Metode kuantifikasi lipid menggunakan spektroskopi FTIR sebagai “marker” sel

kanker yang diterapkan pada ekstrak sel kanker

Perubahan komposisi lipid membran sel juga muncul di awal karsinogenesis . Kuantifikasi berbagai molekul seperti lipid sebagai wujud modifikasi dalam

metabolisme sel-sel tumor dan dapat berfungsi sebagai penanda (marker) untuk diagnosis kanker dan pengobatan. Fourier Transform Infrared ( FTIR )

spectroscopy adalah alat yang ampuh yang digunakan untuk deteksi dan karakterisasi berbagai jenis molekul . Teknik ini tetap merupakan pendekatan

yang menarik karena murah ( peralatan dan reagen ) , tidak memerlukan pelarut kelas tinggi atau standar internal yang mahal , peralatan yang banyak tersedia di

laboratorium standar dan metode yang kuat dan cocok untuk analisis rutin . Dalam karya ini peneliti membuat partial least square ( PLS ) berdasarkan

spektrum FTIR yang mampu mengukur lipid dalam campuran kompleks seperti ekstrak sel . Pada bagian pertama , peneliti berusaha untuk membangun model PLS dengan spektrum FTIR. Kedua , model PLS yang diverifikasi menggunakan

spektrum FTIR campuran yang tidak memberikan kontribusi untuk kalibrasi . Yang ketiga validasi model pada ekstrak sel lipid . Dalam rangka untuk mendapatkan referensi nilai untuk ekstrak sel menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dilakukan oleh AVANTI . Distribusi lipid yang secara global mirip dengan kedua teknik Akhirnya , model yang . Peneliti mungkin tidak bisa membukti perubahan signifikan dalam komposisi lipid dari ekstrak sel setelah pengobatan ,. Namun, model didirikan pada penelitian ini muncul handal dan dapat diterapkan untuk

tinggi melalui menempatkan pengukuran . Kata kunci : FTIR, Kuantifikasi Lipid, PLS

Abstrak

Aktivasi metabolisme lipid adalah peristiwa awal karsinogenesis dan ciri dari kanker. Selama mitosis, sel-sel harus menyediakan sejumlah besar lipid dalam rangka membangun membran baru, Komposisi lipid membran sel tampaknya juga akan terpengaruh awal ketika sel-sel normal berubah menjadi sel-sel ganas. Modifikasi tersebut baru-baru ini dijelaskan untuk kanker payudara

Penelitian ini difokuskan pada lipid. Keragaman lipid dalam hal sifat fisik dan kimia mempersulit

analisis terutama dalam campuran yang kompleks. Saat

ini tidak ada metode analisis tunggal yang tersedia untuk

merekam lipidomic penuh sel dalam satu percobaan. dengan demikian pendekatan lipidomic

berusaha dikembangkan sejalan dengan kemajuan pesat dalam

sejumlah teknologi analitis (spektrometri massa, metode

komputasi)

Obat antitumor milik dua kelas :

Kelas pertama, anti mikrotubulus ( paclitaxel dan vincristine ) ,

mempengaruhi dalam mikrotubulus tertentu dan blok

pembentukan atau disosiasi aparatus yang memisahkan

kromosom ke dalam sel anak selama pembelahan sel .

Kelas kedua mencakup doxorubicin dan daunorubisin , mereka

menghambat perkembangan kelas II topoisomerase ,

mencegah DNA helix ganda dan karena itu menghentikan

pembelahan sel,

• beberapa publikasi menunjukkan bahwa obat ini dan terutama

antimicrotubules bisa mempengaruhi metabolisme lipid

Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy adalah alat yang ampuh yang digunakan untuk deteksi dan karakterisasi

berbagai jenis molekul. Spektrum FTIR biasanya diplot sebagai absorbansi sebagai fungsi dari bilangan gelombang . Mereka berisi puncak serapan yang muncul pada

panjang gelombang tertentu sesuai dengan berbagai getaran dari atom terikat yang

hadir dalam molekul sampel.. Spektrum IR mengandung maka banyak informasi pada

kedua struktur kimia molekul dan konformasinya. Menariknya, spektroskopi

FTIR terpolarisasi dilakukan pada monolayers lipid atau tumpukan multilayer

memberikan informasi tentang orientasi ikatan kimia yang berbeda. Lipid id deteksi pada panjang gelombang 1800–1700 cm−1)

PLS ( partial least square ) model yang didirikan untuk kuantifikasi lipid yang akan cocok untuk ekstrak lipid sel

.

•kalibrasi model PLS dengan IR spektrum campuran murni lipidTahap I

•model PLS telah divalidasi dengan IR spektrum campuranTahap II

•verifikasi penerapan model ini pada ekstrak sel lipid•model diaplikasikan pada jumlah lipid ekstrak yang berasal dari sel-sel yang tidak diobati dan yang dirawat dengan empat obat antikanker

Tahap III&IV

Pembuatan Spektra:-dilakukan dengan panjang gelombang 1780-1690 cm-1-dilakukan pembacaan pada tiap variasi campuran lipid-Regresi menggunakan persamaan RMESCV :

dimana np adalah jumlah spektrum di set prediksi, YPI adalah jumlah lipid diukur dengan teknik lain untuk spectrumi, dypl adalah perkiraan jumlah lipid oleh

model menggunakan spektrum i

Validasi di dengan lipid

Preparing PLS

spektra

Validasi di dengan ekstrak

lipid

Validasi sistem dengan HPLC

Pengujian sensitivitas

Persiapan Lipid dan campuran Lipid

Lipid murni dibeli dari Avanti, sedangkan Triolein and cholesterol dibeli dari Sigma Aldrich (Bornem, Belgium) Berbagai jumlah lipid murni digabungkan untuk melatih dan memvalidasi model berdasarkan spektra IR. Delapan campuran disiapkan, untuk mendapatkan variasi lipid ini. Tabel 1. Fosfatidilkolin (PC), kolesterol (CH)dan DOPE diawetkan pada konsentrasi 25 mg / ml, triolein pada 100 mg / ml sedangkan cardiolipin (CL), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS) serta sphingomyelin (SM) disimpan pada 10mg/ml dalam larutan cholorform pada suhu 20°C

EKSPERIMEN

Kultur sel dan Pengobatan

Sel kanker prostat manusia PC-3 (ACC 465) diperoleh dari Deutsche

Sammlung von und Mikroorganismen

Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Jerman)

dan dijaga sesuai dengan instruksi

Sel diinkubasi pada suhu 37 ° C di disegel (kedap

udara)

Sel disimpan dengan perlakuan tertentu

Hasil kultur

sel diuji dua kali sebulan

+ empat obat

antikanker yang digunakan di klinik

( daunorubisin , doxorubicin , paclitaxel ,

vincristine ) selama 24 jam pada

konsentrasi IC50

*IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi yang dibutuhkan untuk mengurangi pertumbuhan sel sel kanker sebesar 50 % setelah 72 jam kultur, konsentrasi ICdiperoleh dengan cara uji kolorimetri pada pekerjaan sebelumnya

Ditreatment dengan

larutan buffer trypsin (0.5 g/l,

EDTA 0.2 g/l) Disentrifu

se 2 menit

dicuci tiga kali dalam larutan isotonik (NaCl,

0,9%)sel dicuci dengan

DI water

Diperlukan ukuran 175cm2

untuk proses ektraksi lipid

Ekstraksi Lipid

• Penambahan 250 ml chloroform/500 ml metanol ke sel

Tahap I

• Penambahan 16,8 ml asam klorida (6M) dan 250μl kloroform

Tahap II

• Penambahan 250 μl air untuk menghilangkan garamnya murni

Tahap III

•Larutan yang dihasilkan di inkubasi pada suhu 4 ° C selama 1 jam dan sentrifugasi selama 5 menit untuk mengoptimalkan pemisahan antara dua fase.•Ekstrak lemak total akhirnya dikumpulkan dalam fase yang lebih rendah

Spektroskopi FTIR

Semua pengukuran dilakukan pada Bruker Equinox 55 FT - IR spektrometer ( Bruker , Karlsruhe , Jerman ) dilengkapi dengan elemen refleksi internal (kristal berlian) digunakan pada Golden Gate Micro - ATR dari Specac ( Orpington , Inggris ) . Sudut datang adalah 45 ° . Antara 1 dan 5μl dari ekstrak lipid disimpan pada kristal berlian dan diuapkan di bawah aliran gas N2 untuk membentuk film tipis . Dalam kondisi ini , penghapusan pelarut selesai dalam waktu kurang dari satu menit dan spektrum nya tidak berkembang lebih lanjut, pengukuran FTIR terekam pada 4000-6000 cm-1, Setiap spektrum diperoleh dengan rata-rata 256 scan yang direkam pada resolusi 2 cm - 1 . Antara tiga dan lima sampel diambil dari masing-masing ekstrak lipid sel untuk pengukuran inframerah . Percobaan direproduksi setidaknya tiga kali dan minimal sepuluh spektrum ekstrak lipid sel yang dihasilkan per kondisi

Hasil dan Pembahasan

Spektra IR dari 8 lipid murni disajikan pada Gambar . 1 . Daerah antara 3100 dan 2800 - cm 1 ( tidak ditampilkan )

sebagian besar didominasi oleh getaran peregangan kelompok C \ H dari gugus asam lemak , merupakan rantai hidrofobik panjang yang hadir di semua lipid

kecuali kolesterol . Interval 1800-650 cm - 1 (C=O band) merupakan tanda untuk setiap kelas lipid dan yang paling

berguna untuk membedakan kelas lipid. Band-band ini umumnya dapat ditugaskan untuk cincin kolesterol ,

tulang punggung gliserol dari fosfolipid , sphingolipids , kelompok kepala hidrofilik dan kelompok C \ H dari rantai

asam lemak hidrofobik .

Hampir seluruh wilayah spektral lipid antara 1800 dan 650 cm - 1 , dengan menggunakan semua spektrum mencerminkan variasi lipid (Tabel 1). Daftar campuran lipid yang digunakan untuk membangun model PLS.

Gambar. 3 menjelaskan evolusi root mean square error cross validasi (RMESCV) sebagai fungsi dari jumlah komponen PLS termasuk dalam masing-masing model. Ini adalah indikator pertama dari kinerja model.

•Penurunan RMSECV menunjukkan bahwa prediksi peningkatan kualitas PLS,•lipid(triolein dan cardiolipin) tidak disetuju untuk kuantifikasi dan dihilangkan dari analisis lebih lanjut.

Koefisien korelasi R dan RMSECV memungkinkan evaluasi kinerja model. Ketika RMSECV yang mendekati nol, konsentrasi lipid yang diprediksi akan mendekati nilai sebenarnya. Jika R mendekati 1, model adalah representasi yang baik dari data. Parameter kualitas ini untuk semua model dalam Tabel 2

Dalam bagian ketiga peneliti berusaha untuk memvalidasi model total ekstrak lipid sel. Nilai acuan untuk komposisi lipid dari ekstrak sel diperoleh dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan oleh AVANTI (Alabama, Amerika Serikat)

Persentase molar dihitung menggunakan berat molekul rata-rata untuk mendapatkan data sebanding dengan FTIR analisis sebelumnya Perbandingan antara FTIR berbasis PLS model dan nilai-nilai HPLC muncul dalam Tabel 3. Perbedaan terbesar (4,7%) Semua perbedaan lainnya berada di bawah 3%. Dengan tidak adanya konsentrasi CH disediakan oleh HPLC, konsentrasi CH tidak dapat divalidasi secara total ekstrak lipid sel

Dampak dari molekul antikanker distribusi lipid

spektrum rata-rata IR ekstrak lipid disajikan pada Gambar . 6A untuk setiap kondisi . spektrum IR ini sangat mirip satu dengan yang lain . Analisis statistik yang diterapkan untuk bukti variasi yang signifikan antara perawatan . pada Gambar . 6B . Bentuk spektrum perbedaan wujud variasi spektral mewakili modifikasi dalam distribusi kelas lipid yang disebabkan oleh pengobatan . Garis tebal menunjukkan panjang gelombang Gambar . 6B bahwa hanya spektrum dengan pengobatan vincristine mengungkapkan variasi yang signifikan . Model PLS yang diterapkan untuk spektrum dari total ekstrak lipid sel , hasil disajikan pada Tabel 4 . Mengingat akurasi model , tidak ada perbedaan yang signifikan dalam distribusi ini

Peneliti mengembangkan metode untuk kuantifikasi dari enam kelas lipid yang menyajikan beberapa keuntungan.

Jelas spektroskopi FTIR tidak dapat bersaing dengan pendekatan LC-MS/MS. Beberapa lipid tidak dapat diukur dan rantai distribusi tidak dapat dievaluasi. Namun, spektroskopi FTIR tetap merupakan pendekatan yang menarik karena murah (peralatan dan reagen), tidak memerlukan pelarut tinggi grade atau standar internal yang mahal, peralatan tersedia di laboratorium standar dan metode yang kuat dan cocok untuk analisis rutin.

Teknik ini dapat diterapkan untuk sampel dalam jumlah besar

Kesimpulan

Terimakasih