Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan

Metode Kultur Jaringan

I. Berdasarkan Media, dibagi atas1. Metode Padat (solid method)2. Metode Cair (liquid method)

1. Metode Padat (solid method)

Tujuan : Untuk mendapatkan kalus (induksi kalus), inisiasi akar dan daun planlet

Menggunakan Media padat : mengandung semua komponen

senyawa kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat (agar, bacto agar, dll)

• Tingkat kekerasan media sangat menentukan keberhasilan dalam menumbuhkan jaringan.

• Media yang padat akar sukar tumbuh sulit untuk menembus ke dalam media.

• Sedangkan media yang terlalu lembek tenggelamnya eksplan yang ditanam (terutama eksplan yang berat seperti eksplan wortel, melinjo, bawang putih, kedele dan sebagainya.

• Media yang agak lembek akan lebih baik hasilnya bila digunakan untuk menanam eksplan dan jaringan yang ringan seperti serbuk sari, irisan kepala sari, embrio dan daun tipis.

• Medium yang lembek ini bagi eksplan yang ringan justru akan menunjang pertumbuhan kalus selanjutnya, karena dapat menyerap hara yang tersedia.

2. Metode Cair (liquid method)• Menggunakan media cair• Tujuan : untuk memperbanyak kalus, kultur

suspensi sel• Suspensi sel kultur dari sel-sel bebas di dalam

medium cair. • Tujuan khusus dari suspensi sel adalah untuk

memecah kalus menjadi single cell. • Suspensi sel dapat menghasilkan dua tipe sel,

yaitu single cell dan kelompok sel atau gumpalan sel. Singe cell mempunyai kemampuan untuk tumbuh dan membelah diri lebih baik dibandingkan dengan kelompok sel.

• Di dalam media cair, single cell akan tampak mengapung dan kelihatan keruh, sedangkan kelompok sel akan mengendap.

• Untuk mendapatkan single cell untuk isolasi protoplas perlu dilakukan penyaringan dengan nylon filter supaya gumpalan sel dapat tertahan sedangkan single cell akan lolos dan dapat ditampung.

• media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu menumbuhkan plb (protocorm likes bodies atau protokormus). Protokormus tumbuh menjadi planlet jika ditanam ke media padat.

• media cair juga digunakan untuk memperbanyak kalus mengadakan sub kultur berkali-kali untuk melipatgandakan jumlah kalus.

Kalus dapat digunakan metabolit sekundernya, isolasi protoplasma dan isolasi kloroplas.

Keberhasilan mendapatkan kalus yang baik pada suspensi sel ditentukan oleh beberapa faktor, diantaranya: •jumlah kalus di dalam erlenmeyer tidak boleh terlalu banyak atau terlalu padat karena dapat memperlambat pertumbuhan; •volume media cair tidak boleh terlalu besar, jika diberi kalus keadaannya tidak keruh dan tidak terlalu encer; •media cair yang digunakan sebaiknya sama dengan medium padat.

• Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena tidak perlu pemanasan untuk melarutkan agar-agar.

• Zat pengatur tumbuh yang sering ditambahkan 2.4-D dengan dosis 2 ppm

• Kalus yang diambil dari media padat sebaiknya kalus yang remah, lalu diletakkan di atas shaker dengan kecepatan putaran 120 rpm, sehingga pertumbuhan kalus menjadi lebih cepat.

• Sel dapat tumbuh cepat karena berada dalam media yang homogen dan gradual nutirisinya tidak ada, sehingga permukaan kalus menjadi lebih baik dalam berkontak dengan nutrisi dibandingkan dengan kalus yang tumbuh di media padat.

• Pertumbuhan sel yang cepat kalus dapat menyerap nutrisi dari dalam medium dengan sangat baik jika diimbangi dengan suplai zat hara secara teratur sehingga media tidak kehabisan nutrisi.

• Untuk mempercepat pertumbuhan sel dilakukan sub kultur yaitu penggantian media lama dengan media baru dengan interval waktu satu minggu atau dua minggu

• Ada dua cara untuk melaksanakan subkultur yaitu dengan membagi biomas menjadi dua bagian, kemudian setiap bagian ditambah dengan volume media yang sama, dengan demikian dari satu erlenmeyer akan menjadi dua erlenmeyer dan seterusnya.

• Dapat juga dilakukan dengan cara yang lain, yaitu biomas tetap, tetapi media ditambah menjadi dua kali lipat dari volume media semula

• Metode cair terbagi dua yaitu ; Metode Liquid static adalah metode cair tanpa penggojogan (lebih terkenal dengan sebutan metode Heller). Sebaliknya metode Liquid aqitatic adalah metode cair yang diinkubasinya berada di atas shaker (alat penggojogan) dengan kecepata putaran 120 rpm.

Keterangan :A.Eksplan digojog terus menerus di atas shaker hingga tumbuh plb dalam jumlah yang banyakB.Matikan shaker, angkat erlenmeyer dan diamkan selama 15 menit sehingga plb mengendapC.Medium diambil dengan pipet kemudian dibuangD.Tinggal endapan plb yang berbentuk bulatE.Plb dipindahkan ke dalam beberapa erlenmeyer baru dengan pinset untuk penjaranganF.Setiap erlenmeyer yang berisi plb diberi medium baru lagi dengan menggunakan pipetG.Dari satu buah plb dapat menjadi tujuh buah plb baru

shaker

B. Dilihat dari Cara PemeliharaanEksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat.

• Di dalam kultur jaringan terdapat tiga macam cara pemeliharaan :

1. Cara Satu Langkah (One Step Method)• Cara ini dilaksanakan bila kita ingin agar eksplan

langsung dapat tumbuh menjadi kalus dan planlet dalam satu medium.

• Cara ini dapat menggunakan berbagai macam media seperti WS, MS, LS, White, Street, WPM, Gamborg dan sebagainya.

• Karena tujuannya untuk menumbuhkan planlet, maka pada medium diberi zat tambahan antara lain sukrosa (gula tinggi) yaitu 20 – 60 g/liter, dimana sukrosa dalam jumlah normal adalah 20 g/liter. Zat tambahan lainnya adalah nitrogen, yaitu KNO3, auksin 2.4-D dan NAA

2. Cara Dua Langkah (Two Step Method)

• Jika kalus yang sudah berhasil tumbuh keadaannya setelah beberapa lama tetap saja menjadi kalus kalus ini tidak mau tumbuh menjadi planlet, maka cara dua langkah perlu dilakukan.

• Kalus harus dipindahkan ke media diferensiasi untuk menumbuhkan akar dan tunas. Karena untuk menumbuhkan eksplan hingga menjadi planlet dibutuhkan dua macam media, maka metode ini disebut metode dua langkah.

3. Cara Tiga Langkah (Three Step method)

• Cara pemeliharaan ini jarang dilaksanakan. Cara tiga langkah adalah untuk mendapatkan planlet yang lengkap dengan akar dan tunas dibutuhkan tiga macam media. Media pertama menumbuhkan kalus, medium kedua untuk menumbuhkan tunas, media ketiga untuk menumbuhkan akar.

Melakukan subkultur• Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan

akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah suatu massa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau pada irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada eksplan di media padat, sedangkan eksplan yang tumbuh pada medium cair adalah protokormus.

• Subkultur adalah usaha untuk mengganti media tanam kultur jaringan dengan media baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau protokorm dapat terpenuhi

a. Subkultur pada media cairMedia cair cepat sekali diserap oleh eksplan maupun

protokormus, maka setiap empat hari sekali harus diganti dengan media baru dengan komponen media yang persis sama dengan media cair yang lama. Kondisi aseptik

b. Subkultur pada media padatSubkultur pada media padat lebih mudah dilakukan, yaitu

hanya dengan meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas petridis kemudian dibelah menjadi bagian-bagian kecil lagi dengan menggunakan scalpel dan pinset. Setelah itu potongan kalus ditanam ke media baru yang isinya sama dengan media sebelumnya. Pelaksanaan harus steril.

Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan

• Secara umum permasalahan muncul dari bahan yang ditanam, lingkungan kultur, maupun dari manusianya.

• Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu:

• 1) Kontaminasi• Kontaminasi merupakan gangguan yang sangat

umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.

• Fenomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).

• Upaya mencegah terjadinya kontaminai.• Biasakan membersihkan berbagai sarana yang

diperlukan dalam kultur jaringan.• Yakinkan bahwa proses sterilisasi media

secara baik dan benar.• Lakukan proses penanaman bahan pada

keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar.

• Pencoklatan/browning• Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya

warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi.

• Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.

• 3) Vitrifikasi• Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada

kultur yang ditandai dengan:• Munculnya pertumbuhan dan yang tidak normal.• Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau

kerdil.• Pertumbuhan batang cenderung ke arah

penambahan diameter• Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.• Pada daunnya tidak memiliki jaringan palisade