21

1. TUJUAN PRAKTIKUMTujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui macam-macam pengecatan serta perbedaan dan fungsi dari masing-masing pengecatan, mengetahui zat-zat warna dan zat-zat lain yang digunakan untuk pengenceran, mengetahui dan mempraktikkan beberapa cara pengecatan, mengetahui bentuk sel dan bentuk koloni mikroorganisme, mengenali morfologi dari beberapa jenis yeast, mengklasifikasikan bakteri berdasarkan komposisi dinding selnya dan berdasar ada tidaknya endospora, mengetahui perbedaan dan ciri-ciri antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

2. TINJAUAN PUSTAKAMekanisme kerja mikroskop memiliki prinsip yaitu terdiri dari system optik atau sistem pembesaran dan sistem iluminasi yang menyebabkan terlihatnya suatu objek. Mikroskop dapat dibedakan menjadi beberapa jenis seperti misalnya mikroskop cahaya (optik) atau mikroskop elektron, tetapi dari semua jenis yang ada tetap menggunakan prinsip yang sama. Pembesaran mikroskop sendiri merupakan hasil dari 2 sistem lensa yaitu lensa objektif yang berada di dekat objek dan lensa okuler yang berada di dekat mata orang yang melihat menggunakan mikroskop tersebut. (Fardiaz, 1992, 36-37 : 320).Berdasarkan bentuk dasarnya, bakteri dapat diklasifikasikan menjadi 3 bentuk yakni bentuk bulat, batang atau silindri, dan bentuk lengkung atau vibri.

1. Bentuk bulat

Pada keadaanya yang sebenarnya tidak ada satupun bakteri yang berbentuk benar-benar bulat, tetapi berbentuk spheroid. Bentuk bulat sendiri dapat dibedakan dalam berbagai jenis, antara lain: Mikrokokus, yang memiliki bentuk bulat satu-satu

Diplokokus, yang memiliki bentuk bulat bergandengan dua-dua

Streptokokus, yang memiliki bentuk bulat bergandengan seperti rantai sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah dalam satu garis

Tetrakokus, yang memiliki bentuk bulat terdiri dari 4 sel yang tersusun dalam bentuk bujur sangkar sebagai hail pembelahan sel ke dua arah

Sarsina, bulat, yang terdiri dari 8 sel yang tersusun dalam bentuk kubus sebagai hasil pembelahan sel ke tiga arah.

Stafilokokus, yang memiliki bentuk bulat tersusun sebagai kelompok buah anggur sebagai hasil pembelahan sel ke segala arah.2. Bentuk batang

Bakteri yang memiliki bentuk batang dapat dibedakan menjadi bentuk batang panjang dan bentuk batang pendek dengan ujung yang datar atau melengkung. Selain itu, klasifikasi bakteri bentuk batang dapat diklasifikasikan sebagai bentuk batang yang mempunyai garis tengah dan tidak sama diseluruh bagian panjangnya. Bakteri bentuk batang dapat terdiri dari sel tunggal atau sel tunggal yang bergandengan dua-dua (diplobasilus), dan sebagai rantai (streptobasilus).3. Bentuk lengkung

Bakteri bentuk lengkung dapat diklasifikasikan lagi sebagai berbentuk koma (vibrio), jika bakteri tersebut memiliki kelengkungan kurang dari setengah lingkaran, jika spiralnya halus dan lentur disebut spirochaeta dan apabila spiralnya kaku dan tebal disebut spirillium.(Hidayat et al., 2006, 16-18 : 198).

Faktor faktor yang menentukan keberhasilan dalam pewarnaan mikroba adalah:

1. Fiksasi

Fiksasi bermaksud untuk membuat sel-sel bakteri tersebut mati dan melekat pada gelas objek.

2. Peluntur warna

Peluntur warna digunakan untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Zat ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dapat dilihat di bawah mikroskop dengan jelas.3. Substrat

Substrat berhubungan dengan kandungan sel yang terdiri dari karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat. Hal ini mempengaruhi keberhasilan dalam pewarnaan mikroba karena kehadiran senyawa-senyawa seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nuklueat dapat membuat zat warna asa bereaksi dengan senyawa-senyawa tersebut sehingga dapat mempengaruhi cepat lambatnya pewarnaan suatu bakteri.4. Intensifikasi pewarnaan

Intensifikasi pewarnaan bertujuan untuk mempercepat pewarnaan mikroba, misalnya dengan ditambah menggunakan senyawa mordant, sehingga zat akan terikat kuat dalam jaringan. Selain dengan penambahan mordant, intensifikasi pewarnaan dapat juga dilakukan dengan meningkatkan temperatur pewarnaan sampai kira-kira 60-900C.5. Zat warna penutup (counterstain)Zat warna penutup atau counterstain diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan warna kontras pada sel mikrobia yang diwarnai yang dapat melepaskan zat warna semula akibat pencucian. Contoh dari zat warna penutup atau counterstain ini misalnya meilin biru, safranin, eritrosin, dan sebagainya.

(Suriawiria, 2005, 43-45: 172)Preparat yang digunakan dalam pengamatan mikroskop memiliki 2 jenis yaitu:1. Preparat yang bersifat basah (wet mount preparation)

Preparat basa dibedakan menjadi 2 macam, yaitu lekapan basah (wet mount) dan tetes gantung. Pada preparat jenis basah, digunakan cairan yang mengandung mikroba hidup. Preparat bersifat basah ini digunakan dalam mikrobiologi karena memungkinkan digunakan untuk pengamatan bentuk dan ukuran organisme secara individu, pengkelompokan khas sel-sel bakteri serta mengetahui apakah mikroorganisme tersebut bergerak atau tidak (motilitas).2. Olesan yang diwarnai

Olesan yang diwarnai adalah jenis preparat yang lebih umum digunakan untuk mengamati mikroba secara mikroskopis. Namun pada olesan mikroorganisme, mirkoorganisme yang diwarnai dapat diamati jika mikroorgansime tersebut sudah mati. Selain hal tersebut, ukuran serta penataan atau pengelompokan mikroba dapat berubah dan tidak dapat mengamati pergerakan dari mikroba tersebut karena mikroba yang diamati adalah mikroba yang sudah mati.(Hadioetomo, 1993, 18:163).Pengamatan terhadap bakteri lebih sering dilakukan dalam olesan terwarnai daripada bakteri dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diberi zat pewarna kimia supaya lebih mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai dapat mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan ada atau tidaknya struktur internal seperti spora dan butiran. Zat pewarna diferensial adalah zat pewarna yang mengungkapkan perbedaan kimia pada struktur bakteri. (Volk & Wheeler, 1993, 30:396)Langkah-langkah yang dilakukan di dalam pengecatan bakteri diawali dengan pembuatan olesan. Dalam hal ini, yang dimaksud dengan olesan adalah biakan yang disebarkan pada setetes air di gelas preparat. Olesan ini dikeringkan pada suhu kamar dan mikroba yang ada di dalamnya difiksasi terlebih dahulu agar mikroba tersebut mati dan melekat pada kaca preparat demgam cara melewatkan kaca preparat diatas nyala api bunsen kira-kira sekitar 15 kali. Jika sudah dingin, olesan sudah siap untuk diberi warna. Untuk alternatif dari fikasi, dapat digunakan methanol untuk melekatkan mikroba pada gelas preparat, sebab bagi sebagian mikroba panas dapat menyebabkan distorsi pada penampilan mikroba yang akan diwarnai misalnya pada olesan bakteri gram positif yang jika dipanaskan secara berlebihan akan mengakibatkan pecahnya dinding sel yang berakibat bakteri gram positif melepas zat warna primernya dan menangkap pewarnanya tandingannya, karena reaksi gram bergantung pada struktur dinding sel (Hadioetomo, 1993, 103:163). Cara yang dilakukan adalah meletakkan beberapa tetes methanol pada olesan kering udara dan kemudian membiarkan olesan tersebut kering udara lagi (Volk & Wheeler, 1993, 30:396).Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi 2 kelompok jika dilihat berdasarkan komposisi dinding sel dan sifat pewarnaannya, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Selain berbeda dalam sifat pewarnaanya, yang membedakan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif adalah sensitivitasnya terhadap kerusakan mekanis/fisis, terhadap enzim, terhadap disinfektan, dan terhadap antibiotik (Fardiaz, 1992, 146-147 : 320).Berdasarkan tehnik pengecatan selektif, bakteri gram negatif dan gram positif dapat dibedakan dari dapat tidaknya bakteri tersebut mengikat zat warna kedua (counterstain). Bakteri gram positif adalah bakteri yang tidak dapat mengikat zat warna kedua itu, sedangkan bakteri yang dapat mengikat zat warna kedua tersebut adalah bakteri gram negatif (Gaman, P. M. & K. B. Sherrington, 1999, 241-243:317).

Beberapa jenis bakteri tertentuk dapat membetuk struktur yang disebut dengan endospora. Jenis bakteri yang tergolong memiliki endospora biasanya adalah termasuk genus Bacillus dan Clostridium. Endospora dapat bertahan hidup di keadaan ekstrim seperti misalnya keadaan kurang nutrient, tahan terhadap panas, dan berbagai unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi sinar ultraviolet, dan bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membetuk spora. Kondisi yang seperti itu, menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang berbeda untuk mewarnainya. Karena sifat endospora yang demkian, menyebabkan endospora sukar diwarnai, tetapi jika endospora dapat sekali saja berhasil diwarnai, maka endospora tersebut akan sukar melepaskan zat warna sehinga tidak dapat mengikat zat warna yang diberikan kemudian (counterstain). Zat warna yang paling sering digunakan dalam pewarnaan endospore adalan malachite green (Schaeffer dan Fulton) yang akan tetap diikat oleh endospora walaupun telah dicuci dengan air. Sedangkan yang biasa digunakan sebagai counterstain dalam pewarnaan endospora adalah safranin. Dengan pewarnaan yang demikian maka endospora akan bewarna hijau-biru dan sel vegetatif yang dapat menangkap counterstain akan bewarna merah muda. (Hadioetomo, 1993, 112 : 163).3. MATERI DAN METODE3.1. Materi

3.1.1. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Mikroskop, tabung reaksi, jarum N, Bunsen, korek api, kipas angin, tissue, serbet, label, pemanas elektrik, jarum ose, kaca preparat, kaca objek, pengukur waktu, pipet tetes, masker, sarung tangan.3.1.2. BahanMethylen blue, malachite green, violet Kristal, lugol, larutan laktoferal, safranin, alkohol, aquades, kultur B. aureus (untuk kelompok 1 dan 5), Streptococcus thermopilus (untuk kelompok 2), Ercherichia coli (untuk kelompok 3), Saccharomyces cerevisae dan Saccharomyces uvarum (untuk kelompok 7), A. tereus (kelompok 1), dan R. oligosporus (kelompok 2).

3.2. Metode3.2.1. Pengamatan Pada KapangPertama-tama, jarum N dipanas diatas api Bunsen sampai bewarna merah. Kultur (A.tereus, R.oligosporus (kelompok 1 dan 2)) diambil sedikit dengan jarum N dan dilakukan secara aspetis, lalu kultur yang sudah diambil diletakkan pada kaca preparat yang sebelumnya sudah dibersihkan dengan menggunakan alkohol dan ditambah larutan laktoferal. Setelah itu, kaca preparat ditutup dan preparat tersebut diamati dengan mikroskop dan digambar dan diberi keterangan.3.2.2. Pengecatan Sederhana

Mula-mula, kaca preparat dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol, kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue, dan setelah itu pada kaca preparat tersebut diberi aquades 1 tetes. Lalu, kultur B. subtilis dan Streptococcus thermophilus (kelompok 1 dan 2)) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan dan dioleskan pada kaca preparat. Selanjutnya olesan pada kaca tersebut difiksasi dengan cara kaca dilewatkan diatas nyala api bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Kemudian, diberi zat warna methylen blue dan didiamkan selama 3 menit. Setelah itu, kaca preparat tersebut dibilas dengan air yang mengalir dengan tidak deras. Kemudian dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah kering, preparat diamati dengan mikroskop untuk digambar dan diberi keterangan.3.2.3. Pewarnaan Gram

Pertama kali kaca preparat dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Kemudian kaca preparat tersebut ditetesi dengan aquades 1 tetes. Kemudian kultur (Escherichia coli dan Lactobacillus bulgaricus (kelompok 3 dan 4)) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan sebelumnya dan kemudian dioleskan pada kaca preparat. Selanjutnya olesan pada kaca tersebut difiksasi dengan kaca dilewatkan ke atas nyala api bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Setelah itu, preparat diberi warna larutan violet kristal dan didiamkan selama 1 menit. Lalu, kaca preparat tersebut dibilas dengan air lagi. Setelah itu, warnanya dihilangkan dengan menggunakan alkohol 95% selama 10-20 detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi. Kemudian diwarnai dengan larutan fusin dan didiamkan selama 10-20 detik. Lalu kaca preparat tersebut dibilas dengan air lagi. Kemudian dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah kering, preparat diamati dengan mikroskop, untuk kemudian digambar dan diberi keterangan.3.2.4. Pewarnaan Spora BakteriMula-mula, kaca preparat dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol, dan kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue. Setelah itu, kaca diberi aquades 1 tetes. Kemudian kultur (A.xylinum (kelompok 5) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan diatas nyala api bunsen sebelumnya dan dioleskan pada kaca preparat. Setelah itu, olesan pada kaca tersebut difiksasi dengan cara kaca dilewatkan diatas nyala api Bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Setelah itu, preparat diberi warna dengan zat malachite green dan dipanaskan selama 5 menit diatas penangas air (setiap kali pewarna menjadi kering, ditetesi lagi). Setelah dipanaskan, kaca preparat tersebut dibilas dengan air mengalir dengan tidak deras dan didiamkan selama 20-30 detik. Lalu diwarnai dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, kaca preparat dibilas dengan air lagi. Kemudian dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah itu, preparat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk digambar dan diberi keterangan setelahnya.

3.2.5. Pewarnaan Spora Yeast

Pertama kali, kaca preparat dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol, kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue. Setelah itu kaca preparat tersebut diberi aquades 1 tetes. Kemudian kultur (S.cerevisiae (kelompok 6)) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan dan dioleskan pada kaca preparat. Selanjutnya olesan pada kaca preparat difiksasi dengan cara kaca dilewatkan diatas nyala api pada bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Setelah difiksasi, preparat diberi zat warna larutan violet kristal dan dipanaskan selama 3 menit diatas penangas air (setiap kali pewarna menjadi kering, ditetesi lagi). Setelah itu, kaca preparat tersebut dibilas dengan air yang mengalir tidak deras. Kemudian, warnanya dihilangkan dengan alkohol 95% selama 10-20 detik atau sampai warna violet tidak luntur lagi, lalu dikeringkan. Setelah kering, preparat diwarnai dengan menggunakan larutan safranin dan didiamkan selama 10 detik. Lalu, kaca preparat tersebut dibilas dengan air lagi. Kemudian dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah itu, preparat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk kemudian digambar dan diberi keterangan.4. HASIL PENGAMATANHasil pengamatan mikroskop dan pewarnaan dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Pengamatan Mikroskop dan PewarnaanKelompokMikroorganismeGambar Keterangan

A1A2

A3

A4

A5

A6Aspergillus tereus Rhizopus oligosporus

Bacillus subtilis

Streptococcus thermophilus

Escherichia coli

Lactobacillus bulgaricus

Acetobacter xylinum

Saccharomyces cerevisiae.

Bentuk : kipasWarna : biru

Perbesaran: 10x 100

Bentuk : basil

Warna : cokelat

Perbesaran: 10x 100

Bentuk : basil

Warna : hitam

Perbesaran: 10x 100

Bentuk : basil

Warna : hitam

Perbesaran: 10x 100

Bentuk : basil-batang

Warna: merah-oranye

Perbesaran: 10x 100

Bentuk : basil

Warna : ungu

Perbesaran: 10x 40

Bentuk : basil

Warna : hijau-biru

Perbesaran: 10x 10

Bentuk : kokus

Warna : merah

Perbesaran: 10x 40

Pada tabel 1 dapat dilihat bahwa hasil pewarnaan tiap kelompok menunjukkan bahwa karakteristik tiap-tiap mikroorganisme berbeda satu dengan yang lainnya. Pada kelompok 1 didapati bahwa Aspergillus tereus memiliki bentuk kipas dengan warna biru yang dilihat dengan perebesaran mikroskop 10x100. Sedangkan mikroorganisme Rhizophus oligosporus memiliki bentuk basil dengan warna cokelat dengan perbesaran mikroskop 10x100. Sedangkan pada kelompok 2 didapati bahwa Bacillus subtilis memiliki karakteristik bentuk basil dengan warna hitam yang dilihat dari perbesaran mikroskop 10x100. Sedangkan mikroorganisme Streptocuccs thermophiles memiliki bentuk basil dengan warna hitam yang dilihat dari perbesaran mikroskop 10x100. Pada kelompok 3 didapati bahwa Escherichia coli memiliki karakteristik bentuk basil dengan warna merah-orange yang dilihat dari perbesaran mikroskop 10x100. Sedangkan pada kelompok 4, didapati bahwa mikroorganisme Lactobacillus bulgaricus memiliki bentuk basil dengan warna ungu yang dilihat dengan perbesaran mikroskop 10x40. Pada kelompok 5, didapati bahwa Acetobacter xylinum memiliki bentuk basil dengan warna hijau-biru dengan perbesaran mikroskop 10x10. Sedangkan pada kelompok 6, didapati bahwa Saccharomyces cerevisae memiliki bentuk kokus dengan warna merah dengan perbesaran mikroskop yang digunakan 10x40.

5. PEMBAHASANPada percobaan kali ini dikakukan pewarnaan pada mikroorganisme. Pengecatan pada mikroorganisme sendiri memiliki tujuan untuk memberi warna yang kontras pada mikroorganisme sehingga membuat mikroorganisme yang diberi zat warna terlihat lebih jelas pada saat diamati di mikroskop. Selain itu, pewarnaan pada mikroorganisme juga dapat digunakan untuk membedakan jenis-jenis mikroorganisme seperti misalnya untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif yang mempunyai perbedaan dalam lapisan-lapisan dinding selnya sehingga mengakibatkan ditangkapnya counterstain pada bakteri gram negatif saat dilakukannya pewarnaan gram (Gaman, P. M. & K. B. Sherrington, 1999, 241-243:317). Selain digunakan untuk mempertajam kontras dalam pengamatan dengan mikroskop dan untuk membedakan jenis-jenis mikroorganisme tertentu, pewarnaan juga dapat digunakan untuk membedakan struktur-struktur pada suatu mikroorganisme. Dalam fungsinya untuk membedakan struktur-struktur mikroorganisme salah satunya adalah pada metode pewarnaan endospora dimana dalam pewarnaan ini pewarnaan digunakan untuk membedakan sel-sel vegetatif dan endospora. Endospora yang mempunyai karakterikstik lebih tahan pada kondisi yang ekstrim seperti misalnya pada keadaan kurang nutrient, tahan terhadap panas, dan berbagai unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi sinar ultraviolet, dan bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membetuk spora membuat endospora sendiri sukar untuk diwarnai. Maka dari itu sekali saja endospora berhasil diwarnai, maka endospore juga akan sukar untuk menghilangkan zat pewarna yang sudah diikatnya, maka dari itu apabila zat warna tersebut dicuci dan diberi zat warna lainnya (counterstain) maka endospora tidak akan mengikat counterstain tersebut dan tetap mengikat zat warna primer, berbeda dengan sel vegetatif yang akan melepaskan zat warna primer saat dilakukan pencucian dan akan mengikat counterstain sehingga dari pewarnaan ini dapat tampak warna yang berbeda antara sel vegetatif dan endospora (Hadioetomo, 1993, 112 : 163).5.1. Pengamatan Pada Kapang

Pertama-tama, jarum N dipanaskan dengan api diatas bunsen sampai bewarna merah. Hal ini dilakukan dengan bertujuan untuk membuat jarum N tersebut steril dari mikroorganisme-mikroorganisme lainnya yang dapat menganggu pengecatan ini. Setelah itu kultur (A. tereus, R. oligosporus) diambil sedikit dengan jarum N yang dilakukan secara aseptis. Dilakukan secara aseptis juga dengan tujuan yang sama yaitu untuk mencegah adanya mikroorganisme-mikroorganisme lain saat pengecatan maupun saat pengamatan menggunakan mikroskop nantinya. Kemudian, kultur yang sudah diambil diletakkan pada kaca preparat yang sudah dibersihkan dengan menggunakan alkohol dan ditambah dengan larutan laktoferal. Digunakan alkohol untuk membersihkan kaca preparat agar kaca preparat tersebut juga steril dari mikroorganisme yang tidak diinginkan dalam percobaan ini sedangkan larutan laktoferal digunakan untuk memberi warna yang kontras sehingga preparat lebih mudah untuk diamati di mikroskop nantinya. Setelah itu kaca preparat ditutup dan preparat tersebut diamati dengan mikroskop untuk digambar dan diberi keterangan. Warna yang didapat dalam Aspergillus tereus adalah warna biru dengan bentuk kipas sedangkan pada Rhizopus oligosporus memiliki warna cokelat dengan bentuk basil.5.2. Pengecatan Sederhana

Proses pewarnaan bakteri yang paling umum ialah metode pengecatan sederhana. Disebut sebagai pengecatan sederhana, karena dalam prosesnya hanya digunakan 1 jenis zat warna untuk mewarnai suatu jenis organisme, sehingga dapat meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka basa), dan zat-zat warna yang digunakan dalam pengecatan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif. Pada pengecatan sederhana, pertama kali yang harus dilakukan adalah preparat dibersihkan dulu dengan menggunakan alkohol, kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue. Hal ini dilakukan untuk mencegah adanya kontaminasi pada preparat yang akan mengganggu pada pengamatan nantinya. Setelah kering, preparat diberi aquades 1 tetes dan kemudian kultur yang akan diamati (B. subtilis dan Streptococcus thermophilus) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan terlebih dahulu di atas nyala api bunsen dan dioleskan pada kaca preparat. Aquades diteteskan keatas preparat dengan tujuan untuk menyebarkam olesan pada permukaan preparat dan sedangkan jarum ose dipanaskan sampai berpijar diatas nyala api bunsen adalah untuk menyeterilkan jarum ose tersebut dari mikroorganisme-mikroorganisme lain yang dapat mengontaminasi preparat yang ada sehingga menghambat pengecatan maupun pengamatan nantinya. Selanjutnya, olesan pada kaca preparat tersebut difiksasi dengan cara dilewatkan diatas nyala api bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali bertujuan untuk membunuh mikroba yang ada di kaca preparat tersebut dan membuatnya menempel di kaca preparat tersebut. Setelah selesai difiksasi, kemudian preparat diberi zat warna methylen blue dan didiamkan selama 3 menit. Zat warna yang dipilih methylen blue karena kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana seperti methylen blue sebab sitoplasma bakteri bersifat basofilik (suka basa) maka pewarna yang digunakan adalah pewarna basa seperti methylen blue. Setelah itu, kaca preparat dibilas dengan air dengan tidak deras dan kemudian dikeringkan hingga benar-benar mengering di depan kipas angin. Setelah kering, preparat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk digambar dan diberi keterangan. Hasil yang didapat dari pengamatan Bacillus subtilis dan Streptococcus thermophilus adallah sama-sama bewarna hitam dan sama-sama berbentuk basil (Hadioetomo, 1993, 103:163).5.3. Pewarnaan GramProses pewarnaan gram adalah merupakan salah satu proses pewarnaan diferensial, yakni proses pewarnaan yang ada digunakan untuk membedakan jenis mikroorganisme. Pada metode pewarnaan gram hal yang pertama kali dilakukan adalah kaca preparat dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Hal ini dilakukan untuk membuat kaca preparat tersebut bebas dari kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan. Kemudian, kaca preparat diberi aquades 1 tetes. hal ini dilakukan untuk menyebarkan mikroba yang akan dioleskan di kaca preparat. Setelah itu, kultur yang dilakukan untuk pewarnaan gram (Escherichia coli dan Lactobacillus bulgaricus) dipanen menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan sebelumnya diatas nyala api bunsen hingga berpijar dan kemudian dioleskan ke preparat. Jarum ose harus dipijarkan terlebih dahulu agar jarum ose dapat steril dari kontaminasi mikroorganisme-mikroorganisme yang tidak diinginkan untuk pengecatan dan pengamatan nantinya. Selanjutnya, olesan pada kaca preparat tersebut difiksasi di atas nyala api bunsen agar mikroba yang ada di kaca preparat mati dan melekat pada kaca preparat tersebut. Setelah difiksasi, preparat diberi warna dengan menggunakan violet Kristal dan didiamkan selama 1 menit. Lalu, kaca preparat tersebut dibilas lagi dengan menggunakan air. Setelah itu, warnanya dihilangkan dengan menggunakan alkohol 95% selama 10-20 detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi. Alkohol ini menyebabkan terjadinya dehidrasi pada pori-pori dinding sel sehingga membuat zat warna primer tidak larut. Sedangkan pada bakteri gram negatif, alkohol ini membuat kandungan lipid yang ada di dinding sel bakteri gram negative yang merupakan struktur mayoritas di dinding selnya menjadi larut dan mengakibatkan pori-pori dinding sel dari bakteri gram negatif terbuka semakin lebar dan zat warna primer menjadi larut. Zat warna harus dihilangkan menggunakan alkohol 95% karena pewarnaan gram ini digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dengan metode jika bakteri gram positif tidak dapat melepaskan zat warna primer yang diberikan sedangkan gram negatif dapat melepaskan zat warna primer yang disebabkan oleh perbedaan karakteristik dinding selnya (Hadioetomo, 1993, 103:163). Setelah zat warna primer dihilangkan, kemudian preparat diwarnai kembai dengan larutan fusin dan didiamkan selama 10-20 detik. Zat warna kedua yang biasa disebut counterstain ini digunakan sebagai indikator yang menunjukkan bahwa suatu mikroba dalam hal ini bakteri melepaskan zat warna primernya karena apabila bakteri dapat melepaskan zat warna primernya (bakteri gram negatif) maka bakteri tersebut akan mengikat counterstain tersebut dan jika bakteri tersebut tidak melepaskan dan tetap mengikat zat warna primernya (bakteri gram positif) maka bakteri tersebut tidak akan mengikat counterstain yang diberikan selanjutnya. Setelah didiamkan 10-20 detik, preparat tersebut dibilas dengan air lagi dan dikeringkan kemudian. Setelah kering, preparat diamati dengan mikroskop, untuk kemudian digambar dan diberi keterangan (Gaman, P. M. & K. B. Sherrington, 1999, 241-243:317). Dari hasil pengamatan, bakteri Escherichia coli menghasilkan warna merah-oranye dengan bentuk basil. Warna merah-oranye ini adalah warna dari larutan fusin yang merupakan counterstain dalam pewarnaan gram kali ini. Hal ini menunjukkan bahwa Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif. Sedangkan pada Lactobacillus bulgaricus menghasilkan warna ungu dengan bentuk basil. Warna ungu dihasilkan oleh zat warna primer yang digunakan oleh pewarnaan gram yakni violet kristal jadi dapat diambil kesimpulan bahwa Lactobacillus bulgaricus adalah bakteri gram negatif karena Lactobacillus bulgaricus tidak melepaskan zat warna primer walaupun sudah mengalami proses pencucian.

5.4. Pewarnaan Spora Bakteri

Pewarnaan spora bakteri adalah untuk menguji ada atau tidaknya endospora pada suatu mikroba dalam hal ini bakteri. Hal yang pertama kali dilakukan adalah kaca preparat yang akan digunakan dibersihkan dahulu dengan menggunakan alkohol, dan kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue. Preparat harus dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol agar preparat tersebut bebas dari mikroorganisme lain yang tidak diingikan. Setelah itu, kaca preparat diberi aquades 1 tetes dan kemudian kultur yang digunakan (Acetobacter xylinum) diambil menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan sebelumnya di atas nyala api bunsen dan kemudian dioleskan ke kaca preparat. Jarum ose harus dipijarkan terlebih dahulu diatas nyala api bunsen agar jarum ose yang akan digunakan tersebut sudah steril dan bebas dari mikroorganisme lain yang tidak ingin digunakan dalam pewarnaan spora bakteri ini. Setelah itu, olesan pada kaca preparat itu difiksasi dengan cara dilewatkan diatas nyala api bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Fiksasi dilakukan dengan tujuan untuk membunuh mikroorganisme yang dalam hal ini Acetobacter xylinum dan melekatkannya ke kaca preparat untuk diwarnai. Setelah proses fiksasi usai, preparat diberi warna malachite green dan dipanaskan selam 5 menit diatas penangas air dan setiap kali pewarna kerina harus ditetesi lagi. Pemanasan ini bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam hal ini adalah penambahan bahan kimia berupa larutan pewarna malachite green, sehingga zat warna malachite green dapat masuk ke dalam spora dan setelah dingin maka zat warna tersebut tersebut terperangkap dalam spora. Setelah dipanaskan, kaca preparat tersebut dibilas lagi dengan air. Kemudian dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah itu, preparat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk digambar dan diberi keterangan setelahnya. Dalam percobaan kali ini Acetobacter xylinum menghasilkan warna hijau-biru dengan bentuk basil, hal ini menunjukkan bahwa zat warna malachite green terperangkap dalam spora tersebut (Hadioetomo, 1993, 112 : 163).5.5. Pewarnaan Spora Yeast

Pewarnaan spora yeast digunakan untuk menguji ada tidaknya endospora yang ada di dalam yeast. Hal yang pertama kali dilakukan dalam pewarnaan ini adalah kaca preparat dibersihkan dengan menggunakan alkohol terlebih dahulu dan kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue. Hal ini digunakan untuk menyeterilkan preparat yang akan digunakan sehingga preparat yang digunakan benar-benar bebas dari mikroorganisme-mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki. Lalu, kaca preparat ditetesi oleh aquades 1 tetes yang bertujuan untuk menyebarkan mikroba yang nantinya dioleskan. Setelah itu, kultur yang digunakan dalam pewarnaan ini (Saccharomyces cerevisiae) dipanen dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan terlebih dahulu diatas nyala api bunsen yang bertujuan untuk menyeterilkan jarum ose dari mikroorganisme-mikroorganisme lainnya yang tidak diinginkan dalam pewarnaan spora yeast. Setelah dipanen, kemudian kultur dioleskan ke kaca preparat untuk selanjutnya difiksasi dengan cara dilewatkan diatas nyala api bunsen sebanyak kurang lebih 15 kali. Setelah difiksasi, preparat diberi zat warna violet kristal dan dipanaskan selama 3 menit diatas penangas air (setiap kali pewarna menjadi kering, zat pewarna tersebut diteteskan kembali). Pemanasan akan mempercepat pengecatan, di mana pemanasan membantu zat warna menembus dinding endospora. Setelah itu, kaca preparat tersebut dibilas dengan air yang mengalir tidak deras. Kemudian, warnanya dihilangkan dengan alkohol 95% selama 10-20 detik atau sampai warna violet tidak luntur lagi, lalu dikeringkan. Setelah kering, preparat diwarnai dengan menggunakan larutan safranin dan didiamkan selama 10 detik. Larutan safranin ini digunakan untuk mewarnai sel-sel vegetatif yang zat warna primernya hilang pada saat pencucian, sedangkan safranin yang bekerja sebagai counterstain. Kemudian, kaca preparat tersebut di bilas dengan menggunakan air kembali lalu dikeringkan hingga mengering di depan kipas angin. Setelah itu, preparat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk kemudian digambar dan diberi keterangan. Pada percobaan pewarnaan spora yeast Saccharomyces cerevisiae menghasilkan warna merah dengan bentuk kokus. Hal ini menunjukkan bahwa spora yang ada di Saccharomyces cerevisiae merupakan sel-sel vegetative dan bukan berupa endospora (Hadioetomo, 1993, 112 : 163).6. KESIMPULAN Mikroskop adalah alat yang digunakan untuk mengamati benda, bagian sel dan makhluk hidup yang berukuran sangat kecil. Mikroskop berfungsi untuk membesarkan benda yang dilihat sehingga membantu untuk mengamati benda renik. Mikroskop digolongkan menjadi dua, yaitu mikroskop cahaya dan mikroskop elektron.

Pemberian warna pada bakteri bertujuan supaya zat warna dapat mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga dapat meningkatkan kontras dengan sekelilingnya dan struktur sel bakteri dapat diamati.

Ada 4 jenis pewarnaan bakteri, yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial, dan pengecatan struktural, serta pewarnaan untuk menguji adanya komponen-komponen tertentu di dalam sel.

Pengecatan sederhana adalah pengecatan sel mikrobia dengan satu pewarna dan satu tahap pengecatan saja Pengecatan sederhana hanya dapat digunakan melihat morfologi dari mikroorganisme.

Pengelompokkan bakteri menjadi dua jenis bakteri, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram positif terutama didasarkan pada komposisi dinding sel serta sifat pewarnaannya.

Dinding bakteri gram positif lebih tebal dan terdiri dari peptidoglikan, dinding bakteri gram negatif memiliki lipid yang lebih tinggi dan umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Disebut bakteri gram positif bila bakteri tersebut dapat menahan kompleks pewarna primer violet kristal sampai akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu). Bakteri digolongkan ke gram negatif apabila bakteri tersebut kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemudian terwarnai oleh safranin (sel-sel tampak berwarna merah).

Metode pewarnaan endospora bertujuan untuk mengamati endospora, yang tidak semua jenis bakteri memilikinya. Pemanasan pada pewarnaan endospora bertujuan untuk membantu zat warna menembus dinding endospora.

Semarang, 22 Mei 2011

Asisten Dosen :

Christina Vania Utami(Alvin Arienata Hartanto)10.70.0090

7. DAFTAR PUSTAKAFardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. ( 1994 ). Ilmu Pangan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka. Jakarta.Hidayat, et al. (2006). Mikrobiologi Industri. Andi Yogyakarta. Yogyakarta.Suriawiria, H.U (2005). Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.8. LAMPIRAN

8.1. Laporan Sementara1