaritma kadar titik akhir dari seri pengenceran yang digunakan

f = jumlah replikasi

GM = antilog -3,913/4 = 0,105 EU/ml

Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ .

(≥ 0,0625EU/ml dan ≤ 0,25EU/ml)

Kesimpulan : Memenuhi syarat

Hasil Pengujian dengan LAL

Re

pli

kas

i

K (-)

RWKontrol Positif Kontrol

Sediaan

Positif

Sampel

2λ λ 0,5λ 0,25

λNeat 1:2 1:4 1:8 1:16

Pengujian 1

1 - + + - - + + + + + -

2 - + + - - + + + + + -

Pengujian 2

1 - + + + - + + + + + -

2 - + + - - + + + + + -

Pengujian 3

1 - + + + - + + + + + -

2 - + + - - + + + + + -

Rep

li

kasi

K (-)

RWKontrol Positif Kontrol

Sediaan

Positif

Sampel

2λ λ 0,5λ 0,25λ Neat 1:2 1:4 1:8

Pengujian 1

1 - + - - - + + + - -

2 - + - - - + + + - -

Pengujian 2

1 - + - - - + + + - -

2 - + - - - + + + - -

Pengujian 3

1 - + - - - + + + - -

2 - + - - - + + + - -

Pengujian 4

1 - + - - - + + + - -

2 - + - - - + + + - -

Hasil Pengujian dengan TAL

Pengujian dengan Toksinometer

Alat

• Teknik Kinetik-Turbidimetri

• Endotoxin mengaktifkan enzim pada LAL menghasilkan gelatinasi coagulin dalam LAL, sehingga meningkatkan turbiditas sampel

• Perubahan transitans selama kurun waktu tertentu diukur (kinetik) utk mengukur waktu gelatinasi dari awal smp akhir reaksi.

• Gelation time (waktu gelatinasi) secara langsung berhubungan dengan jumlah endotoksin dalam sampel

Hasil Pengujian

PengenceranRun Time (Menit)

Tg Mean Tg

¼λ 48,2

47,4

47,80

½λ 43,2

43,4

43,30

λ 35,0

35,0

35,00

2λ 29,0

29,2

29,10

Kurva Baku

Persamaan :

Log (Tg) = -0,2400 Log (C) + 1,326

r = -0,9909

Persyaratan nilai r ≥-0,980

(USP 30 : 112)

Pen

guji

an

Sampel

Neat 1:2

T [ ] Rata-

rata

T

Rata-

rata

[ ]

%

recov

ery

T [ ] Rata-

rata T

Rata-

rata

[ ]

%

recove

ry

1 26,0

25,8

0,4258

0,4382

25,9 0,4320 90,73 30,6

31,8

0,2154

0,1848

31,2 0,2001 84,04

2 25,0

25,0

0,3931

0,3931

25,0 0,3931 82,57 28,4

29,6

0,2560

0,2227

29,0 0,2393 100,50

Hasil Pengujian

Sampel uji diicemari dengan endotoksin :- Sampel neat = 0,4761 EU/ml- Sampel 1 : 2 = ½ x 0,4761 EU/ml = 0,2381

Persyaratan % recovery metode turbidimetri adalah 50% - 200%(USP 30 : 113)

Terima kasih