modul praktikum teknologi kultur jaringan...kultur jaringan tanaman atau yang dikenal dengan nama...
TRANSCRIPT
MODUL PRAKTIKUM
TEKNOLOGI KULTUR JARINGAN
OLEH:
RINDANG DWIYANI
HESTIN YUSWANTI
DEWA NYOMAN NYANA
GEDE WIJANA
PRODI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS UDAYANA
SEMESTER GANJIL 2017/2018
ii
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha
Kuasa atas tersusunnya Modul Petunjuk Praktikum untuk mata
kuliah Teknik Kultur Jaringan Tanaman , mata kuliah pilihan
yang diberikan di Jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian
Universitas Udayana.
Mata kuliah Teknik Kultur Jaringan memberikan teori
sekaligus memberikan kesempatan kepada mahasiswa untuk
menerapkan teori tersebut dalam praktek, sehingga setelah
menyelesaikan mata kuliah ini dalam satu semester, akan
terpenuhi capaian pembelajaran yaitu mahasiswa memiliki
kompetensi dalam perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro,
yang nantinya dapat diterapkan dalam kehidupan di masyarakat .
Modul praktikum membahas secara rinci dari pengenalan
alat hingga praktek perbanyakan. Komoditi yang digunakan
dapat disesuaikan dengan kebutuhan, namun prinsip dasar kultur
sama, yakni menjaga sterilitas karena kondisi steril merupakan
syarat keberhasilan dalam pekerjaan kultur jaringan.
Tentunya tulisan ini masih jauh dari sempurna, kritik dan
saran kami harapkan untuk penyempurnaan tulisan ini. Tak lupa
kami ucapkan terimakasih kepada semua pihak yang membantu
penulisan, layout hingga terjilidnya tulisan ini.
Denpasar, 1 September 2017
Penulis
iii
DAFTAR ISI
PRAKATA .................................................................................. ii
DAFTAR ISI .............................................................................. iii
DAFTAR GAMBAR ................................................................. iv
TOPIK 1. PERALATAN KULTUR JARINGAN ...................... 1
TOPIK 2. STERILISASI ALAT DENGAN AUTOKLAF ...... 15
TOPIK 3. PEMBUATAN MEDIA KULTUR .......................... 18
TOPIK 4. PERSILANGAN ANGGREK.................................. 26
TOPIK 5. KULTUR BIJI ANGGREK ..................................... 29
TOPIK 6. SUBKULTUR .......................................................... 33
TOPIK 7. KULTUR ORGAN TANAMAN ANGGUR (Vitis
vinifera L.) ................................................................ 36
TOPIK 8. KULTUR TANGKAI BUNGA ANGGREK
PHALAENOPSIS ..................................................... 40
DAFTAR REFERENSI ............................................................ 45
iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Autoklaf yang menggunakan daya kompor (A); dan
daya listrik (B) ........................................................... 2
Gambar 2. Timbangan (balance)................................................. 5
Gambar 3. Magnetic stirrer ......................................................... 7
Gambar 4. Oven .......................................................................... 8
Gambar 5. Meja Kerja Steril; Enkas (A) dan Laminar (B) ....... 11
Gambar 6. Rak Kultur ............................................................... 12
Gambar 7. Persilangan pada Tanaman Anggrek ....................... 27
Gambar 8. Buah hasil persilangan; Anggrek Phalaenopsis
amabilis (A) dan Vanda tricolor (B) ........................ 30
Gambar 9. Penaburan biji anggrek secara in vitro .................... 32
Gambar 10. Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis L.) .......... 41
1
TOPIK 1. PERALATAN KULTUR JARINGAN
Tujuan
Memperkenalkan kepada mahasiswa alat-alat standar yang
digunakan pada Laboratorium kultur jaringan tanaman.
Dasar Teori
Kultur jaringan tanaman atau yang dikenal dengan nama
kultur in- vitro adalah suatu teknik untuk menumbuhkan sel,
jaringan atau organ tanaman pada media buatan yang
mengandung hara secara aseptik di laboratorium.
Kondisi aseptik ini merupakan syarat mutlak agar
pekerjaan kultur dapat berjalan dengan baik dan berhasil. Untuk
itu maka diperlukan alat-alat khusus untuk mendukung kondisi
aseptik tersebut. Peralatan dalam kultur jaringan digunakan
untuk melaksanakan pekerjaan kultur jaringan, dari sterilisasi,
penanaman dan inkubasi kultur. Beberapa diantaranya, yang
penting dan wajib dimiliki oleh setiap laboratorium kultur
jaringan adalah : autoklaf, timbangan (balance), magnetic stirrer,
meja kerja steril, shaker dan rak kultur.
1. Autoklaf (Autoclaves)
Deskripsi
Autoklaf adalah alat untuk sterilisasi dengan metode uap
panas (steam heating). Ada dua jenis jika dilihat dari daya yang
digunakan. Yang pertama adalah autoklaf yang menggunakan
2
kompor dan yang kedua adalah autoklaf yang menggunakan
daya listrik (Gambar 1). Keduanya memiliki cara kerja yang
sama dalam proses sterilisasi.
Gambar 1. Autoklaf yang menggunakan daya kompor (A);
dan daya listrik (B)
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Autoklaf dilengkapi dengan “sarangan” seperti pada
dandang untuk mengukus. Pada sarangan ini diletakkan benda
yang akan disteril. Sementara pada dandang (dibawah sarangan)
diisi dengan air untuk menghasilkan uap, mirip seperti dandang
pengukus.
Autoklaf mensterilisasi dengan metode steam heating
(pemanasan dengan uap). Pertama alat/bahan yang akan
disterilisasi dibungkus dengan kertas atau plastik yang tahan
A B
3
panas. Selanjutnya alat/bahan tersebut diletakkan dalam
sarangan (panci autoklaf), sementara di bawah sarangan diberi
air, kemudian tutup autoklaf ditutup rapat, katup dibiarkan
terbuka dan dihubungkan dengan sumber tenaga. Autoklaf
kompor dipanaskan diatas kompor, yang dengan listrik
dihubungkan dengan sumber listrik. Setelah beberapa lama, uap
akan keluar dari katup, sebagai penanda bahwa air didalamnya
sudah panas dan mendidih. Pada saat itu, maka katup ditutup
agar tekanan dan suhu di dalam autoklaf dapat naik dengan
cepat. Suhu akan naik sekitar 121oC dan tekanan 17.5 Psi.
Kondisi ini dipertahankan sesuai waktu yang dibutuhkan untuk
sterilisasi, misalnya untuk sterilisasi media diperlukan 30 menit,
sedangkan untuk sterilisasi alat membutuhkan waktu 60 menit.
Dalam kurun waktu itu, uap panas di dalam autoklaf akan
memanaskan dan mematikan mikroorganisme yang ada. Setelah
mencapai waktu yang dibutuhkan, autoklaf dilepaskan dari
sumber tenaga (kompor/listrik). Selanjutnya katup dibuka secara
perlahan, agar suhu turun secara perlahan pula. Tutup autoklaf
boleh dibuka jika suhu/tekanan sudah mencapai nol.
Selanjutnya, alat/bahan didalamnya dapat dikeluarkan secara
hati-hati. Perlu diperhatikan bahwa pembukaan tutup autoklaf
yang dilakukan sebelum suhu/tekanan mencapai nol dapat
menyebabkan air meluap keluar dan sangat berbahaya bagi
pengguna.
Perlu diperhatikan, senyawa yang bersifat themo sensitive
atau rusak karena proses pemanasan dengan autoklaf seperti zat
4
pengatur tumbuh dan antibiotik. Senyawa tipe ini ditambahkan
pada media setelah proses autoklafing selesai namun sebelum
media mengental. Senyawa-senyawa tersebut harus disteril
terlebih dahulu dengan proses filtering menggunakan filter
syringe.
2. Timbangan (Balance)
Deskripsi
Timbangan (balance) beragam jenisnya, namun yang
sering digunakan adalah timbangan digital. Fungsinya secara
umum adalah untuk menghitung satuan massa suatu benda
dengan teknik digital (Gambar 2). Dalam lab kultur, alat ini
digunakan untuk menimbang bahan/zat yang digunakan dalam
kultur, misalnya zat pengatur tumbuh, bahan untuk media, gula,
agar, dan lain sebagainya.
Sebelum menimbang, spesifikasi timbangan yang akan
digunakan harus diperhatikan terlebih dahulu. Misalnya,
maksimum batas timbang, maksimum digit desimal dalam
dalam penimbangan serta letak tombol-tombol yang diperlukan.
Umumnya, setiap timbangan memiliki tombol “zero” yaitu
tombol untuk menjadikan angka bergerak ke arah nol secara
digital.
5
Gambar 2. Timbangan (balance)
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Secara umum, cara penggunaan timbangan adalah sebagai
berikut. Hubungkan timbangan dengan sumber listrik. Tekan
tombol “on” untuk menyalakan timbangan. Nolkan terlebih
dahulu timbangan sebelum digunakan dengan jalan menekan
tombol “zero”. Selanjutnya letakkan alas timbang (misalnya
wadah plastik, kertas atau aluminium foil) yang akan diletakkan
zat/senyawa di atasnya. Setelah itu tekan kembali tombol “zero”
kembali agar angka pada timbangan menunjukkan angka nol
kembali. Setelah itu letakkan senyawa/zat yang akan ditimbang
dan catat angka pada timbangan. Setelah digunakan timbangan
harus dibersihkan kembali dan disimpan/diletakkan dalam
kondisi tidak terhubung dengan sumber listrik.
6
3. Magnetic Stirrer
Deskripsi
Magnetic stirrer digunakan untuk proses pembuatan
media, yaitu untuk pemanasan (heating) dan pengadukan
(stirring) (Gambar 3). Dengan fungsi tersebut maka alat ini
dilengkapi dengan dua tombol putar, yakni tombol “stirrer”
(pengaduk) dan tombol “heat” (untuk pemanasan). Magnetic
stirrer dilengkapi dengan magnet pengaduk yang berputar dalam
wadah (gelas ukur, dsb yang ditaruh diatas magnetic stirrer)
jika tombol “stirrer” diputar ke kanan. Kecepatan magnet
berputar dapat diatur sesuai skala (nomor) yang tertera, semakin
besar skala, semakin cepat magnet berputar.
Dalam pembuatan media proses pengadukan sangat
diperlukan untuk membuat media menjadi homogen. Selain
tombol “stirrer”, juga ada tombol “heating”, yaitu tombol yang
berfungsi untuk memanaskan. Jika tombol “heating” diputar ke
kanan, maka suhu larutan/senyawa dalam wahah meningkat.
Seperti halnya tombol “stirrer”, tombol “heating” juga
dilengkapi dengan skala, yang semakin tinggi suhunya jika
skala nomor semakin besar. Pemanasan larutan media kultur
diperlukan hingga suhu mencapai kurang lebih 80oC.
7
Gambar 3. Magnetic stirrer
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Sebelum digunakan, dipastikan dulu bahwa alat dapat
berfungsi dengan baik. Jika untuk pembuatan media, cara
kerjanya adalah sebagai berikut. Magnetic stirrer dihubungkan
dengan sumber listrik. Wadah berisi sedikit air ditaruh diatas
magnetic. Bahan-bahan media dimasukkan satu persatu sambil
mengaktifkan tombol stirrer sehingga bahan tersebut dapat larut.
Setelah senyawa semua larut, magnet diambil (stirrer dimatikan
pada saat pengambilan magnet). Setelah itu ditambahkan
aquades sampai mencapai volume media yang diinginkan,
kemudian pH diukur dan disesuaikan menjadi 5.6-5.8 dengan
jalan menambahkan beberapa tetes NaOH 1M (jika pH rendah)
atau HCl 1M (jika pH tinggi). Terakhir ditambahkan pemadat
dan tombol “heating” diaktifkan untuk pemanasan media hingga
8
mencapai 80oC. Setelah itu,media dituang dalam botol-botol
kultur, ditutup rapat, kemudian diautoklaf.
4. Oven
Deskripsi
Khususnya untuk laboratorium kultur jaringan, oven
digunakan sebagai alat untuk sterilisasi. Sterilisasi dengan oven
hanya bisa untuk alat-alat kecil dan glasswares dan tidak bisa
untuk sterilisasi media. Di dalam laboratorium, oven diletakkan
di ruang preparasi. Metode sterilisasi dengan oven dikenal
dengan dry heating, karena proses sterilisasi menggunakan
udara kering yang panas. Ada banyak ragam oven, namun satu
diantaranya dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Oven
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
9
Cara Kerja
Semua alat atau glasswares yang akan disterilisasi
dibungkus dengan kertas atau aluminium foil, selanjutnya
dimasukkan ke dalam oven. Oven ini menggunakan daya listrik,
dilengkapi dengan pengatur suhu dan waktu, sehingga proses
sterilisasi bisa dilakukan dengan menekan tombol sesuai dengan
kebutuhan. Angka yang menunjukkan suhu dan waktu
pengovenan akan terbaca secara digital. Setelah selesai proses
pengovenan, hendaknya oven dibersihkan dan tersimpan dalam
keadaan tidak terkoneksi dengan listrik.
5. Meja Kerja (Enkas; Laminar)
Deskripsi
Meja kerja steril digunakan dalam penanaman (inkubasi)
kultur. Ada dua jenis, yang bersifat konvensional disebut enkas
(Gambar 5 A), sedangkan yang lebih modern adalah laminar
(Gambar 5 B). Enkas tidak menggunakan sumber listrik, kecuali
lampu neon yang menempel pada kaca enkas untuk penerang.
Enkas terbuat dari bahan kaca dan kayu dengan dua lubang di
bagian depan seukuran tangan pekerja. Lubang ini disertai tutup
untuk mencegah kontaminasi. Laminar menggunakan sumber
listrik, terbuat dari bahan logam dan kaca. Laminar dilengkapi
dengan tombol “power‟ untuk mengaktifkan laminar, tombol
“UV” untuk ultra violet, tombol “lamp” untuk lampu serta
tombol “fan” untuk menyalakan kipas / blower.
10
Cara Kerja
Bagian dalam enkas dan laminar dilengkapi dengan meja
kerja, tempat untuk meletakkan peralatan kultur selama proses
penanaman. Cara kerja enkas adalah sebagai berikut. Sebelum
digunakan, bagian dalam enkas dilap dengan alkohol 70%
dengan menggunakan tissue/lap steril (tissue/lap yang sudah
disteril dengan autoklaf). Tangan pekerja disemprot dengan
alkohol dan masuk melalui lubang di bagian depan enkas ketika
melakukan pengelapan. Semua bahan/alat yang akan digunakan
disemprot dengan alkohol sebelum dimasukkan ke dalam enkas.
Selanjutnya pekerjaan dapat dimulai. Enkas banyak digunakan
pada usaha pembuatan seedling anggrek dalam botol. Perlu
diingatkan bahwa penggunaan enkas tidak boleh menggunakan
lampu bunsen, Adanya residu uap alkohol dalam enkas dapat
menyebabkan enkas meledak jika terkena api dan dapat
mencederai pengguna.
Cara kerja laminar adalah sebagai berikut. Laminar
dihubungkan dengan sumber listrik dan tombel “power” ditekan
untuk mengaktifkan alat. Lampu UV dinyalakan dengan jalan
menekan tombol UV. Lampu UV tujuannya untuk membunuh
mikroorganisme yang ada dalam laminar, dinyalakan selama
minimal 15 menit sebelum laminar digunakan. Selanjutnya,
lampu UV dimatikan, pintu laminar dibuka, kemudian lampu
biasa (tombol “lamp”) dinyalakan dan fan/blower diaktifkan.
Selanjutnya meja dibersihkan lagi dengan alkohol 70%, semua
alat/bahan yang digunakan untuk penanaman juga disemprot
11
dengan alkohol dan dimasukkan ke dalam laminar. Selanjutnya
pekerjaan dapat dimulai. Yang perlu diperhatikan bahwa tangan
pekerja harus senantiasa menggunakan glove/sarung tangan dan
selalu disemprot dengan alkohol. Setelah pekerjaan selesai,
semua barang dikeluarkan dari laminar, meja dibersihkan (dilap)
dengan alkohol, pintu laminar ditutup, blower dan lampu
dimatikan dan lampu Uv kembali dinyalakan selama kurang
lebih 15 menit. Setelah itu, lampu UV dan power dimatikan,
lepaskan dari sumber listrik.
Gambar 5. Meja Kerja Steril; Enkas (A) dan Laminar (B)
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
6. Rak Kultur
Deskripsi
Rak kultur merupakan tempat untuk meletakkan eksplan
setelah ditanam pada media steril dan menumbuhahkannya
12
hingga menjadi plantlet. Rak kultur diletakkan dalam ruang
kultur. Semua proses morfogenesis hingga terbentuknya plantlet
berlangsung di ruang kultur pada rak kultur (Gambar 6).
Gambar 6. Rak Kultur
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
7. Glasswares dan peralatan kecil lainnya
Glasswares adalah semua peralatan kecil yang terbuat dari
bahan gelas seperti gelas ukur, gelas dan labu Erlenmeyer, serta
botol kultur. Alat-alat ini dapat disterilisasi dengan oven
maupun dengan autoklaf. Alat-alat ini harus dibungkus dengan
kertas saat sterilisasi agar kondisi steril tetap terjaga sampai alat
13
tersebut digunakan. Botol-botol bekas seperti botol selai, botol
minuman dan botol infus yang terbuat dari bahan gelas dapat
digunakan untuk botol kultur.
Peralatan kecil lainnya terdiri dari dissecting kit (perataan
untuk memotong/mengiris), pinset, spatula dan lain-lain yang
umumnya terbuat dari bahan logam (stainlessteel). Spatula
merupakan pengaduk atau digunakan untuk mengambil bahan
berupa serbuk. Pinset digunakan untuk memegang / menjepit
benda, umumnya digunakan pada saat penanaman eksplan.
Scalpel adalah gagang pisau yang dalam penggunaannya
berpasangan dengan blade (pisau). Gunanya adalah untuk
mengiris/memotong, dalam hal ini bahan eksplan yang akan
ditanam. Bagian pisau dijual secara terpisah dari scalpel
(gagang)nya dan sudah dalam keadaan steril. Pisau steril ini
bersifat sekali pakai. Peralatan kecil dari bahan logam ini juga
harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi. Sterilisasi dapat
dilakukan dengan oven maupun dengan autoklaf.
Bahan Diskusi
Perhatikan dengan seksama alat-alat tersebut dan pelajari cara
kerjanya, kemudian jawab pertanyaan berikut:
- Mengapa sebelum menimbang zat harus mengetahui
kapasitas timbangan yang digunakan?
- Apa fungsi dari magnetic stirrer, autoklaf dan laminar?
Bagaimana cara kerjanya?
14
- Apa beda enkas dan laminar? Sebutkan bagian penting
dari alat-alat tersebut dan jelaskan fungsinya.
- Sebutkan alat untuk sterilisasi: a. media; b. alat-alat kecil
seperti pinset, scalpel, spatula, dan sebagainya.
- Apa yang dimaksud dengan sterilisasi dengan metode
steam heating dan dry heating?
15
TOPIK 2. STERILISASI ALAT DENGAN AUTOKLAF
Tujuan
1. Memperkenalkan kepada mahasiswa cara mensterilisasi alat
dalam teknik perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan.
2. Mahasiswa mampu mensterilisasi alat yang digunakan
dalam teknik perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan
Dasar Teori
Kondisi steril merupakan syarat utama keberhasilan
praktik teknik kultur jaringan baik untuk tujuan perbanyakan
tanaman maupun tujuan lainnya seperti transformasi genetik.
Kondisi steril / aseptik berarti bebas mikroorganisme. Dengan
demikian, semua alat yang akan digunakan dalam proses kultur
harus dalam kondisi aseptik / steril. Untuk itulah diperlukan
sterilisasi terhadap semua alat yang akan digunakan seperti
pinset, spatula, botol kultur, gelas ukur, scalpel, (dan lain
sebagainya ).
Proses sterilisasi diawali dengan langkah persiapan yakni
pengemasan alat alat yang akan disteril. Alat-alat tersebut harus
dalam keadaan terbungkus saat disteril maupun setelah disteril,
untuk menghindarkan alat dari ekspose terhadap
mikroorganisme, sehingga ketika digunakan tetap dalam kondisi
steril.
16
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
- Autoklaf sebagai alat pensterilisasi
- Alat-alat yang akan disterilisasi, seperti botol kultur, alat
tanam (pinset, scalpel), gelas ukur, aquades
- Plastik, kertas coklat, karet gelang, aluminium foil
Cara Kerja
- Bungkus alat-alat seperti botol kultur, gelas ukur dan
aquades (dalam wadah) dengan plastik dan diikat dengan
karet gelang.
- Karet gelang, plastik dan aluminium foil (untuk tutup botol
kultur) disiapkan dalam wadah dan ditutup dengan plastik
dan diikat dengan karet gelang.
- Alat tanam dibungkus dengan kertas coklat.
- Masukkan alat alat yang sudah siap tersebut dalam autoklaf,
diletakkan dalam sarangan (panci autoklaf), sementara di
bawah sarangan diberi air, kemudian tutup autoklaf ditutup
rapat, katup dibiarkan terbuka dan dihubungkan dengan
sumber tenaga.
- Autoklaf kompor dipanaskan diatas kompor, yang dengan
listrik dihubungkan dengan sumber listrik.
- Setelah beberapa lama, uap akan keluar dari katup, sebagai
penanda bahwa air didalamnya sudah panas dan mendidih.
Pada saat itu, maka katup ditutup agar tekanan dan suhu di
dalam autoklaf dapat naik dengan cepat.
- Suhu akan naik sekitar 121oC dan tekanan 17psi.
17
- Kondisi ini dipertahankan sesuai waktu yang dibutuhkan
untuk sterilisasi, misalnya untuk sterilisasi media diperlukan
30 menit, sedangkan untuk sterilisasi alat membutuhkan
waktu 60 menit.
- Setelah mencapai waktu yang dibutuhkan autoklaf
dilepaskan dari sumber tenaga (kompor/listrik).
- Selanjutnya katup dibuka secara perlahan, agar suhu turun
secara perlahan pula.
- Tutup autoklaf boleh dibuka jika suhu/tekanan sudah
mencapai nol. Selanjutnya, alat/bahan didalamnya dapat
dikeluarkan secara hati-hati.
- Simpan alat-alat yang sudah disteril tersebut pada ruang
khusus untuk penyimpanan alat/bahan steril.
Bahan Diskusi
- Mengapa kondisi steril senantiasa harus dijaga dalam
pekerjaan kultur jaringan?
- Apa akibatnya jika alat-alat yang digunakan tidak steril?
- Apa saja yang bisa menjadi sumber kontaminan dalam
kultur jaringan?
18
TOPIK 3. PEMBUATAN MEDIA KULTUR
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dalam
pembuatan media kultur.
Dasar Teori
Eksplan (berupa jaringan atau organ) yang ditumbuhkan
secara in vitro pada media buatan, juga membutuhkan hara
untuk terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan. Secara umum
media buatan tersebut mengandung :
- Hara makro: nitrogen (N), posfor (P), kalium (K), kalsium
(Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).
- Hara mikro: ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn),
cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo).
- Gula: Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber
karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat
heterotrof atau tidak dapat melakukan fotosintesis untuk
menghasilkan karbohidrat.
- Vitamin: Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator
dalam berbagai proses metabolisme. Vitamin digunakan
untuk pertumbuhan sel dan proses diferensiasi sel dan
jaringan yang ditanam secara in vitro. Beberapa jenis
vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah
thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine.
19
- Myo-inositol: Myo-inositol adalah senyawa golongan
karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam
jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel untuk
banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong
vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin
C dan pectin.
- Zat pengatur tumbuh: Umumnya ada dua golongan zat
pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-
vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin.
- Pemadat media: Media kultur diberi pemadat, dapat berupa
agar, bioagar atau gellan gum. Penambahan senyawa
pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat
maupun semi padat.
- Asam amino: Asam amino tidak selalu harus ditambahkan
pada media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan
kultur protoplas.
- Senyawa organik alami: Senyawa organik alami seperti air
kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat, ekstrak pisang,
ekstrak kentang dan lain sebagainya seringkali ditambahkan
pada media kultur untuk menstimulasi pertumbuhan
sel/jaringan kultur. Kebutuhan akan jenis dan jumlahnya
tergantung spesies tanamannya.
Unsur/senyawa tersebut kini sudah tersedia dalam bentuk
kemasan jadi yang kita sebut sebagai media dasar. Dikenal ada
20
beberapa media dasar yang umumnya digunakan dalam kultur in
vitro, diantaranya adalah media MS (Murashige dan Skoog),
Knudson, VW (Vacin dan Went), dan NP (New Phalaenopsis).
Dalam praktikum kali ini akan dilakukan pembuatan 2
macam media dengan menggunakan media dasar MS. Yang
pertama adalah media untuk menumbuhkan biji atau subkultur
protokorm anggrek dan yang kedua adalah media untuk kultur
organ anggrek yakni menginduksi organogenesis. Pada media
pertama, dilakukan penambahan 100 gram tomat per liter media;
sedangkan pada media yang kedua dilakukan penambahan
0,01ppm NAA dan 5 ppm BAP. Jumlah NAA dan BAP yang
dipipet untuk satu liter media tergantung pada larutan stok ZPT
tersebut yang tersedia.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
Alat:
- Gelas Ukur ukuran 2 L
- Magnetic stirrer yang dilengkapi dengan pemanas
- Timbangan analitik
- Botol botol kultur yang sudah steril
- Tutup botol kultur yang dapat berupa karet, plastik atau
aluminium foil
- Autoklaf untuk sterilisasi
- pH indicator
21
Bahan / Senyawa:
- Media Kemasan jadi MS
- Buah tomat yang masak
- ZPT : NAA, BAP
- Sukrosa
- Pemadat
- Aquades
- Larutan KOH atau HCl
Cara Kerja
Cara membuat satu liter media tanam untuk biji anggrek
sama dengan membuat satu liter media tanam untuk kultur in
vitro secara umum. Caranya adalah sebagai berikut:
- Siapkan gelas ukur (ukuran 2 Liter) dan letakkan di atas
magnetic stirrer. Ukuran gelas harus lebih besar dari volume
media yang akan dibuat
- Dibuat 3 macam media yakni: Media 1 (media MS murni),
Media 2 (media MS ditambah 100 gram tomat per liter
untuk kultur biji anggrek), dan Media 3 (sejumlah NAA dan
BAP untuk induksi tunas pada kultur organ)
- Timbang media kemasan jadi, beratnya disesuaikan dengan
kebutuhan (untuk satu liter media) yang tercantum dalam
sampul kemasan. Untuk media MS, ditimbang 4,43 gram
media kemasan untuk pembuatan 1 liter media
- Untuk pembuatan satu liter media, masukkan senyawa
tersebut pada gelas ukur yang sudah disediakan.
22
Tambahkan akuades hingga 500 ml. Masukkan magnet
pengaduk dan putar knop “stirrer” magnetic stirrer untuk
pengadukan dan putar juga knop “heat” untuk pemanasan
- Masukkan 30 gram sukrosa (gula pasir) untuk setiap liter
media dan tetap dilakukan pengadukan dan pemanasan
- Pada media 1 tidak dilakukan penambahan ZPT maupun
bahan organik. Pada media 2 ditambahkan 100 gram tomat
per liter. Caranya, timbang tomat 100 gram, kemudian dijus
dengan penambahan sedikit air dan kemudian dituang
seluruhnya. Media 3 adalah media untuk induksi tunas yang
mengandung 5 ppm BAP dan 0,1ppm NAA. Pada media 3,
dipipet sejumlah NAA dan BAP (dilakukan perhitungan
sesuai dengan konsentrasi stok yang tersedia)
- Selanjutnya pada masing-masing jenis media ditambahkan
akuades hingga volume mendekati satu liter, misal 900 ml
- Ukur pH dengan pH indikator, kemudian pH tersebut
diadjust atau dijadikan 5,6-5,8 dengan jalan menambahkan
larutan yang bersifat basa (NaOH atau KOH) jika terlalu
asam atau larutan yang bersifat asam (HCl) jika terlalu basa
- Timbang pemadat yaitu 7 gram agar-agar komersial untuk
setiap liter media dan tambahkan ke masing- masing jenis
media
- Tambahkan akuades lagi hingga volumenya benar-benar
tepat satu liter. Pada saat menambahkan akuades, magnet
pemutar diangkat sebentar, setelah tepat satu liter
dimasukkan lagi
23
- Tetap dilakukan pengadukan (“stirrer”) dan pemanasan
(“heat”) agar larutan benar benar homogen
- Jika sudah mendidih (suhu mencapai 80oC), maka media
tersebut dituang ke dalam botol-botol kultur yang sudah
disteril, ditutup rapat dengan penutup botol yang terbuat
dari karet atau dengan plastik lembaran atau aluminium foil.
Volume masing-masing botol tergantung ukuran botolnya,
berkisar kurang lebih 20-40 ml
- Selanjutnya botol-botol yang sudah berisi media tersebut
disteilisasi dengan autoklaf. Caranya, panci autoklaf diisi air
secukupnya, kemudian “sarangan” (bentuknya seperti
bagian dalamnya dandang yang berlubang) diletakkan di
dalamnya. Botol-botol yang berisi media tersebut diletakkan
dalam “sarangan‟, diatur sedemilian rupa agar efisien dan
volume tidak melebihi volume “sarangan” sehingga autoklaf
dapat ditutup rapat.
- Selanjutnya autoklaf dipanaskan dengan kompor (untuk
jenis autoklaf kompor) atau dengan listrik (untuk jenis
autoklaf listrik). “Katup asap‟ dibiarkan terbuka hingga
keluar asap. Setelah asap keluar dari katup, selanjutnya
katup ditutup agar suhu dan tekanan meningkat
- Dibiarkan suhu naik hingga mencapai 121oC atau tekanan
mencapai 17 psi (autoklaf umumnya dilengkapi dengan
penunjuk suhu dan tekanan). Proses sterilisasi media
24
membutuhkan waktu 30 menit, dihitung sejak suhu
mencapai 121oC
- Setelah proses autoklafing selesai, media tidak dapat
langsung dikeluarkan. Harus ditunggu dulu sampai suhu
autoklaf mencapai 0oC atau tekanan 0 psi.
- Setelah dikeluarkan dari autoklaf, media ditaruh di ruang
media. Digunakan paling cepat satu minggu kemudian,
untuk memberikan kesempatan pada mikroorganisme
(seandainya masih ada dalam media) untuk tumbuh dalam
kurun waktu tersebut, sehingga dapat mencegah
penggunaan media yang mengandung mikroorganisme
dorman di dalamnya
- Dalam kondisi tidak tersedianya “magnetic stirrer‟ di
laboratorium, maka pembuatan media dapat dilakukan di
atas kompor. Peran gelas ukur digantikan oleh panci
aluminium atau “stainlessteel‟ yang tahan untuk pemanasan
di atas kompor, sedangkan untuk mengaduk digunakan
sendok pengaduk sebagai pengganti magnet yang diputar
oleh stirrer (pada “magnetic stirrer‟).
Bahan Diskusi
- Mengapa harus ditambahkan 100 gram jus tomat pada
media untuk kultur biji atau sub kultur protokorm anggrek?
- Mengapa ditambahkan 0,01ppm NAA dan 5ppm BAP
untuk induksi organogenesis pada kultur organ?
25
- Mengapa dibutuhkan suatu tenggang waktu sejak “media
selesai diautoclaving‟ dengan “media dapat digunakan”?
- Jika ada media yang kontaminasi, apa jenis kontaminan dan
dari mana sumbernya?
26
TOPIK 4. PERSILANGAN ANGGREK
Tujuan
Melatih mahasiswa dalam melakukan persilangan pada
tanaman anggrek, sebagai langkah awal dalam pembuatan
anggrek hibrida.
Dasar Teori
Anggrek merupakan tanaman yang paling mudah
disilangkan diantara tanaman yang tergolong Kelas
Angiospermae, sehingga setiap tahunnya di dunia bisa
dihasilkan ratusan hingga ribuan anggrek hibrida. Anggrek
memiliki perhiasan bunga yang spesifik, dimana kelopak dan
mahkota bunganya sulit dibedakan karena warnanya sama,
sehingga keduanya disebut perhiasan bunga. Polen (sel kelamin
jantan) menggumpal disebut polinia. Sementara putik (sel
kelamin betina) terdapat pada suatu cekungan dalam struktur
yang disebut “tugu” atau “columna”, bersama dengan polen di
bagian atasnya.
Persilangan dapat dilakukan dengan jalan mengambil
polinia anggrek dan meletakkan pada putiknya. Umumnya tujuh
hari setelah persilangan dilakukan, perhiasan bunga akan layu
dan gugur, dan perlahan bakal buah membengkak. Bakal buah
ini selanjutnya berkembang menjadi buah, yang mana di
dalamnya terdapat ribuan biji anggrek. Diperlukan waktu yang
berbeda untuk setiap spesies anggrek dari sejak persilangan
27
sampai buahnya dapat dipanen untuk ditabur dalam pembuatan
anggrek botol. Misalnya, genus Dendrobium membutuhkan
waktu 3 bulan setelah persilangan, Phalaenopsis 8-9 bulan, dan
anggrek Vanda sekitar 6-7 bulan setelah persilangan. Gambar 7
menunjukkan contoh persilangan anggrek.
Gambar 7. Persilangan pada Tanaman Anggrek
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
- Tanaman anggrek
- Kertas label
- Pensil 2B
28
- Tusuk Gigi
- Benang
- Cawan petri
Cara Kerja
- Buka tutup polen, ambil polen dengan tusuk gigi dan
letakkan pada cawan petri
- Letakkan polen tersebut pada putik
- Lakukan resiprokal
- Beri label dan diikatkan dengan benang pada tangkai bunga
yang digunakan sebagai induk betina (yang akan
berkembang menjadi buah)
- Label ditulis dengan pensil bukan pulpen agar tidak luntur.
Label berisi nama tanaman induk (betina dan jantan) serta
tanggal.
- Amati dan catat apa yang terjadi dan ambil gambar / foto
secara periodik perkembangan bakal buah setelah
persilangan.
Bahan Diskusi
- Berapa jumlah bunga yang berhasil menjadi buah?
- Apa yang menyebabkan kegagalan terbentuknya buah?
- Mengapa buah yang akan ditabur bijinya harus dipanen
tepat waktu?
29
TOPIK 5. KULTUR BIJI ANGGREK
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan
pengetahuan dalam perbanyakan tanaman anggrek melalui
kultur biji.
Dasar Teori
Hasil persilangan anggrek akan membentuk buah (Gambar
8). Di dalam buah anggrek terdapat biji anggrek yang berukuran
sangat kecil, sehingga dalam satu buah bisa terdapat ratusan
hingga jutaan biji tergantung spesies nya. Berbeda dengan biji
tanaman angiospermae lain yang memiliki cadangan makanan,
biji anggrek sedikit atau tidak sama sekali memiliki cadangan
makan (endosperm). Konsekwensinya, biji-biji ini harus disemai
secara in vitro di laboratorium pada media steril yang
mengandung sumber makanan (hara makro, hara mikro,
vitamin). Perkecambahan biji anggrek secara alamiah (di
habitatnya) bisa terjadi, namun harus ada simbiosis dengan
semacam mikoriza. Dengan kondisi inipun persentase
perkecambahan masih sangat rendah, yaiti berkisar sekitar 1 %.
Sedangkan penyemaian di luar laboratorium pada media tidak
steril menyebabkan biji-biji tersebut mati karena serangan
mikroorganisme atau dimakan serangga (seperti semut) karena
ukuran biji yang sangat kecil. Dengan demikian, penaburan biji
anggrek harus ditanam secara in vitro di laboratorium. Syarat
30
utama untuk kultur in vitro adalah kondisi aseptik, sehingga
sterilisasi merupakan faktor penting untuk keberhasilan kerja
kultur in vitro.
Gambar 8. Buah hasil persilangan; Anggrek Phalaenopsis
amabilis (A) dan Vanda tricolor (B)
(Foto: Dokumentasi pribadi)
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
Alat:
- Media kultur steril yang sudah disiapkan sebelumnya
- Cawan petri yang berdiameter agak besar (9-12cm) untuk
tempat menaruh buah dalam meja kerja
- Erlenmeyer kecil atau botol selai steril untuk tempat alkohol
- Lampu bunsen dan spiritus
- Scalpel dan blade (pisau steril) untuk mengiris buah
Bahan:
- Buah anggrek yang siap ditabur
- Spiritus
A B
31
- Alkohol
- Detergen untuk mencuci buah anggrek
Cara Kerja:
- Pertama buah anggrek (yang akan ditabur bijinya) dicuci
pada kucuran air kran sambil disikat (dengan sikat gigi
bersih) menggunakan detergen
- Selanjutnya buah anggrek yang sudah bersih ini dicelupkan
dalam spiritus dan dibakar di atas lampu bunsen. Hal ini
dilakukan sebanyak tiga kali, baru kemudian dimasukkan ke
dalam laminar
- Di dalam laminar, buah anggrek tersebut dipegang dengan
pinset, dibakar sekali lagi baru kemudian dibelah
- Selanjutnya biji-biji anggrek ditanam pada media yang sudah
disiapkan, yakni media 1 (MS murni) dan media 2 (MS
+100gram per liter jus tomat).
- Botol kultur diberi label dan diletakkan di ruang kultur
- Prinsip untuk menjaga kondisi steril adalah setiap alat tanam
yang akan mengenai bahan tanam harus dicelupkan terlebih
dahulu dalam alkohol, lalu dibakar di api lampu bunsen, baru
kemudian digunakan. Hati-hati dalam penggunaan alkohol
dan api. Jangan sampai alat yang masih mengandung api‟
dicelupkan dalam alkohol karena dapat menyebabkan
terbakarnya alkohol. Gambar 9 menunjukkan cara penaburan
biji anggrek.
32
Gambar 9. Penaburan biji anggrek secara in vitro
Bahan Diskusi
- Amati saat biji berkecambah (berubah hijau) pada kedua
jenis media. Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai
minggu ke 3. Pada media mana biji anggrek lebih cepat
berkecambah?
- Amati dan hitung jumlah botol kultur yang bijinya
berkecambah (dilakukan pada akhir pengamatan, yakni pada
minggu ke 3).
- Bahaslah hasil tersebut di atas, cari bahan referensi yang
mendukung pembahasan.
33
TOPIK 6. SUBKULTUR
Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan praktek subkultur yang
merupakan tahapan dalam pekerjaan dalam kultur jaringan.
Dasar Teori
Subkultur adalah memindahkan kultur ke media baru
dengan alasan tertentu. Beberapa alasan kultur harus
dipindahkan adalah:
- Media habis sementara tanaman masih sehat
- Penjarangan pada pertumbuhan protokorm anggrek
- Media terkontaminasi sementara tanaman tidak/masih sehat
- Proliferasi tunas sehingga tunas-tunas yang sudah tumbuh
dipindahkan kembali ke media induksi tunas untuk
menstimulasi peningkatan jumlah tunas
- Memindahkan ke media perakaran untuk induksi akar. Ini
dilakukan untuk tunas-tunas yang sudah tumbuh tapi belum
berakar
- Untuk tujuan lainnya, seperti induksi embrio dalam
embriogenesis, dan lain sebagainya.
Pada praktikum ini dilakukan subkultur protokorm
anggrek hasil semai biji. Subkultur dilakukan karena media
sudah habis dan populasi protokorm dalam botol sangat tinggi
sehingga tumbuh berjejal dan menghambat pertumbuhan.
34
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
Alat:
(semua alat dalam keadaan steril / sudah diautoklaf)
- Pinset
- Wadah alkohol
- Aluminium foil
- Lampu bunsen dengan spiritus
- Korek api
- Karet gelang
- Laminar
Bahan:
- Media tanam steril
- Protokorm anggrek dalam botol
- Alkohol
Cara Kerja
- Aktifkan laminar, nyalakan lampu UV selama 15 menit
- Matikan lampu UV, nyalakan lampu biasa dan hidupkan
blower
- Kenakan glove dan semprot tangan dengan alkohol 70 %
- Semprot semua alat dan bahan yang akan digunakan dan
masukkkan dalam laminar
- Celupkan pinset dalam alkohol dan ekspose ke arah api.
Gunakan pinset tersebut untuk memindahkan protokorm ke
media baru
35
- Tutup kembali botol setelah penanaman pada media baru
- Pekerjaan ini diulang hingga protokorm dalam botol awal
habis disubkultur. Yang perlu diperhatikan untuk menjaga
kondisi aseptik adalah:
- Selalu celupkan pinset ke alkohol dan ekspose ke arah api
sebelum digunakan mengambil protokorm
- Panaskan mulut botol (botol asal protokorm maupun botol
media baru) sebelum mengambil atau meletakkan protokorm
dari/ke dalam botol.
Bahan Diskusi
- Berapa persen dari botol yang ditanam terkontaminasi?
- Amati apa yang menyebabkan kontaminasi beserta ciri-
cirinya?
- Bagaimana cara menanggulangi kontaminasi tersebut?
- Apa akibatnya jika protokorm anggrek tersebut tidak
disubkultur?
- Dalam pembuatan anggrek botol, perlukah sub-kultur
dilakukan?
- Untuk menjawab semua pertanyaan, carilah literatur yang
mendukung dan tulis sumbernya.
36
TOPIK 7. KULTUR ORGAN TANAMAN
ANGGUR (Vitis vinifera L.)
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan
pengetahuan dalam perbanyakan tanaman melalui kultur organ.
Dasar Teori
Teknik kultur jaringan tanaman adalah suatu cara atau
teknik untuk menumbuhkan sel, jaringan, organ atau bagian
tanaman lainnya untuk menjadi tanaman secara utuh, dalam
kondisi steril (aseptik) pada media yang mengandung nutrisi, di
laboratorium.
Teknik kultur in-vitro ini digunakan sebagai dasar untuk
melakukan perbanyakan mikro, atau dikenal dengan istilah
‟mikropropagasi‟ (micropropagation) atau in vitro propagation.
Mikropropagasi ini merupakan perbanyakan vegetatif yang
dilakukan secara modern. Karena perbanyakan vegetatif, maka
anakan hasil perbanyakan akan identik dengan induknya.
Anakan hasil perbanyakan melalui mikropropagasi ini disebut
plantlet. Jadi plantlet adalah tanaman hasil perbanyakan
melalui mikropropagasi atau kultur in vitro. Plantlet ini disebut
somaklon, karena merupakan tanaman hasil perbanyakan secara
vegetatif (klon) yang berasal dari sel-sel somatik. Somaklon
memiliki sifat-sifat yang secara genetik identik dengan induknya,
sehingga mikropropagasi ini digunakan untuk memperbanyak
37
tanaman transgenik yang dihasilkan melalui rekayasa genetika
maupun untuk memperbanyak hibrida unggul yang merupakan
hasil persilangan konvensional.
Di dalam kultur in vitro (kultur jaringan), sistem
regenerasi tanaman atau terbentuknya plantlet dari eksplan dapat
terjadi melalui dua cara yakni organogenesis dan embriogenesis.
Organogenesis adalah proses pembentukan propagul berupa
organ. Embriogenesis adalah proses pembentukan embrio, dan
dalam kultur in vitro disebut embriogenesis somatik (somatic
embryogenesis) karena embrio yang terbentuk berasal dari
eksplan yang terdiri dari sel-sel somatik. Organogenesis maupun
embriogenesis dapat terjadi secara langsung (direct) ataupun
secara tidak langsung atau melalui fase kalus terlebih dahulu
(indirect).
Dalam praktikum ini akan dilakukan produksi plantlet
melalui organogenesis secara langsung melalui kultur organ.
Organ yang akan dijadikan eksplan adalah daun dan tunas
tanaman anggur.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
Alat:
Peralatan yang digunakan sudah dalam kondisi steril
- Cawan petri
- Scalpel dan blade
- Lampu bunsen
- Sprayer
38
- Gunting
- Wadah alkohol
- Wadah untuk sterilisasi eksplan (gelas erlen meyer steril)
Bahan:
- Daun dan tunas tanaman anggur
- Alkohol
- Spiritus
- Fungisida
- Larutan Bayclin 5%
- Media untuk induksi tunas yang sudah disiapkan sebelumnya
dan media MS murni
Cara Kerja:
- Laminar dipersiapkan sebagaimana mestinya (lihat topik
topik sebelumnya)
- Ambil tunas dan daun tanaman anggur dari tanaman induk
menggunakan gunting steril
- Cuci material eksplan di bawah air kran mengalir
- Masukkan dalam wadah yang berisi larutan detergen dan
digoyang-goyang selama 5 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan masukkan dalam larutan
fungisida (2 gram/L), ditutup rapat dan masukkan ke dalam
laminar
- Dalam laminar, selanjutnya wadah tersebut digoyang selama
10 menit
39
- Bilas dengan air steril 3 kali dan kembali dimasukkan ke
larutan fungisida (baru) dengan konsentrasi sama, digoyang
kembali selama 10 menit
- Bilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali, selanjutnya
dimasukkan ke dalam larutan bayclin 5% selama 2 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali, selanjutnya letakkan pada
cawan petri yang sudah dialasi dengan kertas saring
steril untuk ditiriskan
- Buatlah irisan eksplan, daun dan node dipisahkan
- Tanam pada media yang sudah disiapkan
- Lakukan pengamatan secara periodik (setiap minggu) hingga
6 minggu
- Variabel pengamatan: jumlah eksplan bertunas (setiap
botol), jumlah tunas per eksplan (hanya dihitung dari
eksplan yang tumbuh tunas, dirata-ratakan untuk setiap
botol).
Bahan Diskusi dan Pelaporan:
- Adakah perbedaan hasil antar jenis eksplan?
- Apakah yang terjadi pada percobaan anda, organogenesis atau
embriogenesis?
- Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi
morfogenesis tanaman secara in vitro
- Bahaslah hasil yang didapat dengan pustaka yang relevan.
40
TOPIK 8. KULTUR TANGKAI BUNGA ANGGREK
PHALAENOPSIS
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan
pengetahuan dalam perbanyakan tanaman melalui tangkai
bunga.
Dasar Teori
Anggrek dari genus Phalaenopsis atau dikenal di Indonesia
sebagai anggrek Bulan memiliki kelebihan yakni warna bunga
yang menarik, serta memiliki flower longevity (daya tahan bunga
dalam tandan bunga yang masih melekat pada tanaman/intact
plant), sehingga sangat baik digunakan untuk bisnis rental
tanaman hias (Gambar 10). Dalam prakteknya, setelah bunganya
gugur, tangkai bunga tersebut harus dibuang atau dipangkas dari
tanamannnya untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas baru
pada tanaman, sehingga menjadi limbah yang tak termanfaatkan.
Sementara itu, teori totipotensi sel menyebutkan bahwa sel
tanaman secara genetik memiliki potensi untuk tumbuh dan
berkembang menjadi tanaman secara utuh. Dengan
dilatarbelakangi teori totipotensi sel ini maka mikropropagasi
atau perbanyakan tanaman melalui teknik kultur jaringan
dilakukan.
41
Gambar 10. Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis L.)
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
Didasari oleh teori tersebut serta didasari oleh banyaknya
limbah tanaman berupa tangkai bunga anggrek Phalaenopsis yang
diproduksi oleh berbagai rental tanaman hias dewasa ini menjadi
alasan yang sangat kuat untuk melakukan perbanyakan
menggunakan bahan tanam dari limbah tangkai bunga anggrek
Phalaenopsis.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
Alat:
Peralatan yang digunakan sudah dalam kondisi steril
- Cawan petri
- Scalpel dan blade
- Lampu bunsen
- Sprayer
42
- Gunting
- Wadah alkohol
- Wadah untuk sterilisasi eksplan (gelas erlen meyer steril)
Bahan:
- Tangkai bunga anggrek Phalaenopsis
- Alkohol
- Spiritus
- Fungisida
- Larutan Bayclin 5%
- Media untuk induksi tunas yang sudah disiapkan
sebelumnya dan media MS murni
Cara Kerja:
- Laminar dipersiapkan sebagaimana mestinya (lihat topik
topik sebelumnya)
- Ambil tunas dan daun tanaman anggur dari tanaman induk
menggunakan gunting steril
- Cuci material eksplan di bawah air kran mengalir
- Masukkan dalam wadah yang berisi larutan detergen dan
digoyang-goyang selama 5 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan masukkan dalam Larutan
fungisida (2 gram/L), ditutup rapat dan masukkan ke dalam
laminar
- Dalam laminar, selanjutnya wadah tersebut digoyang selama
10 menit
43
- Bilas dengan air steril 3 kali dan kembali dimasukkan ke
larutan fungisida (baru) dengan konsentrasi sama,
digoyang kembali selama 10 menit
- Bilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali,
selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan bayclin 5 %
selama 2 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali, selanjutnya letakkan pada
cawan petri yang sudah dialasi dengan kertas saring steril
untuk ditiriskan
- Buatlah irisan eksplan, node tangkai bunga diiris, dengan
ukuran kurang lebih 1 cm.
- Untuk mencegah browning, pengirisan dapat dilakukan
pada larutan vitamin C 50 ppm, kemudian dibilas dengan
air steril dan ditiriskan pada kertas saring steril
- Tanam pada media yang sudah disiapkan
- Lakukan pengamatan secara periodik (setiap minggu)
hingga 6 minggu
- Variabel pengamatan: saat tumbuh tunas, jumlah eksplan
bertunas (setiap botol), jumlah tunas per eksplan (hanya
dihitung dari eksplan yang tumbuh tunas, dirata-ratakan
untuk setiap botol).
Bahan Diskusi dan Pelaporan:
- Adakah perbedaan hasil antar jenis eksplan?
- Apakah yang terjadi pada percobaan anda, organogenesis
atau embriogenesis?
44
- Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi
morfogenesis tanaman secara in vitro
- Bahaslah hasil yang didapat dengan pustaka yang relevan.
45
DAFTAR REFERENSI
Sumber Referensi untuk mendukung pelaporan:
1. Dwiyani, R. 2015. Kultur Jaringan Tananaman. Pelawasari,
Denpasar. 75hal.
2. George EF & SherringtonPD. 1984. Plant propagation by
tissue culture. Hand book and directory of commercial
laboratories. Exegetics Ltd, England.
3. Saad AIM & Elshahed AM. 2012. Plant tissue culture
media. http://creative commons.org./licenses/by/3.0
4. Dwiyani R, Yuswanti H, Darmawati IAP, Suada K &
Mayadewi NNA. 2015. In vitro germination and its
subsequent growth of an orchid of Vanda tricolor Lindl.
var. suavis from Bali on complex additives enriched
medium. Agrivita 37 (2) : 144-150
5. Dwiyani R. 2013. Perkecambahan Biji dan Pertumbuhan
Protokorm Anggrek dari Buah dengan umur yang berbeda
pada media kultur yang diperkaya dengan dengan ekstrak
tomat. Jurnal Hortikultura Indonesia 4(2): 90-93
6. Jurnal internasional lainnya yang terkait dengan topik
praktikum.