ACARA VIII

UJI CEMARAN MIKROBA :

ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR

(AKK)

A. TUJUAN

1. Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam

produk makanan.

2. Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh

mengandung mikroba melebihi batas yang ditetapkan karena

berbahaya (toksik) bagi kesehatan.

B. DASAR TEORI

Pertumbuhan kuman merupakan peningkatan umlah sel kuman yang

terjadi akibat peningkatan biomassa kuman yang teratur, pertumbuhan

kuman memerlukan lingkungan nutrisi yang cocok sehingga dapat

mendukung proses perkembangbiakan kuman. Konsentrasi sel kuman

dapat diukur dengan “perhitungan jumlah sel hidup” dengan cara

pengenceran yang diikuti dengan penentuan unit pembentukan koloni pada

permukaan media agar (Arthur, 1993).

Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi.

Kapang adalah fungi yang mempunyai filamen (miselium). Sedangkan

khamir adalah juga termasuk fungi, tapi yang dibedakan dari kapang

karena bentuknya yang terutama uniseluler. Reproduksi vegetatif khamir

dengan pertunasan dan dapat tumbuh lebih cepat daripada kapang. Khamir

lebih efektif memecah komponen kimia dibandingkang kapang karena

mempunyai perbandingan luas permukaan dengan volume yang lebih

besar. Khamir tidak dapat melakukan proses fotosintesis. Sel khamir

mempunyai ukuran sel yang bervariasi yaitu dengan panjang 1-

5mikrometer dan lebar 1-10 mikrometer. Bentuk sel khamir yaitu bulat,

oval, silinder, bulat panjang dengan salah satu ujung runcing, segitiga

melengkung berbentuk botol, bentuk apikulat dan lemon dan sebagainya

(Srikandi, 1992).

Uji angka lempeng total bertujuan untuk menunjukkan jumlah

mikroorganisme dalam suatu sediaan dengan metode hitungan cawan. Jika

sel masih dapat ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikrobia

tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat

langsung dilihat dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Cara

perhitungan koloni yaitu dengan memilih cawan yang ditumbuhi koloni

dengan jumlahnya berkisar antara 25 koloni – 250 koloni. Bila tiap cawan

memiliki tingkat pengenceran yang berbeda, tetapi memiliki jumlah koloni

seperti kisaran di atas, maka pilih cawan koloni dengan koloni yang

banyak. Kemudia gunakan tally counter untuk menghitung jumlah koloni.

Beri tanda pada koloni yang telah dihitung untuk menghindari perhitungan

ulang. Bila ada koloni yang menyebar dihitung sebaga isatu koloni. Akan

tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada cawan adalah koloni

yang menyebar, maka cawan tidak perlu dihitung. Perhitungannya (jumlah

koloni per ml sampel) adalah dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni

dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran.

Secara sistematis dapat dirumuskan sebagai berikut :

Faktor pengenceran = (pengenceran) x (jumlah yang ditumbuhkan)

Jumlah koloni = (jumlah koloni) x (1/faktor pengenceran) (Anonim,

2001).

Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan

bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang

ditentukan. Jenis populasi mikrobia dlama tanah, air, bahan makanan, dll.

Berbeda-beda tergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara

perhitungan jumlah mikrobia, yaitu perhitungan secara langsung (direct

method) dan secara tidak langsung (indirect method) (Jutono, 1980).

1. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Langsung

Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan

baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan

antara lain :

a. Menggunakan counting chamber

Perhitungan ini dapat memakan haemacytometer, Petroff-

Hausser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar

perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahan

atau biakan mikrobia pada alat terebut, ditutup dengan gelas

penutup kemudia diamat idengan mikroskop yang perbesarannya

tergantung pada besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan

jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui

volumenya dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia

tiap cc (Jutono, 1980).

b. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik

Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada

gelas benda : suspensi bahan atau biakan mikrobia yang telah

diketahui volumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luas

tertentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel

mikrobia tiap bidang pemandangan mikroskop. Luas bidang

pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis

tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda

seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan dapat diperoleh

jumlah mikrobia tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yang

hampir sama yang biasanya dipakai untuk menghitung jumlah

bakteri ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1

cc dara manusia; setelah tercampur homogen dibuat preparat

mikroskopik. Dari perbandingan jumlah rata-rata sel bakteri dan

jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah

bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal

rata-rata mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc (Jutono, 1980).

c. Menggunakan filter membran ( milliporefilter )

Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi

bahan atau biakan mikroba kemudian disaring dengan filter

membran yang telah disterilkan. Dengan menghitung jumlah sel

rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung

jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kalau perhitungan

secara biasa sukar, perlu dilakukan pengecatan pada filter

membran, kemudia filter membran dijenuhi dengan minyak imersi

supaya dapat menjadi trasparan (Jutono, 1980).

2. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Tidak Langsung

a. Menggunakan sentrifuge

Caranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge dengan

memakai sentrifuge yang biasa dipakai untuk menentukan jumlah

butir-butir darah. Supaya hasilnya dapat dipertanggungjawabkan,

maka kecepatan dan waktu sentrifugasi harus diperhatikan. Setelah

diketahui volume mikrobia keseluruhan makan dapat dipakai untuk

menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagi

volume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sel

mikrobia (Jutono, 1980).

b. Berdasarkan kekeruhan

Dasar penentuan cara ini ialah jika seberkas sinar dilewatkan

pada suatu suspensi mikrobia makan makin pekat (keruh) suspensi

tersebut makin besar intensitas sinar yang diabsorpsi sehingga

intensitas sinar yang diteruskan makin kecil. Untuk keperluan ini

dipakai alat-alat seperti photoelectric turbidimeter :

electrophotometer; spectrophotometer; nephelometer dan alat lain

yang sejenis. Alat tersebut memakai sinar monokromatik dengan

panjang gelombang tertentu. Dengan membaca persentase sinar

yang diabsorpsi atau sinar yang diteruskan dan dibandingkan

dengan suspensi standar mikrobia sama yang telah diketahui

jumlahnya tiap cc. Alat yang paling sederhana untuk penentuan

tersebut ialah komparator blok, tapi penggunaan alat ini

kesalahannya sangat besar sebab cara pengamatannya hanya

memakai mata biasa (Jutono, 1980).

c. Menggunakan penghitung elektronik ( electronic counter )

Alat ini dapat menentukan beribu-ribu sel tiap detik secara

tepat. Prinsip kerjanya ialah adanya gangguan-gangguan pada

aliran ion-ion (listrik) yang bergerak di antara kedua elektrode.

Penyumbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yang

terdapat di antara kedua elektrode itu menyebabkan terputusnya

aliran listrik. Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu

dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung

mikrobia merupakan ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut

(Jutono, 1980).

d. Berdasarkan analisa kimia

Cara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia.

Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianya

secara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan

umummnya ialah kandungan protein : asam-asam nukleat (DNA

dan RNA) atau fosfor dari asam-asam nukleat, dan sebagainya

(Jutono, 1980).

e. Berdasarkan berat kering

Cara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur

benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat

kering suatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-

sel yang dapat dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia (Jutono,

1980).

f. Menggunakan cara pengenceran

Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah

mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah

mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau

biakan mikroba secara bertingkat. Seletah diinokulasikan ke dalam

medium dan diinkubasikan dilihat adanya pertumbuhan mikrobia.

Misalnya suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10 pada

pengenceran 1 : 1000 ada pertumbuhan tetapi pada pengenceran 1 :

10000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoretis jumlah

mikrobia pada suspensi bahan atau biakan mikrobia antara 1000

dan 10000 tiap cc (Jutono, 1980).

g. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)

Cara di atas kurang tepat mengingat tidak semua mikrobia

dapat tumbuh dalam suatu medium pada keadaan tertentu. Untuk

mengatasinya makan tiap pengenceran dibuat beberapa ulangan,

hasilnya secara matematik dapat untuk menentukan kemungkinana

besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspensi bahan

tersebut. Cara ini dikenal sebagai Most Probable Number (jumlah

mikrobia yang paling mungkin). Untuk penentuan jumlah mikrobia

yang paling mungkin digunakan daftar Most Probable Number

misalnya daftar HOSKINS atau daftar MC.CRADY (Jutono, 1980).

h. Berdasarkan jumlah koloni ( plate count )

Cara ini yang paling umum dipakai untuk perhitungan jumlah

mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan

dengan keliapatan 10; dari masing-masing pengenceran diambil 1

cc dan dibuat taburan dalam petridish (pour plate) dengan medium

agar yang macam dan caranya tergantung pada jenis mikrobia.

Setelah diinkubasikan, dihitung jumlah koloni tiap petridish dari

masing-masing pengenceran. Dari jumlah koloni dengan kebalikan

pengencerannya, misalnya untuk pengenceran 1 : 10000 terdapat

45 koloni bakteri maka tiap cc atau gram bahan mengandung

450000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam

petridish dapat digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi

dengan electronic register. Pada perhitungan dengan cara ini ada

beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain :

Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika

memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang

jumlahnya mendekati 300.

Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas

petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.

Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang

berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan

pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari dua

hasilnya maka di rata-rata; tapi jika lebih besar dari dua yang

dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya.

Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya di rata-

rata (Jutono, 1980).

C. PROSEDUR KERJA

1. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

Alat dan Bahan

a. Media Plate Count Agar (PCA)

b. Buffered Pepton Water (BPW)

c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam

kemasan pabrik)

d. Pipet volume

e. Colony Counter (alat hitung koloni)

f. Cawan mortir steril

g. Gelas arloji steril

h. Sendok steril

Cara Kerja

a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan

Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan

alkohol 70%

Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar

tercipta suasana aseptis

Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk

makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku,

dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan

b. Pembuatan media PCA sesuai dengan yang tertera

pada kemasan

c. Pengujian sampel

Sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yang

tidak dalam kemasan yang bisa dihancurkan dengan

menggunakan mortir steril. Timbang @ 5 gram

menggunakan gelas arloji steril secara aseptis

Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanan

dibersihkan, dicuci/dilap dengan alkohol 70 %, bagian

tutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dan

kemudian dibuka secara aseptis

d. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel

Dengan cara aseptik timbang 5 gram atau 10 gram masing-

masing sampel makanan yang telah dihaluskan dengan

mortir, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW,

kocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan

pengenceran 10-1. (Berat sampel/bahan bisa disesuaikan

dengan kebutuhan).

Siapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 ml

BPW.

Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I,

kocok sampai homogen.

Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, kocok

sampai homogen

Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan masukkan ke dalam

tabung III, kocok sampai homogen. Dengan demikian

pengenceran yang diperoleh adalah 10 -2, 10 -3, 10 -4.

e. Uji ALT

Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut,

pipet 1 ml dan tuangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah

dicairkan (suhu 45-55 oC).

Tuangkan ke dalam cawan petri steril, goyang sampai

homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa

hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate).

Percobaan dibuat duplo.

Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji

kontrol. Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatan

kontrol kontaminasi media. Caranya : ke dalam satu cawan

petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol

pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW ke

dalam media PCA, biarkan memadat.

Biarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar

selama 24 jam.

Amati hasil dan hitung jumlah koloni kuman yang tumbuh.

dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang

menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni. Jumlah

koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan

dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai

Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram contoh

bahan (jumlah bakteri per ml sampel : CFU/ml sampel).

Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir

dalam lampiran 2.

Bandingkan hasil angka ALT yang diperoleh dengan

literatur tentang persyaratan ALT pada makanan yang

ditetapkan berdasarkan SNI.

2. UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

Alat dan Bahan

a. Media Malt Extract Agar (MEA)

b. Buffered Pepton Water (BPW)

c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam

kemasan pabrik)

d. Kloramfenikol 100 mg/liter media

Pembuatan larutan kloramfenikol : 1 gram kloramfenikol

dalam 100 ml air suling steril

e. Pipet volume

f. Colony Counter (alat hitung koloni)

g. Cawan mortir steril

h. Gelas arloji steril

i. Sendok steril

Cara Kerja

a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan

Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan

alkohol 70%

Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar

tercipta suasana aseptis

Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk

makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku,

dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan

b. Pembuatan media MEA (Malt Extract Agar) sesuai

dengan yang tertera pada kemasan

c. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel

Perhitungan Angka Kapang Khamir (AKK) bertujuan untuk

menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang

terdapat dalam bahan. Pada prinsipnya pengujian ini

menggunakan metode yang sama dengan penentuan Angka

Lempeng Total (ALT).

Media pertumbuhan yang digunakan adalah MEA (Malt

Extract Agar)

d. Uji AKK

Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA

ditambah dengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml

ditambah 0,5 ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram

antibiotik dalam 100 ml air suling steril).

Metode pour plate : ambil 15 ml MEA suhu 45-50 oC

dalam tabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol)

dan tambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceran

sampel makanan. Tuangkan ke dalam cawan petri steril,

goyang sampai homogen dengan cara memutar petri

sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode

pour plate).

Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi

pada suhu 20-25oC dan diinkubasi 24-48 jam.

Saat pengamatan, catat jumlah koloni jamur yang tumbuh.

Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya

bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri. Koloni

kapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir

berwarna putih dan licin (berbau asam). Lempeng agar

yang diamati adalah lempeng di mana terdapat 10-150

koloni kapang/khamir. Jumlah total koloni dari kedua

cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor

pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang

Khamir (AKK) dalam tiap gram atau ml contoh bahan

Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir

dalam lampiran 2.

Bandingkan hasil angka AKK yang diperoleh dengan

literatur tentang persyaratan AKK pada makanan yang

ditetapkan berdasarkan SNI.