ISOLASI SENYAWA FLAVANON DARI DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) DAN UJI ANTIOKSIDAN DENGAN METODE

SPEKTROFOTOMETRI DAN PEREAKSI DPPH

Septiani Martha1, Adek Zamrud Adnan2, Erjon1

1STIFI Bhakti Pertiwi, Palembang2Fakultas Farmasi Universitas Andalas, PadangEmail address: Thatha39martha@yahoo.com

ABSTRAKTelah diisolasi senyawa flavanon dan uji antioksidannya dari daun sirsapk

(Annona muricata L.) dengan metode spektrofotometri dan pereaksi DPPH. Proses isolasi dilakukan secara maserasi, kemudian difraksinasi dengan n-heksan, diklormetana, diklormetana basa, etil asetat. Pada pemeriksaan komponen dengan kromatografi lapis tipis, spektrofotometri (UV dan IR) dan aktivitas antioksidan dengan menggunakan spektrofotometri radikal bebas DPPH, dari hasil penelitian diperoleh pola spektrum UV didapatkan puncak pada panjang gelombang maksimum 223 nm dan 279,5 nm, sedangkan hasil spektrum IR menunjukan adannya gugus OH, gugus C-H, gugus C=O, gugus C=C, gugus C-O. Pengujian antioksidan senyawa hasil isolasi didapatkan IC50 sebesar 25,6 ppm sedangkan IC50 dari senyawa pembanding vitamin C sebesar 23,25ppm. Berdasarkan pengujian dengan pereaksi flavonoid, data spektrum UV dan IR, komponen tersebut diduga senyawa flavanon dan mempunyai aktivitas antioksidan.Kata Kunci : Flavanon, Annona muricata, Antioksida

ABSTRACTAn antioxidant flavanon of Sirsak leaves has been isolated. The isolation process

is done by maceration, then fractionated by n-hexane, diklormetana, diklormetana base, and ethyl acetate. The identification of compounds used thin-layer chromatography, spectrophotometri (UV & IR) and antioxidant activity by DPPH methode. From the experimens showed UV spectra give wavelength 223 nm and 279,5 nm and spectra have he the presence of OH, C-H, C=O, C=C, and C-O bond. The spectrophotometry examination of antioxidant activity from isolated compound obtained IC50 = 25,6ppm, while IC50 of literature in 23,25ppm.as comparation. Based on examination with flavonoid reagen and data of UV and IR spectra, this compound supposed as flavanon and has the antioxidant activity.Keywords : Flavanon, Annona muricata, Antioxidant

PENDAHULUANRadikal bebas bersifat reaktif, dan jika tidak diinaktifkan akan dapat merusak

makromolekul pembentuk sel, yaitu protein, karbohidrat, lemak, dan asam nukleat, sehingga dapat menyebabkan penyakit degeneratif. Pada penelitian lebih lanjut telah diteliti bahwa sekitar 40 penyakit mencakup aterosklerosis, hipertensi, iskemik, alzheimer, parkinson, kanker dan peradangan disebabkan oleh radikal bebas (Youngson, 2005).

1

Kerusakan oksidatif atau kerusakan akibat radikal bebas dalam tubuh pada dasarnya dapat diatasi oleh antioksidan endogen seperti enzim katalase, glutathione peroxidase, dan superoxide dismutase. Namun jika senyawa radikal bebas terdapat berlebih dalam tubuh atau melebihi batas kemampuan proteksi antioksidan seluler, maka dibutuhkan antioksidan tambahan dari luar atau antioksidan eksogen untuk menetralkan radikal yang terbentuk. Antioksidan memiliki kemampuan menghambat, menangkap dan mencegah pembentukan radikal dengan cara memutuskan reaksi berantai sehingga tidak terjadi kerusakan, selain itu antioksidan juga bekerja memperbaiki sel-sel dan jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas (Youngson, 2005).

Berdasarkan referensi ilmiah, diinformasikan bahwa daun sirsak diklaim mempunyai potensi antikanker 10.000 lebih kuat dibandingkan obat antikanker konvensional seperti doxorubisin (Mclaughin, 2008). Adapun senyawa yang berperan adalah senyawa sitotoksik seperti senyawa golongan acetogenin, alkaloid isoquinolin, serta alkaloid swainsonin. Selain itu, diinformasikan juga dari alkaloid swainsonin yang terkandung pada daun sirsak, memiliki efek samping neurotoksin yang menyebabkan gangguan bergerak (penyakit parkinson) (Mohanty, et al., 2007). Selain memiliki aktivitas antikanker, daun sirsak juga memiliki aktivitas antioksidan, adapun senyawa berperan adalah golongan senyawa fenolik seperti asam fenolat, asam kafeat, asam p-kumarat, asam ferulat (Ideasanti, 1995).

Berdasarkan informasi dan referensi yang didapat, peneliti ingin mencari fraksi dari daun sirsak yang tidak memiliki kandungan alkaloid berbahaya yang diduga alkaloid swainsonin sehingga aman dan efektif digunakan untuk pengobatan, memiliki aktivitas antioksidan yang kuat serta masih memiliki aktivitas antikanker sehingga dapat menghambat pembentukan sel kanker.

Penelitian ini dilakukan dengan pendekatan fitokimia dan pendekatan farmakologi, pendekatan fitokimia dilakukan dengan mengidentifikasi metabolit sekunder dari berbagai fraksi ekstrak dan memisahkan fraksi yang mengandung alkaloid yang diduga alkaloid swainsonin dengan pengujian menggunakan kromatografi lapis tipis. Sedangkan pendekatan farmakologi antikanker dilakukan dengan uji antioksidan dengan metoda DPPH serta dilanjutkan dengan pemisahan dan pemurnian dengan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis preparatif, karakteristik senyawa hasil isolasi secara fisikokimia dengan spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometer IR (Gritter et al, 1991).

METODOLOGI PENELITIAN

Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Maret sampai bulan Mei 2012 di

Laboratorium Penelitian Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Bhakti Pertiwi Palembang, di Laboratorium Kimia Bahan Alam dan Laboraturium Analisa Fisiko Kimia Jurusan Farmasi Universitas Andalas Padang.Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain lumpang dan mortir, tabung reaksi, seperangkat alat destilasi uap, plat tetes, corong pisah, EYELA rotary evaporator SB-1000, beker gelas, gelas ukur, buret, pipet gondok, vial, botol semprot, pengaduk kaca, erlenmeyer, timbangan analitik, timbangan neraca 1kg, seperangkat alat Spektrum UV-1700 PharmaSpec (SHIMADZU), chamber, pipa kapilar, lampu UV-

2

BETRACHTER (CAMAG), alat vakum, oven multi King MK 16, kromatografi kolom, kaca masir, lumpang agate, Thermo Scientifik: Nicolet iS10 dan alat-alat gelas lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : simplisia folium Annona muricata L 1 kg, kloroform, kloroforom amoniak, pereaksi mayer, H2SO4 2N 0,5 ml, etanol 96 %, serbuk Mg, HCl Pekat, aquadest, FeCl3, asam asetat anhidrat, H2SO4 pekat, pasir bersih, norit, metanol destilat, heksan destilat, diklormetana, destilat, etil asetat destilat, asam asetat 5%, Na sulfat eksikatus, serbuk DPPH, plat KLT silika gel GF254, silika gel60, penampak bercak yakni iodium, sitrus borat, amoniak, pereaksi Dragendorff, serbuk KBr.

PROSEDUR PENELITIANPengambilan Sampel

Tumbuhan diambil dari KTO (Kebun Tanaman Obat) Universitas Andalas, Sumatera Barat, sampel yang digunakan adalah simplisia segar daun sirsak. Kemudian dilakukan identifikasi tumbuhan sirsak di Herbarium Universitas Andalas.

Penyiapan SampelSebanyak 1 kg sampel yang segar dari daun sirsak ini disortasi basah yakni

dipisahkan dari pengotor atau bagian yang tidak diinginkan, tahap ini dilakukan secara manual. Setelah itu, sampel di cuci bersih untuk menghilangkan pengotor yang masih tersisa. Kemudian sampel dirajang dengan menggunakan pisau atau alat yang bukan logam seperti kaca atau pisau stainless steel. Proses pengeringan tidak dilakukan karena yang diambil pada penelitian ini adalah simplisia basah dari daun tumbuhan sirsak.

Identifikasi Metabolit SekunderPengujian fitokimia dilakukan dengan pemeriksaan alkaloid (Culvenor And Fitzgerald, 1963), flavonoida (Simes, J.J.H., Melbourne, 1959), terpenoid, pemeriksaan saponin, Steroid, saponin dan senyawa fenol (Simes, J.J.H., Melbourne, 1959). Hasil yang diperolah adalah sebagai berikut :

Tabel 1. Hasil Identifikasi Metabolit Sekunder

Metabolit Sekunder Pereaksi HasilAlkaloid Pereaksi Mayer +

Flavonoid Mg/HCl +Fenolik FeCl3 +

Terpenoid Liebermann-Burchard -Steroid Liebermann-Burchard -Saponin Kocok -

Ekstraksi dan Fraksinasi

Daun sirsak 1 kg dalam keadaan segar yang telah dirajang lalu dimaserasi dengan menggunakan metanol sebanyak 3x selama 4 hari ± 10 L. Kemudian disaring, didapat ampas dan sari metanol, sari metanol diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental yang bebas dari metanol, kemudian ditimbang didapat ekstrak kental sebanyak 22,8 g. Setelah itu, diencerkan dengan air hanggat 300ml kedalam ekstrak kental tadi kemudian disaring dengan kapas.

Diperoleh fraksi air, fraksi air diambil 100 ml kemudian dilarutkan dengan asam asetat 5% sebanyak 50 ml lalu dikocok dan dienaptuangkan, kemudian dibasakan dengan amoniak pekat kurang lebih 10ml hingga pH 10, selanjutnya larutan difraksinasi

3

dengan larutan DCM 3 x 300 ml maka didapatkan fraksi diklormetana (DCM) basa, selanjutnya disaring dengan Na2SO4 eksikatus. Fraksi diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kering dari fraksi DCM basa dengan berat 0,1366 g. Kemudian fraksi air yang tersisa, dinginkan, dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan heksan sebanyak 300ml, dikocok dengan corong pisah selama 15 menit, setelah didiamkan maka akan terbentuk 2 lapisan didalam larutan tersebut dimana bagian atas heksan dan lapisan bawah fraksi air, lapisan heksan dipisahkan. Fraksi air kembali dikocok dengan heksan 2 x 300 ml. Kumpulan fraksi heksan disaring dengan Na2SO4 eksikatus, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator, maka akan didapatkan ekstrak kering heksan, dengan berat 1,4617g. Sisa fraksi air, dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan DCM sebanyak 300 ml, dikocok dengan corong pisah selama 15 menit, setelah didiamkan maka akan terbentuk 2 lapisan didalam larutan tersebut dimana bagian atas fraksi air dan lapisan bawah larutan DCM (Diklormetana), lapisan DCM dipisahkan. Fraksi air kembali dikocok dengan DCM 2 x 300 ml. Kumpulan fraksi DCM, disaring dengan Na2SO4

eksikatus, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator, maka didapatkan ekstrak kering DCM, dengan berat 1,1087g

Kemudian sisa fraksi air, dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan etil asetat sebanyak 300 ml, dikocok dengan corong pisah selama 15 menit, setelah didiamkan maka akan terbentuk 2 lapisan didalam larutan tersebut dimana bagian atas larutan etil asetat dan lapisan bawah fraksi air, lapisan etil asetat dipisahkan. Fraksi air kembali dikocok dengan etil asetat 2 x 300 ml. Kumpulan fraksi etil asetat disaring dengan Na2SO4 eksikatus, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator, maka didapatkan ekstrak etil asetat kering, dengan berat 2,074 g

Identifikasi Flavonoid dan alkaloid dengan KLT Tujuan melakukan identifikasi flavonoid dan alkaloid dengan KLT preparatif adalah untuk mengetahui pada ekstrak kering mana yang mengandung flavonoid dan alkaloid.Identifikasi Flavonoid dengan KLT

Ekstrak kering dilarutkan sedikit dengan pelarut masing-masing lalu ditotolkan pada plat KLT silika gel F254 dengan ukuran panjang 5 cm dan lebar 1 cm. Fase gerak yang digunakan ialah asam asetat 5%: air (1:9) dalam 10 ml dan DCM metanol (8:2). Fase gerak dimasukkan dalam chamber lalu dijenuhkan, masukkan KLT yang sudah ditotol biarkan terjadi elusi, kemudian diangkat plat KLT dengan menggunakan pinset sebelum batas atas plat keringkan. Setelah kering ditotolkan FeCl3 atau sitrus borat dengan menggunakan kapas lalu pelat dilihat di bawah lampu UV, positif flavonoid ditunjukkan bercak warna hitam atau kuning pada plat (Harbone, J. B., 1987).

Identifikasi Alkaloid dengan KLT Ekstrak kering dilarutkan sedikit dengan pelarut masing-masing lalu ditotolkan

pada plat KLT silika gel F254 dengan ukuran panjang 5 cm dan lebar 1 cm. Fase gerak yang digunakan ialah campuran metanol: larutan ammonia 25% (200: 3) dalam 10 ml dan DCM: Metanol (8:2) dalam 10ml. Fase gerak dimasukkan dalam chamber lalu dijenuhkan, dimasukkan KLT yang sudah ditotol biarkan terelusi. Diangkat KLT dengan menggunakan pinset sebelum batas atas plat keringkan. Setelah kering ditotolkan pereaksi Dragendorff dengan menggunakan kapas lalu plat dilihat di bawah lampu UV. Positif alkaloid ditunjukkan bercak warna jingga dengan latar belakang kuning. Selain fase gerak diatas bisa juga digunakan fase gerak campuran metanol: diklormetana (Djamal, 2010).

4

Tabel 2. Hasil Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dengan KLT Silika Gel GF254dan Pengujian dengan Sianidin Test

Fraksi Alkaloid(P. Dragendorff)

Flavonoid Fenolik(FeCl3)

(Sitrus borat) Sianidin Testn-Heksan - - - -

DCM + - -+

-Etil Asetat - + +DCM basa + - - -

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPHPembuatan Reagen DPPH

Serbuk DPPH ditimbang lebih kurang 9,8575 mg menggunakan timbangan analitik dimasukkan ke dalam labu ukur 250ml dilarutkan dalam 100 ml metanol destilat, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna violet. Kemudian metanol destilat diteteskan ke dalam labu hingga batas volume 250 ml. Labu ditutup rapat dengan penutupnya, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna violet, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100µM. Pengerjaannya dilakukan ditempat yang terlindung dari cahaya.

Pengukuran Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPHLarutan DPPH yang telah dibuat dipipet sebanyak 3,8 ml dan ditambahkan 0,2

ml metanol mengunakan pipet mikro. Larutan DPPH dikocok pelan hingga homogen dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang terlindung dari cahaya. Larutan campuran DPPH dengan metanol dimasukkan ke dalam kuvet dan diuji serapannya menggunakan alat spektrofotometri dan serapan larutan diukur dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-800 nm. Maka didapatkan panjang gelombang 515,8 nm dengan Absorbansi 0,712.

Penentuan IC50 Fraksi Etil Asetat Daun SirsakPembuatan Larutan Sampel

Fraksi ekstrak kering ditimbang sebesar 10 mg (untuk DCM dan etil asetat), dan ditimbang 0,5 mg (untuk etil asetat), di dalam vial 10 ml yang telah dinolkan pada timbangan analitik. Setelah itu dilarutkan dengan metanol 5 ml, vial digoyang sampai larutan uji telah homogen, metanol diteteskan ke dalam vial hingga 10ml yang segera ditutup rapat, vial dikocok secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual. Dilakukan pemipetan kedua sebanyak 5ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial kedua dan dilarutkan dengan metanol hingga 10ml. Dilakukan pemipetan sampai didapatkan 5 konsentrasi. Konsentrasi larutan uji yang didapatkan dari kelima pengenceran tersebut adalah sebesar 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, dan 0,03125 mg/ml. Sementara DCM basa ditimbang 6 mg yang dilarutkan dalam 6 ml metanol destilat yang segera ditutup rapat, vial dikocok secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual. Dilakukan pemipetan kedua sebanyak 3 ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial kedua dan dilarutkan dengan metanol hingga 6 ml, dilakukan pengenceran sampai 5 konsentrasi, dibuat dengan konsentrasi yang sama dengan fraksi etil asetat dan DCM.

Penentuan Aktivitas Antioksidan

5

Dipipet 0,2 ml masing-masing larutan sampel dengan berbagai konsentrasi, dimasukan kedalam vial, ditambah 3,8 ml larutan DPPH 100µM, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan diukur dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum DPPH yakni 515,8 nm. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan untuk masing-masing konsentrasi larutan sampel kemudian dianalisa dengan regresi dan korelasi inhibisi (I) terhadap konsentrasi

Menurut Ariyanto cit. Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji menggunakan metode spektofotometri dengan pereaksi radikal bebas DPPH dapat digolongkan menurut nilai IC50.

Tabel 3. Absorbansi Sari DCM, Sari Etil Asetat dan Sari DCM Basa Pada Berbagai KonsentarasiKonsentrasi

(ppm)Absorbansi

DCM DCM basa Etil asetat1000 0.136 0.06 0.037500 0.281 0.127 0.056250 0.407 0.316 0.077125 0.476 0.446 0.08662,5 0.526 0.517 0.118

Tabel 4. Hubungan Konsentrasi Sari DCM, Sari Etil Asetat dan Sari DCM Basa dengan Data Hasil Uji Antioksidan

Konsentrasi(ppm)

Persen Inhibisi SampelDCM(%) DCM basa(%) Etil asetat(%)

1000 80,899 91,573 94,803500 60,534 82,163 92,134250 42,837 55,618 89,185125 33,146 37,359 87,92162,5 26,124 27,388 83,427

Y Persamaan y = 0.057x + 26.52 y = 0.067x + 32.83 y = 0.010x + 85.51R2 R² = 0,970 R² = 0,849 R² = 0.824

Tabel 5. Hubungan Konsentrasi Sari Etil Asetat dengan Data Hasil Uji Antioksidan

Konsentrasi (ppm) Absorbansi Persen Inhibisi (%) Y Persamaan R2

50ppm 0,111 84,41

Y = 1.651x + 0.005 0,99325ppm 0,444 37,64

12,5ppm 0,569 20,0846,25ppm 0,643 9,6913,125ppm 0,654 8,146

Isolasi Flavonoid Fraksi Etil Asetat dengan Kromatografi Kolom dan KLT PreparatifKromatografi Kolom Fraksi Etil Asetat Daun Sirsak

Isolasi senyawa dilakukan terhadap fraksi etil asetat daun sirsak dengan menggunakan metoda kromatografi kolom, yang sebelumnya dianalisa dengan KLT menggunakan fase diam silika gel GF 254, fasa gerak metanol dan diklorometana (DCM) dengan perbandingan tertentu. Sebagai penampak bercak digunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm, setelah didapatkan pelarut yang cocok untuk

6

memisahkan komponen-komponen yang ada dalam senyawa tersebut, selanjutnya dilakukan pemisahan secara kromatografi kolom. Pada pemisahan awal ini pelarut yang digunakan sebagai fase gerak adalah campuran pelarut yang memiliki perbandingan tertentu. Pelarut yang digunakan adalah gerak metanol dan diklorometana. Fraksi etil asetat sebanyak 400mg dikromatografi vakum cair (flash chromatography) dengan fase diam silika gel 60 ukuran 43-60 µm dan fase geraknya metanol dan diklorometana (DCM). Silika gel disuspensikan dengan metanol dan diklorometana. Suspensi silika gel dimasukkan kedalam kolom berupa tabung kaca yang ujungnya terdapat kapas dan pastikan silika di dalam kolom menjadi padat sambil diketok-ketok dan tidak ada rongga udara. Sampel disiapkan secara preabsorbsi dengan melarutkannya dalam metanol dan DCM. Usahakan sampel harus benar-benar melarut pada fase gerak. Sampel yang telah larut dimasukkan merata ke dalam kolom kromatografi kemudian dielusi dengan fase gerak yang kepolarannya ditingkatkan secara bertahap. Pengelusi yang digunakan sebagai berikut:

Metanol : Diklormetana 1 : 9 400mlMetanol : Diklormetana 2 : 8 100mlMetanol : Diklormetana 2,5 : 7,5 100ml

Fraksi yang keluar ditampung dengan vial yang volumenya rata-rata 20ml, maka didapatkan dari perbandingan metanol : diklormetana 1 : 9 sebanyak 27 vial, perbandingan metanol : diklormetana2 : 8 sebanyak 6 vial sementara perbandingan fase gerak metanol : diklormetana 2,5 : 7,5 sebanyak 6 vial. Setelah itu tiap fraksi dimonitor dengan KLT menggunakan eluen metanol : diklormetan (2:8), (3:7), (2,5:7,5) dengan penampak bercak lampu UV 254 nm, reagennya amoniak dan sitrus borat. Fraksi dengan pola KLT yang sama atau besar Rf nya yang sama yakni 0,75 digabung yakni pada subfraksi vial 2-23 (1:9). Selanjutnya diuapkan dengan rotary evaporator dan ditimbang beratnya, didapat berat = 116,8 mg, senyawa hasil kolom ini dinamakan senyawa DSK. Kemudian vial 31-33 (2:8) digabung untuk fase gerak (3:7) dan vial 37-39 (2,5 :7,5) digabung untuk fase gerak (5:5). Namun untuk fase gerak kolom metanol : DCM dengan perbandingan (2:8) dan (2,5 :7,5) tidak diidentifikasi lebih lanjut.

Gambar 1. Profil KLT Hasil Elusi dari Kromatografi Kolom pada Fase Gerak Metanol : Diklormetana (DCM) (2:8)

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (Harborne, 1987)

7

Fraksi etil asetat yang telah didapatkan dari pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom pada perbandingan fase gerak metanol: diklormetana (1:9), dimana fraksi yang dikumpulkan memiliki Rf yang relatif sama digabung kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kering selanjutnya ditimbang didapatkan berat 116,8 mg, kemudian dilakukan dilakukan pemisahan lanjutan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni lagi, diambil sedikit dari ekstrak yang ada, dilarutkan dengan metanol. Kemudian ekstrak yang telah larut ditotolkan pada plat KLT dengan ukuran 6,5 x 6,5 cm. Bercak yang terbentuk berupa pita, dengan menggunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan dan dikembangkan dengan fase gerak untuk KLT preparatif ini adalah metanol: diklormetana dengan perbandingan 2: 8. Plat KLT yang telah terelusi dilihat dilampu UV dengan panjang gelombang 254 nm. Maka akan terlihat bercak berupa pita, kemudian dari plat KLT ini digunting sedikit untuk diuji penampak bercak dengan menggunakan iodium, amoniak, sitrus borat, FeCl3, pereaksi Dragendorff. Sebagiannya dikerok dari plat KLT, kemudian diekstraksi dengan fase gerak yang sama, lalu disaring dengan kaca masir. Hasil ekstraksi diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kering hasil pemisahan dengan kromatografi preparatif disebut dengan senyawa DS dengan berat 5,2 mg. Kemudian dihitung Rf nya maka didapatkan 0,7. Senyawa hasil isolasi berupa serbuk amorf berwarna putih-oranye.

Gambar 2. Profil KLT Preparatif

Tabel 6. Hasil Pengujian Metabolit Sekunder dari KLT Preparatif Pada Fase Gerak Metanol : Diklormetan (2:8) dengan Penampak Warna

Metabolit Sekunder Penampak Bercak HasilAlkaloid Pereaksi Dragendroff -

Flavonoid Sitrus Borat +Fenolik FeCl3 +

8

Gambar 3. Hasil Pengujian Metabolit Sekunder dari KLT Preparatif Pada Fase Gerak Metanol : Diklormetan (2:8) dengan Penampak Warna

Pengujian Antioksidan dari Hasil Elusi Fraksi Kromatografi KolomEkstrak etil asetat hasil dari fraksi kromatografi kolom (Senyawa DSK) dilakukan pengujian antioksidan dengan menggunakan metode DPPH, untuk menentukan IC50 dari senyawa yang sedikit lebih murni.Pembuatan Reagen DPPH

Serbuk DPPH ditimbang lebih kurang 9,8575 mg menggunakan timbangan analitik dimasukkan ke dalam labu ukur 250ml kemudian dilarutkan dalam 100 ml metanol destilat, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna violet. Kemudian metanol destilat diteteskan ke dalam labu hingga batas volume 250 ml. Labu ditutup rapat dengan penutupnya, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna violet, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100µM. Pengerjaannya dilakukan ditempat yang terlindung dari cahaya.

Penetuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPHLarutan DPPH yang telah dibuat dipipet sebanyak 3,8 ml dan ditambahkan 0,2

ml metanol mengunakan pipet mikro. Larutan DPPH dikocok pelan hingga homogen dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang terlindung dari cahaya. Larutan campuran DPPH dengan metanol dimasukkan ke dalam kuvet dan diuji serapannya menggunakan alat spektrofotometri dan serapan larutan diukur dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-800 nm. Maka didapatkan panjang gelombang 515,0 nm dengan Absorbansi 0,914.

Penentuan IC50 dari Fraksi Hasil Kromatografi Kolom (Senyawa DSK)Pembuatan Larutan Sampel

Senyawa DSK ditimbang sebesar 5 mg di dalam vial yang telah dinolkan pada timbangan analitik. Setelah itu dilarutkan dengan metanol 2,5 ml, vial digoyang sampai larutan uji telah homogen. Metanol diteteskan ke dalam vial hingga 5ml yang segera ditutup rapat. Vial dikocok secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual.Dilakukan pemipetan kedua sebanyak 2,5 ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial kedua dan dilarutkan dengan metanol hingga 5ml. Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi kelima. Konsentrasi larutan uji yang didapatkan dari kelima pengenceran tersebut adalah sebesar 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125 dan 0,015625 mg/ml. Senyawa pembanding digunakan vitamin C, dengan konsentrasi yang sama dengan larutan uji.

9

Penentuan Aktivitas AntioksidanDipipet 0,2 ml masing-masing larutan sampel dengan berbagai konsentrasi,

dimasukan kedalam vial, ditambah 3,8 ml larutan DPPH 100µM, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum DPPH yakni 515nm. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan sebanyak satu kali pengujian untuk masing-masing konsentrasi larutan sampel. Aktifitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui perhitungan persentasi inhibisi serapan DPPH, kemudian dihitung IC50 dengan menggunakan persamaan linier yang didapatkan dari perbandingan garis lurus antara konsentrasi dan persen inhibisi. Kemudian dilakukan perbandingan dengan senyawa pembanding vitamin C.

Tabel 7. Hubungan Konsentrasi Senyawa DS dengan Data Hasil Uji Antioksidan

Konsentrasi(ppm)

AbsorbansiPersen Peredaman

(%)Y Persamaan & R2

250 0,038 95,842Y = 0.218x + 44.42

R² = 0.961125 0,193 78,88462.5 0,39 57,33031.25 0,458 49,89015.625 0,495 45,842

Tabel 8. Hubungan Konsentrasi Vitamin C dengan Data Hasil Uji Antioksidan

Konsentrasi(ppm)

AbsorbansiPersen Peredaman

(%)Y Persamaan & R2

250 0,029 96,827y = 0.237x + 44.49

R² = 0.849125 0,115 87,41762,5 0,344 62,36331,25 0,423 53,71915,625 0,576 36,98

Spektrofotometri UV-VIS dan Spektrofotometri IRIdentifikasi Spektro UV-Vis dari Hasil KLT Preparatif

Sebanyak 1 mg senyawa DS dilarutkan dalam 5ml metanol, kemudian diukur serapannya dengan Spektrofotometri dengan panjang gelombang 200 sampai 800 nm. Dari pengukuran akan diketahui λ maks senyawa flavonoid.

Gambar 4. Spektrum UV-VIS Senyawa DS dari Daun Sirsak (Annona muricata L.) dalam Metanol

10

Identifikasi flavonoid murni dengan Spektrofotometri IRSebanyak 1 mg senyawa DS flavonoid/antosianin murni digerus dengan KBr

murni dalam lumpang, kemudian pelet KBr. Dari spektrum IR dapat dilihat bilangan gelombang semua pita serapan yang muncul, data spektrum IR senyawa kemudian dibandingkan dengan data referensi flavonoid.

Gambar 5. Spektrum IR Senyawa DS Daun Sirsak (A.muricata L.) dengan Pelet KBr

HASIL DAN PEMBAHASANTelah dilakukan isolasi sebuah senyawa antioksidan dari daun sirsak (Annona

muricata L.) yang diharapkan tidak menyebabkan penyakit parkinson. Proses ekstraksi dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut metanol. Sari metanol diuapkan dengan rotary evaporator, kemudian diencerkan dengan air dan kemudian difraksinasi berturut-turut dengan dengan n-heksan, diklormetana, etil asetat kemudian dengan diklormetana dalam suasana basa. Identifikasi senyawa metabolit sekunder pada masing-masing fraksi menggunakan kromatografi lapis tipis seperti terlihat pada Tabel 1 dan pengujian antioksidan dengan metode spektrofotometri VIS menggunakan pereaksi radikal DPPH seperti terlihat pada Tabel 2. Pemisahan senyawa pada fraksi aktif antioksidan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 dan fasa gerak campuran diklormetana : metanol dengan kepolaran meningkat dan KLT preparatif dengan fasa diam Silika gel GF254, dengan fasa gerak campuran diklormetana : metanol (2:8). Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan metoda spektrofotometri UV dan Spektrofotometri IR.

Uji aktifitas antioksidan ekstrak diklormetana, etil asetat, diklormetana dalam suasana basa menunjukkan IC50 berturut-turut 411,929, 30,282, dan 256,3ppm. Sedangkan identifikasi dengan KLT ekstrak diklormetana, etilasetat, diklormetana dalam suasana basa menunjukkan kandungan kimia golongan alkaloid, flavonoid dan fenolik.

Fraksi etil asetat yang mengandung flavonoid dan tidak mengandung alkaloid selanjutnya diisolasi dengan KLT preparatif dengan fasa diam Silika gel60 dan fasa gerak campuran diklormetana : metanol (8:2). Pita kromatogram dengan Rf 0,75 dikerok dan diekstraksi dengan metanol, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dan didapatkan suatu senyawa flavonoid berupa serbuk amorf dengan warna putih kekuningan. Spektrum UV flavonoid hasil isolasi dalam etanol menunjukkan λ maksimal 223 nm dan 279,5 nm. Sedangkan hasil spektrum IR menunjukan adannya gugus OH, gugus C-H, gugus C=O, gugus C=C, gugus C-O. Pengujian antioksidan senyawa hasil isolasi dengan metoda spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal DPPH menunjukkan IC50 25,6 ppm sedangkan IC50 dari senyawa pembanding vitamin C memberikan IC50 8,25 ppm.

11

Berdasarkan pengujian dengan penampak bercak sitrus borat, fraksi etil asetat mengandung senyawa flavonoid sedangkan dari data pola spektrofotometri UV dan spektrofotometri IR yang dihasilkan, kemudian dibandingkan dengan literatur, senyawa hasil isolasi termasuk senyawa flavonoid diduga golongan flavanon, dan memiliki aktivitas antioksidannya kuat.

KESIMPULAN1. Dari pemeriksaan pendahuluan metabolit sekunder pada daun sirsak (A.muricata

L.) menunjukan hasil positif alkaloid, flavonoid, fenolik.2. Hasil maserasi 1 kg daun sirsak (A.muricata L.) segar dengan metanol didapatkan

ekstrak kental 22,8 g. Ekstrak kental difraksinasi dengan n-heksan, diklormetana, etil asetat dan diklormetana dalam suasana basa, didapatkan ekstrak kering berturut-turut 1,4617, 1,1087, 2,074 dan 0,1366g.

3. Dari pengujian aktivitas antioksidan pada fraksi diklormetana, etil asetat dan diklormetana dalam suasana basa, didapatkan IC50 berturut-turut 411,929, 30,282, dan 256,3 ppm. Sehingga didapatkan fraksi etil asetat yang memiliki aktivitas antioksidan kuat (<50 ppm)

4. Fraksi etil asetat daun sirsak pada pengujian pendahuluan antioksidan memiliki aktivitas paling tinggi dari fraksi yang lain. Dengan IC50 = 30,282ppm. Sedangkan Fraksi etil asetat daun sirsak yang telah lakukan pemisahan dengan kromatografi kolom (senyawa DSK) memiliki aktivitas antioksidan kuat (<50 ppm) dengan IC50

= 25, 6ppm, sedangkan IC50 vitamin C=23,25ppm.5. Berdasarkan hasil identifikasi yang diperoleh dari spektrofotometri UV dan IR,

bahwa flavonoid senyawa DS dari daun sirsak (A. muricata L.) diduga senyawa golongan flavanon yang memiliki panjang gelombang maksimum 223 nm dan 279,5nm dan memiliki gugus fungsi OH, C=O, C=C, C-H, dan gugus fungsi C-O.

DAFTAR PUSTAKAArmala, M. M.. 2009. Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos

caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Djamal, Rusjdi. 2010. Prinsip-Prinsip Dasar Isolasi dan Identifikasi. Padang: Universitas Baiturrahman.

Culvenor, C. C. J, dan J. S, Fitzgerald. 1963. A Field Method for Alkaloid Screening of Plant. J. Pharm Sci.

Gritter,R.J., J.M. Bobbit, dan A. E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi, Terbitan kedua, diterjemahkan oleh Kosasih padmawinata. Bandung : ITB.

Harborne, J.B.. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terjemahan K.Padmawinata. Edisi II. ITB Press. Bandung: Halaman 76

Ideasanti. 1995. Telaah Senyawa Fenolik Daun Sirsak, Annona muricata L., Annonaceae. Dept. Farmasi ITB: Bandung.

McLaughlin.2008. Paw-paw and Cancer Annonaceous Acetogenin from Discovery to Comercial Products, Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Purdue University, 71(7):1311–1321.

Mohanty, Sambeet et al, Annona muricata (Graviola): Toxic or therapeutic, Natural Product Communications, 2008;3(1):31-33).

12

Simes, J. JH, et al. 1959. An Australian Phaytochemical Survey Saponins and Easter Australian Flowering Plant, Commonwealth Scintific and Industrial Research Organization.Australia

Youngson, Robert. 2005. Antioksidan : Manfaat Vitamin C dan E bagi Kesehatan. Jakarta : Arcan.

13