7/23/2019 PEG 1

1/11

1 2012

PENGARUH PENAMBAHAN PEG (Polyethylene glicol) TERHADAP PROFIL PROTEIN

TEMBAKAU (Nicotiana tabacumL. varPrancak 95) PADA MEDIAIN VITRO

Noviana Candra Dewi*, Tutik Nurhidayati1, S.Si., M.Si., Kristanti Indah Purwani

1S.Si., M.Si

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya

AbstrakPEG (Polyethylene Glycol) merupakan senyawa bersifat larut dalam air dan dapat menyebabkan

penurunan potensial air. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan PEGterhadap profil protein tembakau (Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95) pada media in vitro.Tembakau diperoleh dari kultur in vitro dengan menggunakan medium MS, dengan penambahan PEG

0, 15, 20, 25, dan 30 mg/L medium. Selanjutnya dilakukan analisa profil protein tembakau (Nicotianatabacum L. var. Prancak 95) dengan metode elektroforesis SDS-PAGE. Pola pita protein tidakterdeteksi dengan baik akibat munculnya smear. Smearmerupakan tumpukan tebal dari pita proteinyang berbobot molekul rendah, sehingga tidak bisa diamati migrasinya. Penambahan PEG(Polyethylene Glycol) pada medium in vitro mempengaruhi pita protein dengan terbentuknya proteindengan bobot molekul rendah yaitu 9 kDa hingga 29 kDa, dan mempengaruhi konsentrasi pita proteinpada perlakuan penambahan 25-30 mg/L PEG dengan menipisnya pita protein dibandingakan kontrol.

Kata kunci: PEG(Polyethylene Glycol), tembakau (Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95), profilprotein, kultur in vitro,smear

Abstract

PEG (Polyethylene Glycol) is a soluble compound and it can decrease water potential . This researchaims to investigated the response to PEG addition to the protein profile of tobacco on in vitro culture .

Tobacco is obtained from in vitro culture on MS medium with the addition of PEG 0, 15, 20, 25, and

30 mg/L medium. The next, tobacco (Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95) protein profiles was

analysed by SDS-PAGE gell electrophoresis. According to the results, protein bands is not detected

well from each treatment because smear. Smear is a thick pile of protein bands, so it can not observed

protein bands migration. The conclusion of this result is PEG additon responses protein profile of

tobacco on in vitro medium with molecular weight (MW) range 9-29 kDa, and it can decrease the

konsentration of protein bands in PEG addition 25-30 mg/L medium.

Keywords: PEG (Polyethylene Glycol), Tobacco (Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95), Protein

Profile,In Vitro Culture, Smear

*Corresponding Author Phone : 0856 352 7645email : novianadewi19@gmail.co

1Alamat sekarang : Jurusan Biologi, FMIPAInstitut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya

I PENDAHULUANPenanaman dan penggunaan tembakau

di Indonesia sudah dikenal sejak lama.Komoditi tembakau mempunyai arti yangcukup penting, tidak hanya sebagai sumberpendapatan bagi para petani, tetapi juga bagi

negara. Tembakau (daunnya) digunakansebagai bahan pembuatan rokok (Hanum,

2008). Selain itu,diketahui bahwa selama 10tahun terakhir ini, produksi rokok kretek diIndonesia berkisar 5,63%-6,66% per tahun,sehingga rokok merupakan salah satu sumber

7/23/2019 PEG 1

2/11

2 2012

devisa terbesar di Indonesia. Bahan baku

rokok kretek 60-85% adalah tembakaulokal,yaitu tembakau Madura. Salah satutembakau Madura yang paling penting danpaling banyak diminati adalah tembakaudengan varietas Prancak-95 (NicotianatabacumL. var. Prancak 95)(Anonim,2010).Tembakau varietas Prancak-95 (Nicotianatabacum L. var. Prancak 95 ) ini merupakan

salah satu varietas tembakau Madura yangdilepas oleh Menteri Pertanian pada tahun

1997. Salah satu keunggulan tembakauvarietas ini adalah aromanya harum dangurih,sesuai untuk bahan baku rokok kretek

(Suwarso,2000).Salah satu penghasil tembakau

terbesar di Indonesia adalah Madura. Menurut

Nurindah (2009), disebutkan bahwa saat inipenggunaan tembakau Prancak-95 (Nicotianatabacum L. var. Prancak 95 ) diperkirakanmencapai 50-60% dari total areal tembakau diMadura, yang tersebar di Kabupaten Sumenep,

Pamekasan, dan sebagian Sampang.Produktivitas tembakau Prancak-95(NicotianatabacumL. var. Prancak 95)di tingkat petani

berkisar antara 0,45- 0,8 ton/ha (60 -90% daripotensi produksi).

Dalam pengembangan sertabudidayanya, tembakau di Madura banyak

dikembangkan secara konvensional. Teknikpengembangan ini dapat menimbulkan variasigenetik pada individu-individu keturunannyasehingga dapat menyebabkan hilangnya sifatunggul dari varietas awal. Di samping itu,teknik budidaya secara konvensional ini

membutuhkan lahan pengembangan yangrelatif luas dan waktu yang relatif lama.

Lahan perkebunan dan pertanian di

Madura, terutama untuk pengembangantembakau sebagian besar adalah lahan yangkering. Hal ini dipertegas oleh jurnal ilmiah

yang dikeluarkan BALITTAS, sebagian besariklim di Madura beriklim C, D, dan E(Schimdit dan Ferguson) dengan 8-10 bulankering. Pada lahan yang kandungan airrelatifnya cukup rendah akan memberikan

cekaman pada tanaman yang ditanam didalamnya cekaman kering.

Selain itu budidaya tembakau yangbisa dilakukan selain secara konvensionaladalah dengan cara pendekatan bioteknologi

dan pemuliaan tanaman. Salah satu programpemuliaan tanaman tembakau tersebut adalah

dengan teknik kultur jaringan. Manfaat utamakultur jaringan adalah menghasilkan tanaman

baru dalam jumlah yang besar dalam jangka

waktu yang relatif singkat dengan sifat dankualitas yang diharapkan sama denganinduknya (Rahardja, 1995 dalam Yunus,

2007). Salah satu perbanyakan tanamantembakau secara in vitro yang efisien adalah

dengan mengkulturkan organ yaitu eksplandari daun muda tembakau (Hendaryono,1994). Berdasarkan Robbiani (2010),

penambahan ZPT pada medium in vitro yaituNAA 0,5 ppm dan 1 ppm Kinetinmenyebabkan eksplan membentuk kalus akar

dan tunas, atau organogenesis secara tidaklangsung sehingga pertumbuhan keseluruhan

eksplan dapat diamati. Dalam penelitian yangdilakukan, usaha perbanyakan secara in vitroakan dikondisikan seperti halnya lahan kering

di Madura untuk mengetahui pengaruh daricekaman kekeringan terhadap tembakau.Kondisi kekeringan ini akan

dilakukan pada medium in vitro denganpenambahan PEG. Santos-Diaz dan Ochoa-Alejo (1994) dalam Dami dan Hughes (1997),mengemukakan bahwa untuk mendapatkansuatu keadaan yang toleran terhadap

kekeringan,dapat dilakukan denganmengggunakan agen selektif. Agen selektifdapat berupa senyawa osmotik yang dapat

mensimulasikan kondisi kekeringan di lapang.

Senyawa osmotik yang paling banyakdigunakan akhir-akhir ini untukmensimulasikan cekaman kekeringan adalahsenyawa Polyethylene glycol(PEG).

Menurut Thoruan-Mathius et al.,(2004) bahwa dalam menghadapi cekamankekeringan,tanaman dapat melakukan

mekanisme osmotik yang diawali denganperubahan gula osmotik, terutama pada gula

silosa, kemudian terinduksinya proteinberbobot molekul rendah. Sabehat et al.,(1998) menyatakan bahwa ditemukan adanya

akumulasi protein dengan bobot molekulrendah apabila suatu tanaman mengalamicekaman kekeringan. Selain itu cekamankekeringan akan berpengaruh terhadap aspekpertumbuhan tanaman yang mencakup aspek

morfologis anatomis fisiologi dan biokimiatanaman. Adanya cekaman kekeringan dalamsetiap pertumbuhan dan perkembangan

tanaman dapat menurunkan hasil meskipunbesar kemungkinannya bergantung pada fasepertumbuhan pada saat stress terjadi dan

lamanya stress (Kadir,2004).

Respon tanaman yang mengalamikekeringan meliputi perubahan pada tingkat

7/23/2019 PEG 1

3/11

3 2012

seluler dan molekuler seperti perubahan

akumulasi senyawa metabolit osmotik terlarut,perubahan metabolisme karbon dan nitrogensebagai respon biokimia, dan perubahanekspresi gen sebagai respon molekuler (Mullerdan Whitsitt, 1996). Sehingga dalam hal iniakan dilakukan pengamatan terhadap pengaruhpenambahan PEG terhadap profil proteintembakau secara in vitro. Dimana Penambahan

PEG ini menyebabkan penurunan potensial air,dimana keadaan ini dapat dimanfaatkan untuk

melakukan simulasi yang dapat mencerminkanterjadinya cekaman kekeringan.

Rodriguez (1996) dan Jemal et al.,

(1998) menyatakan salah satu cara untukmengetahui keberadaan protein pada suatutanaman dapat dilakukan dengan analisa profil

protein. Analisa profil protein dapat dilakukandengan metode SDS-PAGE (Leammli,1970)

dimana metode ini merupakan metodepemisahan protein berdasarkan perbedaanberat molekulnya. Analisa profil protein ini

diharapkan dapat digunakan untukmenginformasikan tentang profil protein padatanaman tembakau (Nicotiana tabacumL. var.Prancak 95) yang tercekam kekeringan.Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk

mengetahui pengaruh penambahan PEGterhadap profil protein pada tanaman tembakau

(Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95)padamedia in vitro.

II METODOLOGI

Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian dilaksanakan pada bulan

Januari-Mei 2011. Jenis tembakau Madura

yang digunakan adalah (Nicotiana tabacumL.var. Prancak 95) yang diperoleh dari PT.Sadhana Malang. Analisis elektroforesis profil

protein dilakukan di Laboratorium Penelitiandan Pengujian Terpadu Universitas Gajah

Mada, Yogyakarta

Sterilisasi Alat

Semua peralatan baik alat pembuatanmedium (botol kultur) maupun alat inokulasieksplan (cawan Petri, scalpel blade, guntingeksplan, pinset, kertas saring dan tissue)dilakukan sterilisasi. Sterilisasi dilakukan

dengan autoklaf pada suhu 121oC tekanan 1,5

atm selama 20 menit (Nugroho, 2004).Laminair Air Flow (LAF) disemprot

dengan alkohol 70% dan alat-alat yang

dimasukkan ke dalam LAF juga harusdisemprot dengan alkohol 70%. Ruang tanam

(LAF) disterilisasi dengan sinar UV selama 1

jam sebelum LAF digunakan. Ketika LAFdigunakan, sinar UV harus dimatikan danblowerdihidupkan (Fitrianti, 2006).

Pembuatan Medium KulturMedium kultur yang digunakan pada

penelitian ini adalah medium MS yang terdiridari unsur mikro, unsur makro, sukrosa,

vitamin, agar, dan zat pengatur tumbuh (NAAdan Kinetin). Untuk pembuatan media MS,erlenmeyer berukuran 1 liter disiapkan lalu

sebanyak 500 ml medium MS cair siap pakaiyang sudah mengandung unsur mikro, unsur

makro, sukrosa, vitamin, dipanaskan sambildiaduk-aduk. Kemudian ditambahkan zatpengatur tumbuh 0,5 ppm NAA dan 1 ppm

Kinetin (Robbiani, 2010). Selanjutnyaditambahkan PEG dengan beberapakonsentrasi (konsentrasi PEG yaitu 0, 15, 20,25, dan 30 mg/L) sembari dihomogenkan diatas magnetic stirer. Selanjutnya diukur pH

larutan sebesar 5,6-5,8 menggunakan pH meter(Gunawan, 1989). Apabila terlalu asamditambahkan NaOH dan apabila terlalu basa

ditambahkan HCl. Jika pH telah sesuai,ditambahkan agar-agar sebanyak 8 gr dan

medium MS cair ditambahkan kembali hinggavolume 1 L. Medium dididihkan dan diaduk

hingga agar-agar larut dan tercampur ratakemudian medium yang berbentuk cairtersebut segera dimasukkan ke dalam botolkultur sekitar 20 ml/botol. Botol kultur ditutuprapat dengan alluminium foil dan diautoklafpada suhu 121oC, tekanan 1,5 atm selama 15menit. Setelah itu, diberi label sesuai perlakuan

dan disimpan di dalam ruang steril(Hendaryono, 1994).

Sterilisasi EksplanSterilisasi permukaan eksplan daun

tembakau terdiri dari dua tahap yaitu sterilisasitahap I yang dilakukan di ruang persiapan dansterilisasi tahap II yang dilakukan di laminair

air flow (LAF). Pada sterilisasi tahap I, dauntembakau diambil dari greenhouse dan dicucidengan air mengalir selama beberapa menit.Sedangkan sterilisasi tahap II eksplan daunmuda tembakau (Nicotiana tabacum L. varprancak 95) dicelupkan pada etanol 70%selama 30 detik kemudian dicuci denganaquades steril, selanjtnya direndam dalam

larutan sodium hipoklorit (clorox) 1% selama

10 menit, lalu dicuci dengan aquades sterilsecara bertingkat sebanyak 3 sampai 4 kali

7/23/2019 PEG 1

4/11

4 2012

(Fowke et al., 1983). Selanjutnya eksplan

diambil dengan pinset dan ditiriskan padakertas saring steril (Hendaryono, 1994).

Inokulasi EksplanProses inokulasi dilakukan di laminar

air flow dengan kondisi aseptik. Alat-alatinokulasi ditata di dalam laminar air flow.Setiap alat tersebut dicelupkan ke dalam

alkohol 95% dan dilewatkan di atas nyala apibunsen selama 1 menit. Daun tembakau

dipotong 1x1 cm dan diinokulasikan kedalam botol kultur yang telah berisi 20 mlmedium MS dengan posisi bagian abaksial

menyentuh medium (Dhaliwal et al.,2004).Setelah eksplan diinokulasikan ke

dalam botol kultur, botol ditutup rapat dan

diberi label yaitu tanggal dilakukan inokulasieksplan, konsentrasi hormon, dan konsentrasi

PEG yang digunakan yang selanjutnyadiinkubasi di rak kultur selama 30 hari. Setiapkolom rak kultur diberi pencahayaan dengan

lampu neon 40 watt dengan lama penyinaran16 jam terang (Dhaliwal et al., 2004; Ali et al.2003). Suhu ruang penyimpanan diatur relatif

konstan 25oC1 (Dhaliwal et al., 2004).

PemanenanHasil kultur in vitro yang telah

diinkubasi di rak kultur selama 30 hari,dipanen dan diambil semua planlet yang telah

terbentuk dengan pinset. Planlet disimpandalam botol kultur steril dengan melabelinyasesuai dengan label awalnya. Selanjutnya

planlet yang telah diambil akan disiapkanuntuk proses ekstraksi sampel guna prosesdenaturasi elektroforesis yang selanjutnyadikembangkan menggunakan metode Laemmli(1970).

Pengamatan Profil Protein

a. Preparasi Sampel (Ekstraksi Protein)Bagian planlet dari hasil kultur in vitro

yang telah diambil (dipanen) dan dimasukkan

dalam botol steril disiapkan. Planlet yang telahdiambil dicuci dengan akuades kemudiandipotong atau dicacah kecil sebanyak 2 gr.Potongan sampel selanjutnya dibekukandengan N2 cair. Potongan sampel yang telahdibekukan selanjutnya degerus hingga haluslalu diekstrak 1 mL bufer ekstrak (50 mM Tris

pH 8, I mM merkaptoetanol) (Song, 2006).Selanjutnya dihomogenkan dengan vorteks

sebanyak 3-5 kali, dan selanjutnya diambilsupernatan dengan cara dimasukkan dalam

sentrifuge selama 20-30 menit diputar dengan

kecepatan 4000 rpm dengan suhu 4C.Supernatan selanjutnya direbus selama 5menit, dan hasilnya disimpan pada suhu-20C

hingga dilakukan elektroforesis (Labra et al.,2006).

b. Denaturasi Gel ElektroforesisSupernatan hasil sentrifuge dipekatkan

dengan freeze dryer hingga menjadi serbuk.Sampel yang berupa serbuk ditambah akuades60 l. Sampel diambil sebnyak 30 l dan

diekstrak dengan buffer sampel (lampiran 3b)dengan perbandingan larutan buffer : jaringan

= 4:1 pada tabung ependorf (Labra et al.,2006). Profil protein tembakau (Nicotianatabacum L.var. Prancak 95) ditentukan dengan

elektroforesis yang dikembangkan olehLaemmli (1970) yaitu dengan metode SDS-PAGE. Proses elektroforesis dimulai denganpembuatan buffer elektroda (Lampiran 3a),buffer sampel (Lampiran 3b), pewarna gel(Commasive blue) (Lampiran 3c), larutandestainer (Lampiran 3d), gel pemisah 12 %(Lampiran 3e) dan gel penumpuk 3 %

(Lampiran 3f).Setelah larutan siap, maka perangkat

elektroforesis (Biorad , Jerman) dirangkai.

Kemudian 6,0 ml larutan gel pemisah

diisikan pada plat dan dilapisi dengan 1 mlbutanol, didiamkan selama 15 menit agarmemadat. Setelah memadat lapisan butanoldibuang dan ditambah larutan gel penumpukdiatas gel pemisah. Sisir pembentuk sumurandimasukkan antara plat dan didiamkan selama10 menit setelah padat sisir diambil.

Gel yang telah memadat siap dirangkaipada alat elektroforesis dan diisi dengan buffer

elektroda. Sampel dimasukkan ke dalamsumuran dengan volume 25 l/ sumuran.Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan

penghantar listrik 120 V selama 3-4 jam.Elektroforesis dihentikan sampai warna birumenyentuh dasar gel. Gel dilepas dan diwarnaidengan pewarna Commasive blue yang umumdigunakan dalam analisa SDS-PAGE (Bollag

dan Edelstein, 1991). Selanjutnya digoyangdengan kecepatan 42 rpm selama 24 jam.Larutan dibuang dan dilanjutkan pencucucian

dengan Commasive blue bekas selama 30menit, selanjutnya diganti dengan larutandestainer selama 30 menit, dan terakhir dengan

larutan asam asetat 10%. Selanjutnya gel

disimpan dalam larutan asam asetat 10%.Analisa hasil perhitungan berat molekul

7/23/2019 PEG 1

5/11

5 2012

dilakukan dengan membandingkan standar

marker protein yang telah disiapkan.

c. Identifikasi Profil Protein

Profil protein yang diamati meliputiberat molekul, kehadiran pita protein, tebal dantipis pita protein, dan jumlah protein yangterbentuk dari sampel.

Pembuatan Kurva StandarNilai berat molekul protein yang dicari

dihitung dengan menggunakan kurva standar(y = ax + b). Kurva standar dibuat denganmengukur jarak pita marker dari sumuran.

Jarak pita-pita tersebut digunakan sebagaiordinat dari kurva (sumbu x). Sumbu absis(sumbu y) dari kurva adalah nilai log dari berat

molekul pita marker yang telah diketahuisebelumnya. Dari nilai absis dan ordinat yang

telah diperoleh, maka dibuat suatu kurva FittedLine Plotmenggunakan program Minitab 14.Dari kurva yang diperoleh, maka dapat

dianalisa hubungan antara berat molekulprotein terhadap jarak yang ditempuh band

dari sumurannya akibat elektroforesis (Durraniet al., 2008).

Keterangan: x = Jarak pita-pita dari sumurany = Nilai log dari berat molekul pita markeryang telah diketahui sebelumnya

III. HASIL & PEMBAHASAN

Salah satu karakteristik yang dapatdigunakan sebagai pembeda tingkat toleransitanaman terhadap cekaman kekeringan adalahmelihat karakteristik atau profil proteintanaman melalui SDS-PAGE (Ramagopal,1987; Goday,et al, 1988; Wu,et al, 1988)

dalam A.Hussein (2007). Perubahankonsentrasi protein akibat cekaman kekeringantercermin dari perubahan tebal tipisnya pitaprotein yang ditunjukan oleh elektroforesis,

yaitu semakin tipis pita protein semakin rendahkonsentrasinya (Gambar 4.2). Selain tebal tipispita protein, bisa diamati juga jumlah band dan

berat molekul pada pita protein. Pada tanamanyang toleran, akan terjadi induksi protein baruyang merupakan protein spesifik apabila

tanaman dalam kondisi tercekam (Thoruan-Mathius,et al.,2001). Jenis dan berat molekul

yang terbentuk bergantung dari spesiestanaman. Pada tanaman yang peka kekeringan

akan mengalami kerusakan protein yang lebih

banyak dibandingkan pada tanaman yang lebihtoleran (Kirkham,1990).

Pada penelitian ini digunakan tanamantembakau var. Prancak 95, yang merupakansalah satu tembakau Madura yang banyak

dikembangkan. Pada penelitian ini tembakaudikulturkan secara in vitro pada medium MSdengan perlakuan cekaman PEG (Polyethylene

Glycol). PEG merupakan suatu senyawabersifat larut dalam air (polar)dan dapat

menyebabkan penurunan potensial air.Besarnya penurunan potensial air sangatbergantung pada konsentrasi dan berat molekul

PEG. Keadaan seperti ini dapat dimanfaatkanuntuk melakukan simulasi penurunan potensialair dan hal tersebut mencerminkan terjadinya

cekaman kekeringan eksplan yang ditanamdalam media yang ditambah PEG (Michel danKaufmann,1973). Selanjutnya dilakukananalisa profil proteinnya menggunakan metodeelektroforesis SDS-PAGE.

Metode SDS - PAGE diawali denganpreparasi sampel untuk membuat sampelbermuatan sama sehingga muatan tidak

mempengaruhi pergerakan komponen sampeldalam gel. Gel yang digunakan dalam

penelitian ini sendiri adalah gel poliakrilamidedengan konsentrasi 12% separating gel dan 3%

stacking gel. Separating gel ini berfungsi untukmemisahkan atau menseparasi proteinberdasarkan berat molekulnya (Janson, 1998).Metode SDS PAGE dengan separating gel12% dilakukan dengan menentukan perbedaanletak pita (band) pada gel yang dibandingkan

dengan protein marker yang berkisar antara20-200 kDa. Semakin kecil berat molekulprotein yang diperiksa maka semakin besar

prosentase gel, sehingga protein dengan beratmolekul rendah dapat masuk ke pori-pori geldan dapat ditampilkan dalam gel berupa band

(pita) (Aulanniam, 2004).Gel kedua yang digunakan dalam

elektroforesis adalah stacking gel. Stacking gelberfungsi sebagai tempat menata sampelprotein sebelum proses running dimulai

(Laemmli, 1970). Bahan yang digunakandalam pembuatan stacking gel yaitu akrilamid-

bis sebagai pembentuk pori-pori untukmemisahkan protein berdasarkan ukuran yangdimilikinya, tris HCL yang berfungsi untuk

menjaga pH protein, SDS 10% digunakanuntuk memutuskan ikatan disulfida protein dan

dapat menyelubungi protein dengan muatannegatif, APS 10% digunakan sebagai

y = ax+b

7/23/2019 PEG 1

6/11

6 2012

katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid,

serta TEMED yang digunakan sebagaikatalisator pembentukan radikal bebas dariammonium persulfat. pH stacking gel yangdigunakan yaitu 6,8 agar kondisi pH daristacking gel berada di bawah isoelektrikprotein sehingga protein akan tersusun berjajarpada bagian bawah stacking gel (Janson,1998).

Selanjutnya, dalam proses runningelektroforesis, digunakan Reducing Sampel

Buffer/ buffer sampel dan diekstrak dengansampel jaringan dengan perbandingan 4:1(Labra, 2006). Larutan buffer berfungsi

memutus ikatan disulfida protein sehinggadiperoleh protein dalam bentuk linier, yangnantinya akan memudahkan separasi protein

tersebut dalam gel saat running. Hal inidisebabkan karena dalam larutan buffer sampel

ini mengandung 1M Tris-HCl pH 6,8 dan SDS10% berfungsi sebagai agen pereduksi yangmemutuskan ikatan disulfida sehingga protein

berbentuk linier yang memberi muatan negatif, sehingga memudahkan separasi menuju kutubpositif saat dilewatkan arus (Janson, 2008).

Hasil analisa profil protein denganmetode elektroforesis SDS-PAGE sebagai

berikut :

Gambar 4.1. Hasil Running Elektroforesis(Dokumentasi Pribadi, 2011)

Gambar 4.2 Tebal Tipis Pita Protein Pada

berbagai Peralakuan Cekaman PEG(Dokumentasi Pribadi, 2011)Ket :BM adalah Berat Molekul, M adalah

marker, K1 adalah medium kultur in vitrotanpa ZPT, K2 adalah medium kultur in vitrodengan 0 mg PEG/L medium, P1 P4 adalah

medium kultur in vitro dengan penambahanPEG :15,20,25,dan 30 mg/L.

Berdasarkan hasil yang diperoleh,gambar 4.1, tidak terdeteksi dengan baik polapita protein dari setiap sumuran, hanya

terbentuk smear. Smear sendiri merupakantumpukan tebal dari pita protein, sehingga pitaprotein tidak tampak teramati migrasinya.Smear ini diduga merupakan tumpukan tebaldari protein berbobot molekul rendah yangdiduga osmotin. Protein yang dapat dianalisispada penelitian ini hanya protein dengan bobotmolekul (BM) antara 9 kDa hingga 29 kDa(Gambar 4.2). Pada penelitian ini proteinmarker yang digunakan adalah Standartmarker Prestained SDS PAGE (Biorad,Jerman) dengan berat molekul (BM) secaraberurutan adalah, 192,775 kDa; 117,905 kDa;

99,261 kDa; 54,145 kDa, 37,783 kDa; 29,46kDA; 20,198 kDa dan 9,17 kDa.

Kultur tanaman tembakau (Nicotiana

tabaccum L.var Prancak 95) pada media invitromenghasilkan pola pita yang berbeda dariperlakuan control. Kontrol negatif, tanpadipengaruhi ZPT (K1) pita protein tampak

lebih tebal dibandingkan dengan control positif(K2) dengan adanya penambahan ZPT. Padaperlakuan K1 ditemukan protein sama halnyadengan protein yang tampak pada marker,

yaitu dengan BM 9 hingga 20 kDa.Sedangakan pada perlakuan K2, hanyaditemukan 2 pita protein, dimana protein

dengan kisaran BM 9 kDa tidakditemukan/hilang pada perlakuan ini, selain itu

pita protein jauh lebih tipis dibandingkandengan perlakuan K1.

Kultur tanaman tembakau (Nicotiana

tabaccum L.var Prancak 95) pada media invitro pada perlakuan cekaman PEG dengan

29,46

20,19

9,17

99,26

192,

11,9

54,14

37,78

29,46

20,1

9,17

P3BM K1 K2 P1 P4P2M

P3BM K1 K2 P1 P4P2M

7/23/2019 PEG 1

7/11

7 2012

penambahan 15, 20, 25, dan 30 mg/L medium.

Pada perlakuan penambahan PEG sebanyak 15mg/L (P1) diperoleh pita protein yang tebalnyasama dengan penambahan PEG 20 mg/L (P2).Ditemukan protein dengan BM berkisar 9sampai 20 kDa, tetapi protein dengan bobotmolekul rendah terdeteksi lebih tipisdibandingkan protein dengan BM 20 kDa.Sedangkan untuk penambahan PEG 25-30

mg/L pola pita protein jauh lebih tipisdibandingkan dengan perlakuan K1, P1, dan

P2. Pada perlakuan P3 dan P4 kehilanganprotein dengan BM berkisar 9 kDa. Sedangkanuntuk protein dengan BM 20 kDa terdeteksi

lebih tipis dibandingkan dengan perlakuanpada P1 dan P2.

Nayer & Reza (2007) melaporkan

bahwa variasi jumlah pita proteinmenunjukkan adanya respon tanaman terhadap

perubahan lingkungan, dan pita protein yanghilang menandakan adanya degradasi proteinakibat penurunan kualitas lingkungan. Albertet.al., (2002) menjelaskan bahwa ketebalanpita protein menunjukkan konsentrasi proteintersebut, dimana protein dengan intensitas

yang lebih tebal memiliki konsentrasi yanglebih tinggi. Menurut Thoruan-Mathius, et.al

(2001) bahwa cekaman kekeringan dapatmenyebabkan menurunnya konsentrasi protein,

dimana semakin tinggi konsentrasi PEGsemakin tipis pita protein yang nampak padaelektroforesis. Berdasarkan penelitian Riccardiet. al. (1998), Ti-da et. al. (2006), Bensen et.al. (1988) , dan Nayer&Reza (2007),dilaporkan bahwa terjadi peningkatan total

kandungan beberapa protein (konsentrasi danjumlah pita protein) dan juga penurunanbeberapa protein yang lain akibat perlakuan.

Cekaman kekeringan dalam penelitian inidisebabkan oleh penambahan PEG padamedium, tanpa menyebabkan keracunan pada

tanaman yang dikulturkan (Lawyer, 1970).Pada penelitian ini, diharapkan planlet

N.tabaccum pada kultur in vitro mampumerespon penambahan PEG denganmunculnya protein khusus dengan berat

molekul rendah. Menurut Jangpromma dkk(2007), protein khusus yang muncul akibat

cekaman kekeringan memiliki berat molekul18 hingga 31 kDa. Salah satu protein yangdiharapkan adalah osmotin. Salisbury dan Ross

(1995) mengemukakan bahwa kelompokprotein dengan bobot molekul rendah yaitu 20

sampai 30 kDa yang disebut sebagai osmotin.Sedangkan menurut Singh,et al dalam

Cheong,etal (1997) osmotin mempunyai bobot

molekul 24 kDa terakumulasi dalam vakuolaselama adaptasi sel tembakau (N.tabaccum)terhadap cekaman osmotik. Protein osmotin

memainkan peranan penting dalam toleransimelawan cekaman kekeringan. Protein

osmotin merespon cekaman osmotik denganmempertahankan potensial air dalam sel lebihrendah sehingga potensial air lingkungan lebih

tinggi sehingga air di lingkungan lebih mudahdiserap oleh tanaman (Sharma, 2005).

Tumbuhan merespon kekurangan air

dengan mengurangi laju transpirasi untukpenghematan air. Terjadinya kekurangan

airpada daun akan menyebabkan sel penjagakehilangan turgornya, suatu mekanismekontrol tunggal yang memperlambat

transpirasi dengan menutup stomata.Kekurangan air juga dapat meningkatkansintesa ABA dari mesofil daun, sehinggamempertahankan sel penjaga tetapmenutup(Campbell, 2003).

Yancey et.al., 1982 mengatakanbahwa berbagai mekanisme dilakukan olehtanaman yang mengalami cekaman

kekeringan. Mekanisme tersebut berupa responbaik secara molekuler maupun seluler, sepertimelakukan pengaturan status air dalam tubuh

dan perubahan komponen seluler dengan

biosintesis akumulasi senyawa osmolit/osmoprotektan/ compatible solute ataupundengan aktivasi enzim antioksidan (Toruan-Mathius, et,al 2001).

Senyawa osmolit/ osmoportektandapat menyesuaikan nilai potensial osmostikketika potensial osmotik sel menurun,

sehingga tanaman dapat melakukan absorpsiair dan mengurangi konsentrasi garam di

dalam sel. Berbagai respon tersebut merupakansinyal primer cekaman osmotik (Yokoi, 2002).Mekanisme toleransi terhadap kekeringan

dicapai melalui penyesuain pada tingkatmetabolit yang mencakup perubahan aktivitasenzim dan terjadinya akumulasi metablitseperti ABA, betaine, prolin, dan metabolitlainnya (OToole, 1979).

Secara keseluruhan, pita proteintembakau (Nicotiana tabaccumL.var Prancak95) tidak terlihat jelas dan kurang readable,

selain itu juga membentuk smear. Hal inididuga karena kadar atau jumlah sampel yangdigunakan. Labra (2006) menggunakan 1,5-2

gr planlet tanaman jagung (Zea mays). Dalam

penelitian ini digunakan sampel dengan kadaryang sama, tetapi pita protein tidak tampak

7/23/2019 PEG 1

8/11

8 2012

pada setiap perlakuan. Hal ini dapat

dikarenakan jumlah sampel terlalu banyaksehingga hasil elektroforesis pita proteinterlihat bertumpuk. Sementara itu sampel yangdigunakan pada penelitian merupakan planletberusia 2 bulan, dimana pada usia tersebutplanlet tembakau tergolong pada usia muda.Penggunaan sampel tanaman dalam analisaprofil protein haus memperhatikan umur dari

tanaman tersebut. Pada saat berusia mudatanaman belum membentuk protein secara

lengkap atau sempurna, sehingga pola pitaprotein belum terekspresi secara maksimalyang dibuktikan oleh Hastuti (2007) dimana

sampel yang diambil dari tanaman berusia duabulan menunjukkan pita protein yang lebihtipis daripada sampel yang berasal dari

tanaman berumur satu tahun.Selain itu, penyebab smear juga

diduga dipengaruhi oleh proses pewarnaan.Dari segi proses pewarnaan, larutan stainingyang digunakan dalam penelitian ini yaitu

Coomasie Brilliant Blue R-250, ini sensitifterhadap protein yang memiliki ukuran kecil.Pada penelitian ini berat molekul (BM) protein

dari setiap perlakuan tidak dapat ditentukandengan tepat dikarenakan terbentuknya smear,

sehingga jarak migrasinya tidak dapat diukur,dan hanya dapat dibuat kisaran (dugaan) saja.

Penambahan PEG pada konsentrasi 25-30mg/L mempengaruhi menurunnya konsentrasiprotein dengan menipisnya pita dibandingkandengan penambahan PEG 15-20 mg/L. Proteinyang terbentuk dengan BM rendah ini didugamerupakan protein osmotin, yaitu antara 9 kDa

hingga 29 kDa.

IV. KESIMPULAN

1. Penambahan PEG (Polyethylene Glycol)pada medium in vitromempengaruhi pitaprotein, dan terbentuk protein dengan

berat molekul 9 kDa sampai dengan 29kDa pada semua perlakuan.

2. Pada penambahan PEG (PolyethyleneGlycol) sebanyak 25-30 mg/L pita proteinmenurun konsentrasinya dengan

menipisnya pita protein yang terbentuk

V. SaranAnalisis profil protein tanaman

tembakau (Nicotiana tabacum. var. Prancak95) yang dikulturkan dengan penambahan

PEG pada kultur in vitro memerlukanpengujian lebih lanjut untuk menunjukkan

bahwa protein berbobot molekul rendah adalah

protein osmotin dengan pengerjaan preparasisampel secara teliti.

VI. UCAPAN TERIMAKASIHTerselesainya Tugas Akhir ini, tidak

terlepas dari bantuan berbagai pihak. Padakesempatan ini penulis sampaikan terima kasihsebesar-besarnya (1) Ibu Tutik Nurhidayati,

S.Si., M.Si. sebagai pembimbing I atas waktuyang diluangkan untuk membimbing penulis.

(2) Ibu Kristanti Indah Purwani, S.Si., M.Si.,sebagai pembimbing II. Tak lupa penulis jugaingin mengucapkan terima kasih kepada terima

kasih atas bimbingannya Bapak MukhammadMuryono, S.Si, M.Si, Ibu Dr.rer.nat. MayaShovitri, M.Si, dan Bapak Aunurohim S.Si,

DEA selaku dosen penguji yang telahmemberikan banyak saran dalam penyelesaianTugas Akhir ini. Serta kepada LaboratoriumPenelitian Dan Pengujian Terpadu UniversitasGajah Mada Yogyakarta untuk analisa

poteinnya.Tidak lupa penulis juga ingin

menyampaikan terima kasih sebesar-besarnya

kepada Bapak dan Ibu, serta keluarga besar diJayapura yang memberikan doa dan semangat

yang luar bisa. Dimas Andriyanto, suami danayah bagi anak-anakku nanti, serta teman

seangkatan Biologi 2007 atas segala doa dandukungannya.

DAFTAR PUSTAKA

A.Hussein. 2007. ABA-induced PolypeptideAccumulation Drought Tolerant Rice.

Plantech Research Laboratory.

Albert B., Johnsons A., Lewis J., Raff M.,Roberts K., and Walter P. 2002.

Moleculer Biology of The Cell. Edisi

4. Garland Science : New York.

Ali, Gowher. , Zahir Ali, and Muhammad

Thoriq. 2007. Callus Induction and invitro Complete Plant Regeneration ofDifferent Cultivars of Tobacco

(Nicotiana tabacum L.) on Media ofDifferent Hormonal Concentration.Biotechnology 6 (4): 561-566.Departement of Biotechnology,University of Malakand, Chakdara

NWFP : Pakistan.

7/23/2019 PEG 1

9/11

9 2012

Anonim,2010. http;//www.google//prancak

95_Perkembangan pertembakauanIndonesia memasuki tahun 2000.Direktorat Jenderal Perkebunan19pp.Diakses pada 05 Oktober 2010pukul 21.05 WIB.

Aulanniam. 2004. Prinsip dan TeknikAnalisis Biomolekul. PenerbitFakultas Pertanian Universitas

Brawijaya Press: Malang.

Basuki, S, Suwarso, A. Herwati, dan S.

Yulaikah. 1999. Biologi danMorfologi Tembakau Madura.Balai

Penelitian Tembakau dan TanamanSerat :Malang.

Bollag, D.M., and Edelstein,S.J. 1991. Protein

Methods. Departement of

Biochemistry. University of Geneva,Geneva : Switzerland.

Boyer RF. 1993. Modern ExperimentalBiochemistry. Jilid 2. California: TheBenjamin/Cummings PCI. Page 25.

Budiarti. 2008. Tumbuhan Berduri denganAdaptasi Tinggi.

http://www.sinarharapan.co.id,Diakses tanggal 01 Februari 2012

Campbell N, Reece J.B, and Mitchell L.G.2002. Biologi Jilid 1. Penerbit

Erlangga : Jakarta

Davis L,et al. 1994. Basic Methods:Molecular Biology. Jilid 2.

Norwola:Appletn&Lange. Page 68.

Dhaliwal, Harbinder. S. et al,. 2004. Tiba

Inhibition of In vitro Organogenesis inExcised Tobacco Leaf Explants. Invitro cell. Dev. Biol. Plant 40:235-

238. Plant Physiology ResearchGroup, Departement of BiologicalSciences, University of Calgary,Calgary, Alberta, T2N 1N4, Canada.

Fowke, L.C. et al,. 1983. OrganellesAssociated With The PlasmaMembrane of Tobacco LeafProtoplasts. Plant Cell Reports

(1983) 2: 292-295.

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar BioteknologiMolekuler. Universitas Padjajaran :Bandung.

Girousse, C., R. Bournoville & J.L.Bonnemain (1996). Water deficit-

induced changes in concentrations inproline and some other amino acids inphloem sap of alfalfa. Plant Physiol.,111, 109-113.

Goldsworthy,P.R. and N.m. Fisher. 1992.Fisiologi Tanaman BudidayaTropik, diterjemahkan oleh Tohari.

Gajah Mada University : Yogyakarta.Hal 594-627.

Gunawan, L.W., 1989. Teknik kultur

jaringan tumbuhan. LaboratoriumKultur Jaringan Tumbuhan, Pusat

Antar Universitas (PAU), InstitutPertanian Bogor (IPB). Bogor.

Hanum, Chairani. 2008. Teknik BudidayaTanaman Jilid 3. DirektoratPembinaan Sekolah MenengahKejuruan, Direktorat JenderalManajemen Pendidikan Dasar danMenengah, Departemen Pendidikan

Nasional. Jakarta.

Hastuti, Dwi.,dkk. 2007. Studi Variasi

Morfologi dan Pola Pita Protein

pada Varietas Kamboja Jepang.

Universitas Sebelas Maret : Surakarta.

Hendaryono, Daisy.P.S dan Ari Wijayani.

1994. Teknik Kultur Jaringan

(Pengenalan dan PetunjukPerbanyakan Tanaman Secara

Vegetatif-Modern). Penerbit

Kanisius: Yogyakarta.

Imai R, Chang L, Ohta A, Bray EA, andTakagi M. 1996. A lea-class gene oftomato confers salt and freezingtolerance when over-expressed inSaccharomyces cerevisiae. Gene. 170 :243-248.

Jangproma, Nisachon, et al. 2007. 18 kDaProtein Accumulation in SugarcaneLeaves Under Drought Stress

Conditions. KMITL Su.tech.J. Vol 7.No 1.44-45.

7/23/2019 PEG 1

10/11

10 2012

Janson, J.C, L.Ryden. 1998. Protein

Purification Principles, High-

Resolution Methods andApplications, Second Edition. JohnWiley & Sons, Inc : Canada.

Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J,and Thun MJ. 2007.Cancer statistics1998. CA Cancer J Clin 57:43-66

Kadir , 2004 . Nilam

.

Kishore PBK, Hong Z, Guang Huo, Mia O.

1996. Overexpression of d-pyrroline-5-carboxylate synthease increaseproline production and confers

osmotolerance in transgenic plants.Plants Physiol. 108 : 1387-1394.

Klug, W. S. and M. R. Cummings. 1994.Concepts of genetics. 4th ed. PrenticeHall :Englewood cliffs.

Kuixiong ,Gao .1993. Polyethylene glycol asan embedment for microscopy andhistochemistry. CRC Press.ISBN 978-0-8493-4323-0.Page.1-10.

Labra, M., Gianazza, Waitt, Eberini, Sozzi,

Regondi, and Grassi. 2005. Zea maysL. Protein Changes In Response ToPotassium Dichromate Treatments.

Chemosphere . 62 : 12341244.

Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structuralproteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4. Nature,

227,680-685.

Lawyer, D.W. 1970. Absorption ofPolyethilene glycol by Plants TheEffect On Plant Growth. New Physiol.

(69) : 501-513.

Levitt, J.(1980). Responses of plants toenvironmental stresses: Water,

radiation, salt, and other stresses. Vol.II. New York, Academic Press.

Mansfield., T.A. and C. J. Atkinson. 1990.

Stomatal Behavior in Water

Stressed Plants. P. 241-246. InAlscher ang Cumming (Ed.). Stress

respons in plant: adaptation andacclimation mechanisms. Wiley-Liss,

Inc,: New York.

Muller, J.E. & M.S. Whitsitt (1996). Plant

cellular responses to water deficit.

Plant Growth Reg., 20, 119 124.

Nayer, Mohammadkhani, dan Reza Heidari.

2007. Effects of Drought Stress onSoluble Proteins in two MaizeVarieties. Turk J Biol. 32 (2008) 23-30

Nurindah, 2009. Konsep dan Implementasi

Teknologi Budi Daya Ramah

Lingkungan pada Tanaman

Tembakau, Serat, dan Minyak

Industri. Balai Penelitian Tembakaudan Tanaman Serat: Malang.

Ochse, J.J., M.J. Soule, Jr., M.J. Djikman, and

C. Wehlburg 1961. Tropical andSubtropical agriculture .Agriculturevol II.The MacMillan: New York.

OToole and T.T Chang. 1979. Drought

Resistance in Cereal Rice: StressPhysiology In Crop Plants. JohnWiley and Sons : New York.

Poedjiadi, Anna. 2000. Dasar-dasarBiokimia. Universitas Indonesia :Jakarta.

Ricardi f., Gazeau P., Vienne D. 1993. Proteinchanges in Responses to ProgressiveWater Deficit in Maize, quantitativevariation and polypeptida

identification. Plant Physiol. 117:1253-1263.

Robbiani, Daniar. 2010. Pengaruh KombinasiNAA Dan Kinetin Pada KulturIn vitroeksplan Daun Tembakau. Skripsi.

Jurusan Biologi Fakultas MIPA ITS :Surabaya.

Rodrigues,E.Lozano, L.E. Hernandez, P.Bonaydan R.O. Carpena-Ruiz. 1996.

Distribution of Cadmium in ShootAnd Root Tissue of Maize and Pea

Plants : Physiological Disturbance.

Oxford University Press.San Fransisco: USA.

http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230http://id.wikipedia.org/wiki/Istimewa:Sumber_buku/9780849343230

7/23/2019 PEG 1

11/11

11 2012

Sabehat, A., D. Weiss & S. Lurie .1998.

Heatshock proteins and cross-tolerancein plants. Physiol Plant., 103, 437-441.

Salisbury, F.B. & C.W. Ross. 1995. Fisiologi

Tumbuhan,Jilid 3. Penerbit ITB :Bandung.

Santos-Diaz, M. S. and N. Ochoa-Alejo. 1994.PEG-tolerant cell clones of chili

pepper : growth, osmotic potentialsand solute accumulation. Plant Cell,Tissue Org. Cult. 37 :1-8

Sharma,P., S.Kumar. 2005. Differentiationdisplayed mediated identification ofthree drought responsive expreseed

sequence tag in tea. J.Biosci : 231-235.

Soeharsono,dkk. 1984. Biokimia Jilid I.

Gadjah Mada University Press :Yogyakarta.

Song,N.A., 2006. Aktivasi Peroksidase Dan

Profil Protein Lini Kalus Padi (OryzasativaL.) Toleran Kekeringan. Thesis: ITB.

Suwarso, 2000. Pewarisan Ketahanan

Terhadap Penyakit Lanas PadaTembakau Madura Prancak-95.Balai Penelitian Tembakau danTanaman Serat: Malang.

Thoruan-Mathius,N., T.Liwang, M.I.Danuwiksa, G.Suryatmana,H.Djajasukanta, D.Saodah, dan

I.G.P.W.Astika. 2004. ResponBiokimia Beberapa Progeni Kelapa

Sawit (Elais guineensisJacq) terhadapCekaman Kekeringan Pada KondisiLapang. Jurnal Menara Perkebunan72,2 : 38-56.

Ti-Da Ge., Fang-Gong Sui, Pi-Ba. 2006.Effects Of Water Stress On TheProtective Enzymes And LipidPeroxidation In Roots And Leaves OfSummer Maize. Agricultural Sciencein China 5: 291-298, 2006.

Wang, Haiyan dkk. 2008. Identification ofpolyphenols in tobacco leaf and theirantioxidant and antimicrobialactivities. Journal Food Chemistry :107 (2008) 13991406.

Wijaya, SK. Susi, dan Lutfi Rohman. 2001.Fraksinasi dan Karakterisasi ProteinUtama Biji Kedelai. Jurnal IlmuDasar. Vol 3 , 2001.49-54.

Wirahadikusumah M. 1989. Biokimiaprotein, enzim dan asam Nukleat.Institut Teknologi Bandung : Bandung.

Xu DP, Duan X, Wang B, Hong B, and Wu R.1996. Expression of a late

embryogenesis abundant protein gene,HVA1 from barley confers toleranceto water deficit and salt stress in

transgenic rice. Plant Physiol. 110 :249-257.

Yokoi., Shuji, Ray A. Bressan and Paul MikeHasegawa. 2002. Salt StressTolerance of Plants. JIRCASWorking Report(2002) 25-33.

Yunus, A. 2007. Pengaruh IAA dan Kinetin

terhadap Pertumbuhan EksplanBawang Merah (Allium ascalonicumL.) secara In Vitro. Jurnal Akta

Agrosia Edisi KhususNo. 1: 53-58.