Ekstraksi Zat Warna Betalain dari Kulit Buah Naga Merah

PROPOSAL PENELITIAN

Diajukan untuk memenuhi Tugas Mata Kuliah Metodologi Penelitian

Oleh :

ESTY SYAMURIKHA

1101517/2011

PROGRAM STUDI KIMIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2014

i

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

rahnmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyusun proposal Praktikum Kimia

Analisis Terpadu II yang berjudul Ekstraksi zat warna betalain dari kulit buah naga merah .

Proposal penelitian ini ditulis sebagai pedoman untuk melaksanakan penelitian

dalam rangka menulis laporan tugas akhir kuliah yang merupakan salah satu syarat untuk

wisuda sarjana kimia.

Dalam menyusun proposal ini penulis banyak mendapat bantuan dari pembimbing

dan berbagai pihak. Oleh sebab itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan

terima kasih kepada kedua orang tua yang telah memberikan dukungan moril maupun

materil selama penulisan dan penyusunan proposal ini. Kepada dosen pembimbing

penelitian serta teman-teman seperjuangan yang telah banyak membantu.

Tentunya proposal ini tidak terlepas dari kekurangan, untuk itu penulis

mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca untuk menyempurnakan

proposal ini guna kelancaran penelitian sehingga mendapatkan hasil yang maksimal dalam

mengerjakan penelitian tugas akhir ini.

Padang, April 2014

Penulis

ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................... i

DAFTAR ISI ............................................................................................................................. ii

BAB I ........................................................................................................................................ 1

PENDAHULUAN .................................................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................................... 2

1.3 Batasan Masalah ............................................................................................................. 2

1.4 Tujuan ............................................................................................................................. 3

1.5 Manfaat ........................................................................................................................... 3

BAB II ....................................................................................................................................... 4

TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................................... 4

2.1 Daun Afrika Selatan ........................................................................................................ 4

2.2 Flavonoid ......................................................................................................................... 7

2.3 Kuersetin ....................................................................................................................... 14

2.4 Radikal Bebas ............................................................................................................... 16

2.5 Antioksidan ................................................................................................................... 17

2.6 Ekstraksi ........................................................................................................................ 18

2.7 Metode DPPH (Difenilpikril Hidrazil) ........................................................................ 20

2.8 Spektrofotometri UV-Vis .............................................................................................. 23

2.9 FTIR .............................................................................................................................. 26

BAB III ................................................................................................................................... 28

METODOLOGI PENELITIAN .............................................................................................. 28

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................................................... 28

3.2 Sampel Penelitian .......................................................................................................... 28

3.3 Alat dan Bahan .............................................................................................................. 28

3.4 Prosedur Penelitian ....................................................................................................... 28

iii

3.4.1 Penyamplingan dan Preparasi Sampel ................................................................... 28

3.4.2 Skrining Fitokimia ................................................................................................. 29

3.4.3 Ekstraksi ................................................................................................................. 31

3.4.4 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif .......................................................... 31

3.4.5 Uji Gugus Fungsi ................................................................................................... 33

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................. 34

BAB IV ................................................................................................................................... 36

JADWAL PELAKSANAAN PENELITIAN ......................................................................... 36

BAB V .................................................................................................................................... 37

ANGGARAN PENELITIAN ................................................................................................. 37

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tumbuhan merupakan tempat terjadinya sintesis senyawa organik yang

kompleks menghasilkan sederet golongan senyawa dengan berbagai macam

struktur. Flavonoid termasuk senyawa fenolik alam yang potensial sebagai

antioksidan dan mempunyai bioaktifitas sebagai obat. Senyawa-senyawa ini dapat

ditemukan pada batang, daun, bunga dan buah. Flavonoid dalam tubuh manusia

berfungsi sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker.

Pemanfaatan tumbuhan sebagai bahan utama dalam pengobatan telah menjadi

bagian dari kebudayaan hampir setiap bangsa di dunia (Lee,et al., 2000). Sekitar

60% penduduk dunia hampir sepenuhnya menggantungkan diri pada tumbuhan

untuk menjaga kesehatan (Farnsworth, 1994). Sedangkan menurut perkiraan

WHO, lebih dari 80% penduduk negaranegara berkembang tergantung pada

ramuan tradisional untuk mengatasi masalah kesehatan (Khan et al., 2002).

Selain pengobatan penyakit, terlebih dahulu kita dapat melakukan pencegahan

terhadap penyakit tersebut. Salah satunya adalah dengan mencegak pemicu terjadinya

penyakit tersebut. Saat ini penyakit yang marak terjadi salah satunya disebabkan

karena radikal bebas, seperti penyakit kanker, diabetes, serangan jantung, dan lain-

lain.

Eksplorasi bahan alami yang mempunyai aktivitas biologis menjadi salah

satu target para peneliti, setelah senyawa-senyawa sintetik yang mempunyai

aktivitas biologis seperti senyawa antioksidan sintetik (butylated hydroxytoluen

(BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), dan tertbutylhydroxyquinone (TBHQ))

dilarang penggunaannya karena bersifat karsinogenik. Berdasarkan beberapa

penelitian yang telah dikembangkan, senyawa-senyawa yang mempunyai potensi

sebagai antioksidan umumnya merupakan senyawa flavonoid, fenolat dan alkaloid.

1

Anti oksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul

lain. Tubuh tidak mempunyai system pertahanan antioksidatif yang berlebihan,

sehingga jika terjadi paparan radikal berlebih, tubuh membutuhkan antioksidan

eksogen. Kekhawatiran terhadap efek samping antioksidan sintetik menjadikan

antioksidan alami menjadi alternatif yang terpilih.

Kuersetin (Quercetin) adalah salah satu zat aktif kelas flavonoid yang secara

biologis amat kuat. Bila vitamin C mempunyai aktivitas antioksidan 1, maka

kuersetin memiliki aktivitas antioksidan 4,7. Kuersetin dipercaya dapat melindungi

tubuh dari beberapa jenis penyakit degenerative dengan cara mencegah terjadinya

proses peroksidasi lemak.

Indonesia sebagai negara tropis memiliki beraneka ragam tumbuhan yang

dapat dimanfaatkan sebanyak-banyaknya untuk kepentingan manusia. Masyarakat

Indonesia sejak zaman dahulu telah mengenal tanaman yang mempunyai khasiat

obat atau menyembuhkan berbagai macam penyakit. Tanaman yang berkhasiat

obat tersebut dikenal dengan sebutan tanaman obat tradisional.

Bagi kebanyakan orang nama Daun Afrika Selatan tentu agak asing. Di Indonesia

Daun Afrika Selatan (South Africa Leaf) memang belum terlalu memasyarakat.

Hanya golongan tertentu saja yang sudah sangat familiar dengan tanaman ini.

Penamaan Daun Afrika Selatan sendiri juga tidak jelas, mengapa dinamakan

demikian dan siapa yang menamakannya. Nama latin Daun Afrika Selatan juga masih

belum ditemukan. Belum ada literature atau Jurnal Akademik yang menulis tentang

tumbuhan ini.

Di Cina Daun Afrika Selatan ternyata sudah sejak dulu dikenal oleh masyarakat

sebagai tanaman obat yang sangat mujarab. Mereka menyebutnya Nan Fei Shu. Di

sebagian daratan Cina ada yang menyebut Nan Hui Ye. Konon tanaman ini dahulu

digunakan oleh kalangan petinggi di lingkungan kekaisaran Cina sebagai obat untuk

berbagai penyakit. Sehingga para petinggi pada masa kekaisaran Cina banyak yang

menanam Nan Fei Shu di halaman belakang rumah.

Di Asia Tenggara sendiri, terutama di Malaysia dan Singapura, Daun Afrika

Selatan sudah banyak sekali digunakan. Sebagian masyarakat Malaysia menyebutnya

2

dengan "Daun Kupu kupu" (butterfly leave) Kegunaan yang paling menonjol adalah

untuk pengobatan diabetes, hipertensi, mengurangi kolesterol jahat, asam urat,

pengerasan hati bahkan kanker hati dan pembuangan racun dari tubuh (detoksifikasi).

Tetapi sebenarnya masih banyak kegunaan Daun Afrika Selatan ini misalnya untuk

raumatik, susah tidur, kesemutan, demam, pusing kepala, menghilangkan flek flek

hitam silinder, infeksi kerongkongan, menghilangkan dahak, melancarkan buang

airseni, menguatkan fungsi lambung, batuk, menguatkan fungsi paru-paru dan masih

ada beberapa lagi. Satu catatan yang harus diketahui, bahwa sampai sekarang belum

ditemukan laporan dari penelitian akademis tentang Daun Afrika selatan ini. Semua

keterangan tentang khasiat Daun Afrika Selatan tersebut hanya berdasarkan kesaksian

dan pengalaman.

Berdasarkan uraian di atas maka penulis tertarik untuk melakukan penelitian

mengenai kandungan metabolit sekunder di dalam daun tanaman tersebut. Penelitian

yang dilakukan mengenai identifikasi kandungan metabolit sekunder, isolasi dan

karakterisasi kandungan metabolit terbanyak serta uji aktvitas antioksidan ekstrak

tanaman tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

Untuk lebih terarahnya penelitian ini, penulis membatasi masalah penelitian

pada identifikasi kandunagn metabolit sekunder dari daun tanaman Afrika Selatan,

isolasi dan karakterisasi ekstrak metabolit sekunder jenis flavonoid terkhusus pada

senyawa kuersetin. Serta uji aktivitas antioksidan senyawa kuersetinnya terhadap

menggunakan metoda spertrofotometri.

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan batasan masalah di atas maka rumusan masalah penelitian ini adalah:

1. Apakah jenis metabolit sekunder yang memiliki konsetrasi terbanyak di dalam

sampel daun tersebut ?

3

2. Apakah karakteristik metabolit yang terkandung dalam sampel daun tersebut ?

3. Apakah sampel daun tersebut mengandung senyawa kuersetin dan bagai mana

aktivitas antioksidan ekstrak senyawa tersebut jika ada ?

1.4 Tujuan

Adapun tujuan penelitian adalah sebagai berikut:

1. Mengidentifikasi kualitatif kandunagn metabolit sekunder di dalam sampel

daun afrika selatan.

2. Mengisolasi kandungan metabolit sekunder terbanyak di dalam sampel daun

afrika selatan menggunan metode ekstraksi.

3. Mengetahui karakterisasi spectrum FR-IR dari hasil ekstrak sampel daun

afrika selatan

4. Mengisolasi senyawa kuersetin serta uji aktivitas antioksidnya jika di temukan

dalam ekstrak flavonoid dan uji anti radikal metode DPPH menggunakan alat

spektrofotometer.

1.5 Manfaat

Setelah melakukan penelitian ini, diharapkan dapat memberikan manfaat

sebagai berikut:

1. Memberikan informasi tentang kandungan metabolit sekunder di dalam

sampel daun afrika selatan.

2. Meberikan pengetahuan karakteristrik spectrum FT-IR ekstrak metabolit

sekunder yang terbanyak terdapat dalam sampel daun afrika selatan.

3. Memberikan pengetahuan tentang kandunag senyawa kuersetin dan aktivitas

antioksidan dari ekstrak daun tersebut jika ada.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Daun Afrika Selatan

Bagi kebanyakan kita nama Daun Afrika Selatan tentu agak asing. Di

Indonesia Daun Afrika Selatan (South Africa Leaf) memang belum terlalu

memasyarakat. Hanya golongan

tertentu saja yang sudah sangat

familiar dengan tanaman

ini.Penamaan Daun Afrika Selatan

sendiri juga tidak jelas, mengapa

dinamakan demikian dan siapa yang

menamakannya. Nama latin Daun

Afrika Selatan juga masih belum

ditemukan. Belum ada literature

atau Jurnal Akademik yang menulis

tentang tumbuhan ini. Di Cina Daun

Afrika Selatan ternyata sudah sejak dulu dikenal oleh masyarakat sebagai tanaman

obat yang sangat mujarab. Mereka menyebutnya Nan Fei Shu. Di sebagian daratan

Cina ada yang menyebut Nan Hui Ye. Konon tanaman ini dahulu digunakan oleh

kalangan petinggi di lingkungan kekaisaran Cina sebagai obat untuk berbagai

penyakit. Sehingga para petinggi pada masa kekaisaran Cina banyak yang menanam

Nan Fei Shu di halaman belakang rumah.

Di Asia Tenggara sendiri, terutama di Malaysia dan Singapura, Daun Afrika

Selatan sudah banyak sekali digunakan. Sebagian masyarakat Malaysia menyebutnya

dengan "Daun Kupu kupu" (butterfly leave) Kegunaan yang paling menonjol adalah

untuk pengobatan diabetes, hipertensi, mengurangi kolesterol jahat, asam urat,

pengerasan hati bahkan kanker hati dan pembuangan racun dari tubuh (detoksifikasi).

Figure 1 Daun Afrika Selatan

5

Tetapi sebenarnya masih banyak kegunaan Daun Afrika Selatan ini misalnya untuk

raumatik, susah tidur, kesemutan, demam, pusing kepala, menghilangkan flek flek

hitam silinder, infeksi kerongkongan, menghilangkan dahak, melancarkan buang

airseni, menguatkan fungsi lambung, batuk, menguatkan fungsi paru-paru dan masih

ada beberapa lagi. Satu catatan yang harus diketahui, bahwa sampai sekarang belum

ditemukan laporan dari penelitian akademis tentang Daun Afrika selatan ini. Semua

keterangan tentang khasiat Daun Afrika Selatan tersebut hanya berdasarkan kesaksian

dan pengalaman. Selain itu beberapa tulisan mengatakan, bahwa konsumsi Daun

Afrika Selatan tidak dianjurkan untuk wanita yang sedang hamil dan selama

mengalami menstruasi. Apa alasannya sangat kurang jelas.

Walau demikian, kehadiran Daun Afrika Selatan di Indonesia ditanggapi

sangat positiv oleh banyak pecinca herbal. Bahkan beberapa ahli herbal berpendapat,

tanaman ini bisa membuka lembaran baru untuk kemajuan dunia herbal kita.

Informasi dari pengguna yang masuk pada kami mungkin bisa membenarkan

harapan/pendapat tadi. Yang jelas, terutama untuk pederita diabetes, banyak sekali

yang cocok dengan herbal ini.

Seperti kita ketahui, sampai saat ini sangat banyak tanaman obat yang biasa

dikonsumsi penderita diabetes untuk menurunkan kadar glukosa darah. Kita sebut

saja mulai dari sambiloto, brotowali, biji gambas, kunyit putih, mahoni, biji lamtoro,

mahkota dewa, sarang semut, daun sukun dan seterusnya. Mungkin tidaklah cukup

satu halaman bila semuanya kita sebutkan di sini. Namun penderita diabetes juga

mengetahui, bahwa efektifitas herbal-herbal tersebut juga sangat bervariasi.

Setidaknya kecocokan terhadap penderita/pemakai sangat berbeda-beda, yang secara

umum cukup rendah. Artinya ada yang betul-betuk cocok dengan biji buah apokat

sehingga kadar glukosanya bisa terkontrol dengan baik. Tetapi untuk penderita

lainnya,herbal yang sama kurang bermanfaat atau bahkan dirasanan tidak

membantu sama sekali. Itulah mungkin apa yang diharapkan oleh ahli herbal, bahwa

tanaman ini bisa membuka lembaran baru. Karena tingkat kecocokan Daun Afrika

Selatan khususnya untuk diabetes sangat tinggi.

6

Tidak sedikit para pengguna yang menyampaikan kepada kami, bahwa setelah

menkonsumsi Daun Afrika Selatan sakit kepala yang selalu datang hampir setiap hari,

secara tidak disadari menjadi tidak muncul lagi. Sehigga yang dahulu mereka selalu

menyediakan obat sakit kepala disakunya, sekarang tidak perlu lagi. Sepertinya Daun

Afrika Selatan memang mempuyai beberapa khasiat yang belum kita ketahui

(Kompas.com, juli 2012).

Menanam Tumbuhan Daun Afrika di Rumah

Bagi penderita diabetes, hipertensi dan

lainnya, mempunyai tanaman Daun Afrika Selatan di

rumah tentu merupakan kebutuhan sangat penting.

Hal ini tidak hanya untuk menjamin ketersediaan

herbal yang memang sangat dibutuhkan, tetapi secara

perlahan juga menghilangkan ketergantungan dengan

pengobatan lain yang mungkin cukup mahal

biayanya.Penanaman tumbuhan Daun Afrika Selatan

tergolong sangat mudah. Bisa dikatakan, jauh lebih

mudah dibandingkan dengan menanam singkong. Jadi

tinggal potong batangnya, ditancapkan dan hidup.

Apa lagi bila potongan batang disimpan dahulu di tempat persemaian sampai keluar

akarnya. Dalam hal ini harapan tumbuh benar-benar mendekati 100%.

Daun Afrika Selatan tidak memerlukan bidang tanah yang luas. Di halaman

yang tidak besarpun sudah cukup. Tanaman ini juga bisa ditanam di pot. Namun

Daun Afrika Selatan di pot, pertumbuhannya akan lambat. Karena itu diperlukan pot

yang ukurannya cukup besar (Syahrial Fauzi, 2014-02-18).

Cara pemakaian daun afrika selatan

Dikunyah secara mentah tiap hari satu helai daun atau diseduh dengan air

panas dengan menggunakan 3 sampai 5 lembar daun

Figure 2 Daun Afrika

Selatan

7

Bisa juga di masak atau digodok dengan air sebanyak 5 sampai 7 lembar daun

Sampai sekarang juga belum ditemukan

laporan dari penelitian akademis tentang

Daun Afrika selatan ini. Semua keterangan

tentang khasiat Daun Afrika Selatan

tersebut hanya berdasarkan kesaksian dan

pengalaman.Selain itu beberapa tulisan

mengatakan, bahwa konsumsi Daun Afrika

Selatan tidak dianjurkan untuk wanita yang

sedang hamil dan selama mengalami

menstruasi. Yang jelas Khasiat daun afrika selatan terutama untuk pederita diabetes,

banyak sekali yang cocok dengan herbal ini.

Tidak sedikit juga para pengguna setelah menkonsumsi Daun Afrika

Selatan ini sakit kepala menjadi tidak muncul lagi Sampai saat ini banyak juga

tanaman lain yang biasa dikonsumsi penderita diabetes untuk menurunkan kadar

glukosa darah mulai dari sambiloto, brotowali, biji gambas, kunyit putih, mahoni, biji

lamtoro, mahkota dewa, sarang semut, daun sukun dan seterusnya (Uncategorized on

December 22, 2013).

2.2 Flavonoid

Flavonoid termasuk senyawa fenolik alam yang potensial sebagai

antioksidan dan mempunyai bioaktivitas sebagai obat. Pigmen/ zat warna yang

terdapat dalam tumbuh-tumbuhan seperti zat warna merah, ungu, biru, kuning, dan

hijau tergolong senyawa flavonoid. Flavonoid dalam tubuh manusia berfungsi

sebagai antioksidan sehinggsa sangat baik untuk pencegahan kanker. Senyawa

flavonoid adalah senyawa-senyawa polifenol yang memiliki 15 atom karbon (C6-C3-

C6), terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier

yang terdiri dari tiga atom karbon (Gambar 4). Flavonoid mengandung sistem

aromatik yang terkonjugasi. Kebanyakan senyawa terkonjugasi pada umumnya

Figure 3 Daun Afrika Selatan

8

berwarna cerah sehingga menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah

spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak (Harborne JB., 1996).

Figure 4 Kerangka Dasar Flavonoid

Salah satu kelas yang banyak tersebar dari senyawa fenolat adalah flavonoid.

Golongan ini memberikan warna pada buah dan bunga. Flavonoid telah banyak

dikarakterisasi dan digolongkan berdasarkan struktur kimianya. Flavonoid adalah

senyawa fenolat yang terhidroklisasi dan merupakan senyawa C6-C3-C6 dimana C6

diganti dengan cincin benzena dan C3 adalah rantai alifatik yang terdiri dari cincin

piran. Ada 7 tipe flavonoid yaitu flavon, flavonol, khalkon, xanton, isoflavon, dan

biflavon (Agoes, A., 2011).

Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali

dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Disamping itu,

sering terdapat campuran yang terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas.

Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan mula mula didasarkan

pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Kemudian diikuti dengan

pemeriksaan ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis secara kromatografi

(Harbrone.J.B,1987).

Untuk mengetahui lebih jauh bagaimana flavonoid misalnya dalam suatu

herbal dapat berfungsi mengobati beberapa macam penyakit, perlu dicari lebih jauh

kandungan fitokimia yang lebih inci dari golongan flavonoid tersebut. Flavonoid

sendiri adalah suatu polifenol (polyphenols) (Shahriar Khadem and Robin J. Marles,

2010).

Polifenol dibagi dua kelompok, yang diberi nama flavonoid dan bukan

flavonoid (non-flavonoid polyphenols). Lihat gambar 5

9

Figure 5 Flavonoid dan Non-Flavonoid

Kelompok yang bukan flavonoid diklasifikasi menjadi: fenol sederhana

(simple phenols), asam benzoat, tannin yang bisa dihidrolisis, asetofenon

(acetophenones), asam fenilasetat, asam cinnamat (cinnamic acid), lignan, coumarin,

benzofenon, xanthon, stilbene, dan secoiridoids.

Di dalam tumbuhan flavonoid biasanya berikatan dengan gula sebagai

glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula tadi disebut glikon. Aglikon

flavonoid yaitu molekul yang tidak berikatan dengan gula adalah polifenol.

Flavonoid mudah mengalami perusakan karena panas, kerja enzim dan pH (Richa, Y,

2009).

Senyawa flavonoid juga berperan dalam memberikan banyak warna lain

dialam, terutama daun mahkota kuning dan jingga; bahkan flavonoid yang tidak

bewarna mengabsorb cahaya pada spektrum UV (karena banyak gugus kromofor)

dan dapat dilihat oleh banyak serangga. Senyawa ini diduga mempunyai

manfaat ekologi yang besar di alam berkat warnanya sebagai penarik serangga

dan burung untuk membantu penyerbkan tanaman. Flavonoid tertentu juga

berpengaruh rasa makanan secara signifikasi; misalnya beberapa tanaman

memiliki rasa pahit dan kesat seperti glikosida flavon narigin ada kulit

grapefruit (Citrus paradisi). Senyawa flavonoid diduga sangat bermanfaat dalam

makanan karena, berupa senyawa fenolik, senyawa ini yang bersifat antioksidan

kuat.( Heinrich et al, 2010 : 82).

Flavonoid memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada

bunga dan buah-buahan dialam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga,

10

antosianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang

terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis, flavonoid

memerankan peran penting dalam kaitan penyerbukan tanaman oleh serangga.

Sejumlah flavonoid mempunyai rasa pahit hingga dapat bersifat menolak sejenis

ulat tertentu. (Sastrohamidjojo, 1996 :140)

Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol terbesar yang ditemukan

di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru, dan

sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuhtumbuhan. Flavonoid

mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua

cincin benzene (C6) terikat pada suau rantai propane (C3) sehingga membentuk

suatu susunan C6-C3-C6. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur,

yakni 1,3-diarilpropan atau flavonoid, 1,2-diarilpropan atau isofalvonoid, dan 1,1-

diarilpropan atau neoflavonoid.

Hingga tahun 1997 ada lebih dari 4000 flavonoid yang telah ditemukan5.

Flavonoid dibagi lagi menjadi flavanon, flavon, dihidroflavonol, flavonol, flavan-3-

ol, isoflavon, anthocyanidin, proanthocyanidin dan chalcon dengan rumus bangun

C6-C3-C6 (Hollman PC, Katan M, 1997).

Figure 6 Flavanon

11

Figure 7 Flavon dan Flavonol

Figure 8 Struktur Flavan-3-ol. (catechins, epicatechins, theaflavins, and thearubigins)

Mekanisme kerja polifenol sebagai antioksidan dan anti radikal bebas diwakili oleh

golongan Flavonoid.

Senyawa yang secara umum mempunyai struktur bangun seperti gambar 9 adalah

suatu antioksidan, dan radical scavenger (Dragan Amic` et al, 2003).

12

Figure 9 Flavonoid

Dalam beberapa studi terdahulu telah menunjukkan pentingnya letak gugus

OH dari suatu fenol yang berfungsi sebagai anti radikal bebas, misalnya (lihat

Gambar 9) dua hidroksil pada cincin B ( 3 dan 4) yang dapat bertindak sebagai

donor elektron merupakan target dari radikal bebas. Hal yang sama juga terdapat pada

cincin A, yaittu 7-OH dan 8-OH. Adanya OH pada cincin C (terikat pada C3) dapat

berfungsi sebagai anti oksidan. Sedangkan ikatan rangkap pada C2-C3 yang bekerja

sama dengan gugus keto pada C4 dapat meningkatkan flavonoid sebagai radical-

scavenger, demikian pula adanya 3-OH dan 5-OH dikombinasi dengan 4-karbonil

juga dapat meningkatkan aktifitas flavonoid sebagai radikal scavenger (peredam

radikal bebas).

Gambar 9 adalah acuan terlengkap dari suatu flavonoid; namun tidak ada

senyawa yang mempunyai gugus OH dan keton selengkap itu. Dalam kenyataannya

adalah Flavonoid yang ditemukan di dalam herbal atau buah dapat digambarkan

seperti pada gambar 23 dan contohnya ada di tabel dalam gambar 11.

Anda perhatikan dalam tabel; senyawa Quercetin yang merupakan Flavonoid yang

banyak sekali diteliti. R8 = H, R2` dan R5` = H, ikatan rangkap C2=C3 ada, sehingga

Quercetin merupakan Flavonoid yang mempunyai anti oksidan dan radical

scavengers yang kuat. Memang R5` bukan OH namun adanya OH pada R3 dan R5,

keto pada C4 dan ikatan rangkap C2=C3 sudah cukup lengkap dalam meredam raikal

bebas.

13

Figure 10 Flavonoid

Dari sejumlah penelitian pada tanaman obat dilaporkan bahwa banyak

tanaman obat yang mengandung antioksidan dalam jumlah besar. Efek

antioksidan terutama disebabkan karena adanya senyawa fenol seperti

flavonoid,asam fenolat. Biasanya senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas

antioksidan adalah senyawa fenol yang mempunyai gugus hidroksi yang

tersubstitusi pada posisi orto dan para terhadap gugus OH dan OR.

Flavonoid dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan sehingga

sangat baik untuk pencegahan kanker. Manfaat flavonoid antara lain adalah

untuk melindungi struktur sel, meningkatkan efektivitas vitamin C, anti inflamasi,

mencegah keropos tulang, dan sebagai antibiotic. Dalam beberapa kasus, flavonoid

dapat berperan secara langsung sebagai antibiotic dengan mengganggu fungsi

dari mikroorganisme seperti bakteri atau virus. Fungsi flavonoid sebagai anti

virus telah banyak dipublikasikan termasuk untuk virus HIV/AIDS dan virus

herpes. Selain itu, flavonoid juga berperan dalam pencegahan dan pengobatan

beberapa penyakit lain (Wiji, Resti Agestia dan Sugrani, Andis, 2009).

Biosintesis flavanoid seperti pada Gambar 7 dimulai dengan

memperpanjang rantai fenil propanoid (C6-C3) yang berasal dari turunan sinamat.

Cincin A pada struktur flavonoid berasal dari jalur poliketida, merupakan

kondensasi dari tiga unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan tiga atom

karbon berasal dari jalur fenilpropanoid (jalur shikimat). Dengan demikian

14

flavonoid merupakan kombinasi dari dua jalur biosintesis cincin aromatik

(Sjamsul, 1986: 7-8).

Figure 11 Biosintesis Flavonoid Secara Umum

2.3 Kuersetin

Kuersetin adalah senyawa kelompok flavonol terbesar, kuersetin dan

glikosidanya berada dalam jumlah sekitar 60-75% dari flavonoid. Kuersetin

dipercaya dapat melindungi tubuh dari beberapa jenis penyakit degenerative dengan

cara mencegah terjadinya proses peroksidasi lemak. Kuersetin memperlihatkan

kemampuan mencegah proses oksidasi dari Low Density Lipoproteins (LDL)

dengan cara menangkap radikal bebas dan menghelat ion logam transisi.

15

Figure 12 Kuersetin

Ketika flavonol kuersetin bereaksi dengan radikal bebas, kuersetin mendonorkan

protonnya dan menjadi senyawa radikal, tapi elektron tidak berpasangan yang

dihasilkan didelokaslisasi oleh resonansi, hal ini membuat senyawa kuersetin radikal

memiliki energi yang sangat rendah untuk menjadi radikal yang reaktif.

Tiga gugus dari struktur kuersetin (Gambar 6) yang membantu dalam menjaga

kestabilan dan bertindak sebagai antioksidan ketika bereaksi dengan radikal bebas

antara lain:

1. Gugus O-dihidroksil pada cincin B

2. Gugus 4-oxo dalam konjugasi dengan alkena 2,3

Figure 13 Struktur Kuersetin

16

3. Gugus 3- dan 5- hidroksil

Gugus fungsi tersebut dapat mendonorkan elektron kepada cincin yang akan

meningkatkan jumlah resonansi dari struktur benzene senyawa kuersetin.

Kebanyakan flavonoid terikat pada gula dalam bentuk alamiahnya yaitu dalam

bentuk O-glikosida, dimana proses glikosilasi dapat terjadi pada gugus hidroksil

mana saja untuk menghasilkan gula. Bentuk glikosida kuersetin yang paling

umum ditemukan adalah kuersetin yang memiliki gugus glikosida pada posisi 3

seperti kuersetin-3-O--glukosida (gambar 7) (Wiji, Resti Agestia dan Sugrani,

Andis, 2009).

2.4 Radikal Bebas

Radikal bebas adalah atom atau gugus apa saja yang memiliki satu atau lebih

elektron tidak berpasangan. Karena jumlah elektron ganjil, maka tidak semua

elektron dapat berpasangan. Suatu radikal bebas dapat bermuatan positif atau

negatif, maka spesies semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron tidak

berpasangan. Sumber radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) yang terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran),

protein, karbohidrat, dan lemak yang kita konsumsi. Radikal bebas dapat pula

diperoleh luar tubuh (eksogen) yang berasal dari polusi udara, asap kendaraan,

berbagai bahan kimia, makanan, yang telah hangus (karbonated).

Figure 14 Quercetin-3-O--glucoside

17

Radikal bebas yang terbentuk di dalam tubuh akan merusak sel target seperti

lemak, protein, karbohidrat dan DNA. Radikal bebas disebut juga sebagai spesies

oksigen yang reaktif (ROS), suatu istilah yang mencakup semua molekul yang berisi

oksigen yang sangat reaktif. Istilah ROS merupakan radikal oksigen yang memusat

seperti superoksid (O2) dan hidroksil (OH) dan juga spesies bukanradikal yang

berasal dari oksigen seperti hidrogen peroksida (H2O2) singlet, oksigen (O2) dan

asam hipolorus (HOCl) (Richa, Y, 2009).

2.5 Antioksidan

Antioksidan adalah substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal

bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebasterhadap sel

normal, protein, dan lemak. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan

melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat

terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebasyang dapat menimbulkan

stres oksidatif. Ada beberapa bentuk antioksidan, di antaranya vitamin, mineral, dan

fitokimia. Berbagai tipe antioksidan berkerja bersama dalam melindungi sel normal

dan menetralisir radikal bebas. Anti oksidan adalah suatu inhibitor yang bekerja

menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif

membentuk radikal bebas tak reaktif yang relative lebih stabil.

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif

karena memiliki satu atau lebih electron tak berpasangan pada orbital terluarnya.

Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas akan bereaksi dengan

molekul disekitarnya untuk memperoleh pasangan electron. Reaksi ini akan

berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan akan

menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini,

serta penyakit degenerative lainnya. Oleh karena itu tubuh memerlukan suatu

substansi penting yaitu antioksidan yang mampu menangkap radikal bebas

tersebut sehingga tidak dapat menginduksi suatu penyakit (Wiji, Resti Agestia dan

Sugrani, Andis, 2009).

18

Sesuai mekanisme kerjanya antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama

merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen.

Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai

antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberi atom hidrogen secara cepat ke

radikal lipida (R, ROO) atau mengubahnya ke bentuk stabil, sementara turunan

radikal antioksidan (A) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal

lipid. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat

laju antioksidan dengan berbagai mekanisme di luar mekanisme pemutusan

rantai oksidan dengan mengubah radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Richa,

Y, 2009). Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada

lipida dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi.

Radikal-radikal antioksidan (A) yang terbentuk pada reaksi tersebut stabil dan

tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain

membentuk radikal lipida baru. Radikal-radikal antioksidan dapat saling

membentuk produk non radikal. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap

radikal lipid adalah sebagai berikut :

Inisiasi : R + AH RH + A

Propagasi : ROO + AH ROOH + A (Miryanti, Arry, dkk. 2011).

2.6 Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses pemisahan zat aktif yang dapat larut dari bahan yang

tidak dapat larut dengan pelarut cair. Hasil dari ekstraksi adalah ekstrak yang

merupakan berwujud seperti pasta kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani setelah pelarutnya

diuapkan. Syarat utama penggunaan pelarut untuk ekstraksi senyawa organik yaitu

non toksik dan tidak mudah terbakar (nonflammable) walapun persyaratan ini sangat

sulit untuk dilaksanakan. Pelarut untuk ekstraksi senyawa organik terbagi menjadi

19

golongan pelarut yang memiliki densitas lebih rendah dari pada air dan pelarut yang

memiliki densitas lebih tinggi dari pada air.

Kebanyakan pelarut senyawa organik termasuk dalam pelarut golongan

pertama, seperti misalnya dietil eter, etil asetat, dan hidrokarbon (light

petroleum, heksan dan toluen). Pelarut yang mengandung senyawa klorin seperti

diklorometan adalah pelarut yang termasuk dalam golongan pelarut kedua.

Pelarut ini memiliki toksisitas yang rendah tetapi mudah membentuk emulsi.

Beberapa pelarut yang biasa digunakan untuk ekstraksi diantaranya adalah

metanol, etanol, etil asetat, aseton dan asetonitril dengan air dan atau HCl.

Toksisitas pelarut yang digunakan merupakan hal yang penting untuk

dipertimbangkan dalam ekstraksi antioksidan, karena zat antioksidan akan

digunakan pada produk pangan fungsional sehingga keamanannya harus sangat

diperhatikan.

Beberapa senyawa kimia yang dapat diekstrak oleh pelarut organik berdasarkan

tingkat kepolaran pelarut tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.

Table 1 Polaritas dan Senyawa Kimia yang Diekstrak oleh berbagai Pelarut Organik

20

Proses ekstraksi daun afrika selatan untuk mendapatkan zat antioksidan

biasanya menggunakan proses maserasi yaitu cara ekstraksi sedederhana untuk

mengekstrak simplisia yang mengandung komponen kimia yang mudah larut

dalam cairan pelarut. Prinsip maserasi adalah mengekstraksi komponen yang

terkandung dan dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan

pelarut yang sesuai pada temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairanpelarut akan

masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya

perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan

yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan pelarut

dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai

terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel.

Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan. Keuntungan dari

metode ini adalah peralatannya sederhana. Sedang kerugiannya adalah cairan

pelarut yang digunakan lebih banyak (Anonim a. 2009).

Untuk mendapatkan antioksidan dari tumbuh-tumbuhan dilakukan ekstraksi

dengan pelarut berdasarkan tingkat kelarutan senyawa tersebut. Senyawa alkoholik

seperti etanol, metanol, dan propanol merupakan pelarut untuk mengekstraksi

semua golongan flavonoid. Pelarut yang lebih polar digunakan untuk

mengekstraksi glikosida flavonoid.

2.7 Metode DPPH (Difenilpikril Hidrazil)

Pengujian antiradikal bebas senyawa-senyawa bahan alam atau hasil

sintesis secara UV-Tampak dapat dilakukan secara kimia menggunakan DPPH

(difenilpikril hidrazil). DPPH berfungsi sebagai senyawa radikal bebas stabil

yang ditetapkan secara spektrofotometri melalui persen peredaman absorbansi.

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) merupakan radikal bebas stabil berwarna

ungu yang digunakan secara luas untuk pengujian kemampuan penangkapan

radikal bebas dari beberapa komponen alam seperti komponen fenolik. Metode

21

DPPH berfungsi untuk mengukur electron tunggal seperti transfer hidrogen

sekaligus juga untuk mengukur aktivitas penghambatan radikal bebas dengan reaksi :

DPPH+ AH DPPH-H + A

Campuran reaksi berupa larutan sampel dan DPPH yang dilarutkan dalam

etanol absolut dan diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit dan dibaca pada

panjang gelombang 517 nm. Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat, reliabel,

relatif cepat dan praktis (Richa, Y. 2009).

Sebagai akibatnya, penambahan senyawa yang bereaksi sebagai

antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH ini. Adanya penurunan

konsentrasi DPPH akan menyebabkan penurunan absorbansinya dibandingkan

dengan absorbansi kontrol yang tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga

mempunyai aktivitas antiradical. Mekanisme penghambatan radikal DPPH dapat

dilihat pada Gambar 8.

Figure 15 Mekanisme Penghambatan Radikal DPPH

Berikut akan ditampilkan contoh mekanisme reaksi senyawa antioksidan

dengan DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan

sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau

22

ekstrak bahan alam. DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen akan membentuk

molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara

transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter

radikal bebas dari DPPH, mekanisme reaksi dapat dilihat pada gambar 9. Jika

semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan

berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang

gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini dapat diukur secara stoikiometri

sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang ditangkap oleh molekul

DPPH akibat adanya zat antioksidan.

Figure 16 mekanisme reaksi senyawa antioksidan dengan DPPH

Pengujian antioksidan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif terhadap ekstrak etil

asetat dan fraksi C dengan metode DPPH. DPPH merupakan radikal sintetik yang stabil,

larut dalam pelarut polar. Kemampuan untuk meredam radikal DPPH (inhibisi) dihitung

menggunakan persamaan :

23

Selanjutnya dilakukan perhitungan IC50 yang merupakan konsentrasi sampel untuk dapat

meredam 50 % aktivitas radikal DPPH. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara

50% daya inhibisi dengan konsentrasi sampel (Goyal dkk., 2010).

2.8 Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometer UV-VIS merupakan alat dengan teknik spektrofotometer

pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan guna mengukur serapan

sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.

Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh

zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Spektrofotometer UV-VIS dapat digunakan

untuk analisis kualitatif maupun analisis kuantitatif.

Spektrofotometer Uv-Visible adalah suatu instrumen untuk mengukur

transmitan / absorbans suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, pengukuran

terhadap sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal.

Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :

Spektrofotometer ultraviolet (180-350 nm)

Spektrofotometer sinar tampak (350-800 nm)

Spektrofotometer infra merah (25-1000 m)

Spektrofotometer serapan atom

Berdasarkan system optiknya terdapat 2 jenis Spektrofotometer

Spektrofotometer single beam (berkas tunggal)

Pada alat ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui kuvet.

Blanko, larutan standar dan contoh diperiksa secara bergantian.

Spektrofotometer double beam (berkas ganda)

24

Berbeda dengan single beam, pada alat ini sinar dari sumber cahaya dibagi

menjadi dua berkas oleh cermin yang berputar. Berkas pertama melalui kuvet berisi

blanko dan berkas kedua melalui kuvet berisi standar atau contoh. (Sylvi,2006).

Saat sumber cahaya dihidupkan, cahaya yang berasal dari sumber tersebut

akan mengenai monokromator yang berfungsi mengubah sinar polikromatis menjadi

sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran dan kemudian cahaya

yang telah di filter memasuki sampel cell yang didalamnya terdapat sampel dan

kemudian sampel akan menyerap cahaya tersebut atau mengalami absorbs. Dimana

energi cahaya yang diserap atom/molekul tersebut digunakan untuk bereksitasi ke

tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Absorbs hanya terjadi jika selisih kedua

tingkat energi elektronik tersebut bersesuaian dengan energi cahaya (foton) yang

datang yakni E = Efoton. Kemudian cahaya yang melewati sampel akan sampai di

detector, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu isyarat

listrik, dan kemudian dilanjutkan ke pengganda (amplifier), dan rangkaian yang

berkaitan membuat isyarat listrik itu memadai untuk dibaca. Dan akhirnya sampai di

suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik,

menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Absorbansi (A) (Skoog, et

al., 1996).

Spektrometer Uv-Vis dapat digunakan misalnya untuk mengukur kadar

logam. UV/Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif

penentuan larutan dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa

organik.

a) Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya)

karena elektron dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik

lainnya. Warna larutan ion logam sangat dipengaruhi oleh kehadiran spesies

lain, seperti anion tertentu atau ligan. Sebagai contoh, warna larutan

encertembaga sulfat adalah biru yang sangat terang;

25

menambahkanamonia meningkat dan perubahan warna panjang gelombang

serapan maksimum ( m a x )

b) Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat

tinggi konjugasi, juga menyerap cahaya pada daerah UV atau terlihat

dari spektrum elektromagnetik. Pelarut untuk penentuan ini sering air untuk

senyawa larut dalam air, atau etanol untuk senyawa organik yang

larut. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang

signifikan; tidak semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam

spektroskopi UV. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang

gelombang.).Polaritaspelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan

spektrum senyawa organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan

maksimum dan koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau

ketika polaritas pelarut berkurang C.

c) Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna sering

terlalu kuat untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Hukum Beer-

Lambert menyatakan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan

konsentrasi spesies menyerap dalam larutan dan panjang jalan.

Jadi, UV / VIS spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi

dalam larutan penyerap dan mengetahui seberapa cepat perubahan absorbansi dengan

konsentrasi.

Cara Penggunaan Alat :

1) Nyalakan PC dan boot sistem operasi PC. Jika printer telah terhubung ke

sistem, maka nyalakan printer.

2) Nyalakan spektrofotometer dan tunggu sampai cahaya indikator

spektrofotometer berwarna hijau. Proses ini meliputi pengujian

spektrofotometer dan mengambil waktu sekitar 1 menit.

3) Letakkan sampel yang telah dimasukkan kedalam kuvet pada sample

compartment. Sebelum sample di ukur, preparasi sample terlebih dahulu.

26

4) Kita siap untuk menggunakan sistem.

5) Lampu hijau akan berkedip, hal ini bahwa menunjukkan pengukuran sedang

berlangsung.

6) Jika spektrofotometer berhenti, hal ini menunjukkan bahwa pengukuran telah

siap berlangsung.

7) Data absorbansi dan spektrum akan terbaca di komputer, yang berbentuk grafik

hubungan antara panjang gelombang dengan absorbansi (Sylvi, Permata,

Intania. 2006).

2.9 FTIR

Suatu senyawa bila dilewati oleh sinar infra merah, sejumlah frekuensi akan

diserap dan sebagian lagi diteruskan/ditransmisikan oleh senyawa tersebut. Molekul

organik pada suhu normal memiliki keadaan vibrasi yang tetap, setiap ikatan

mempunyai frekuensi rentangan/stretchingdan bendingyang karakteristik.dan dapat

menyerap sinar pada frekuensi yang spesifik. Banyak faktor yang mempengaruhi

ketepatan frekuensi vibrasi molekul, dan biasanya tidak mungkin untuk mengisolasi

satu pengaruh dari yang lain.

Intensitas pita serapan dalam spektra infra merah tidak dapat dengan mudah

diukur dengan ketepatan yang sama seperti spektra UV. Biasanya untuk ahli

organik cukup mengetahui bahwa intensitas serapan adalah kuat, medium,

lemah, atau tak menentu. Dengan pengujian sejumlah besar senyawa-senyawa

yang telah diketahui serapan-serapan infra merah yang dikaitkan dengan gugus

fungsional, dapat diperkirakan kisaran frekuensi di daerah setiap serapan harus

muncul. Dalam menganalisis suatu spektra yang tak dikenal, perhatian harus

dipusatkan pada penentuan ada atau tidaknya beberapa gugus fungsional utama

seperti C=O, O-H, N-NH, C-O, C=C, CC, CN, dan NO2 (Hardjono, 2007:45-82).

Pada Tabel 1 disajikan beberapa serapan IR karakteristik pada gugus fungsi utama.

27

Table 2 Serapan IR karakteristik pada gugus fungsi utama

28

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan September sampai dengan

Desember 2014 di Laboratorium Penelitian Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Negeri Padang.

3.2 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman afrika

selatan yang diperoleh dari Daerah Anduring Selatan, Kota Padang Sumatera Barat.

3.3 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu lumpang dan alu, blender, plat

tetes, pipet tetes, tabung reaksi, gelas ukur, gelas piala, labu ukur, pipet gondok, pipet

takar, batang pengaduk, spatula, corong, rotary evaporator, kolom, corong pisah,

neraca analitik digital, spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, hot plate, penangas air, labu

semprot, bola hisap, standar dan klame, botol vial.

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan untuk penelitian adalah

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Penyamplingan dan Preparasi Sampel

Sebanyak 5 kg daun afrika selatan dicuci bersih dengan air mengalir kemudian

dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dengan cara dimasukkan dalam oven

dengan suhu 40oC selama 7 hari hingga kering dan selanjutnya dihaluskan

29

menggunakan blenderlalu diayak sehingga diperoleh serbuk halus yang

digunakan sebagai sampel penelitian (Risma Meidy Hardina Sitorus).

3.4.2 Skrining Fitokimia

Sampel segar sebanyak 2 gram dipotong halus dan dimasukan ke dalam tabung

reaksi, kemudian dimaserasi dengan metanol yang telah dipanaskan (di atas

penangas air) selama 15 menit. Kemudian disaring panaspanas ke dalam tabung

reaksi lain dan biarkan seluruh metanol menguap hingga kering. Lalu

ditambahkan kloroform dan aquades dengan perbandingan 1:1 masingmasingnya

sebanyak 5 mL, kocok dengan baik, kemudian pindahkan ke dalam tabung reaksi,

biarkan sejenak hingga terbentuk dua lapisan kloroform-air. Lapisan kloroform di

bagian bawah digunakan untuk pemeriksaan senyawa triterpenoid dan steroid.

Lapisan air digunakan untuk pemeriksaan senyawa flavonoid, fenolik, dan

saponin (Meri Mulyani).

3.4.2.1 Pemeriksaan Flavonoid (Sianidin Tes)

Sebagian dari lapisan air diambil dan dipindahkan dengan menggunakan pipet ke

dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan asam klorida pekat dan beberapa

butir bubuk magnesium, terbentuknya warna jingga sampai merah menunjukkan

adanya flavonoid (kecuali untuk flavon) (Meri Mulyani).

3.4.2.2 Pemeriksaan Fenolik

Sebagian dari lapisan air diambil dan dipindahkan dengan pipet ke dalam

tabung reaksi kecil, kemudian tambahkan pereaksi besi (III) klorida,

terbentuknya warna biru/ungu menandakan adanya senyawa fenolik (Meri Mulyani).

30

3.4.2.3 Pemeriksaan Saponin

Dari lapisan air, kocok kuat-kuat dalam sebuah tabung reaksi, terbentuknya busa

yang tidak hilang dengan penambahan beberapa tetes asam klorida pekat

menunjukkan adanya saponin (Meri Mulyani).

3.4.2.4 Pemeriksaan Triterpenoid dan Steroid (Liebermann-Burchard)

Dari lapisan kloroform diambil sedikit dan dimasukkan ke dalam dua lubang

plat tetes, biarkan hingga kering. Ke dalam satu lubang plat tetes ditambahkan

asam sulfat pekat, ke dalam lubang plat tetes lainnya ditambahkan setetes

anhidrida asetat dan setetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna hijau atau hijau

biru menandakan adanya steroid, sedangkan bila terbentuknya warna merah atau

merah ungu menandakan adanya triterpenoid (Meri Mulyani).

3.4.2.5 Pemeriksaan Alkaloid (Culvenor-Fitzgeraid)

Sampel sebanyak 2 4 gram dipotong kecil-kecil, kemudian dihaluskan dalam

lumpang dengan penambahan sedikit pasir dan 10 mL kloroformamoniak

0,05N, kemudian diaduk dan digerus perlahan. Larutan disaring dengan corong

kecil, di dalamnya diletakkan kapas sebagai penyaring dan hasil saringan

dimasukkan ke dalam sebuah tabung reaksi, kemudian tambahkan 10 tetes asam

sulfat 2N dan kocok secara perlahan. Biarkan sejenak sampai terbentuk

pemisahan lapisan asam dan kloroform. Lapisan asam diambil dengan bantuan

pipet dan dipindahkan ke dalam tiga tabung reaksi kecil. Kemudian tambahkan

pereaksi Meyer pada tabung pertama, reaksi positif ditandai dengan adanya

endapan putih (+4), kabut putih tebal (+3), kabut putih tipis (+2), kabut putih

sangat tipis (+1). Kemudian pereaksi Wagner yang akan menunjukan endapan coklat

31

untuk reaksi positif (+). Serta endapan orange dengan pereaksi Dragondrof pada

tabung reaksi ketiga (Meri Mulyani).

3.4.3 Ekstraksi

Serbuk daun ketapang 0,75 Kg dimaserasi menggunakanpelarut etil asetat

dilanjutkan dengan etanol secara berurutan masing-masing selama3x24 jam. Ekstrak

etil asetat maupun ekstrak etanol dipekatkan.

3.4.4 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif

Ekstrak Etanol dan Etil Asetat Ekstrak etanol dan etil asetat di lakukan KLT

menggunakan campuran pelarut nbutanol, asam asetat anhidrida dan akuades.

Perbandingan pelarut untuk ekstrak etil asetat yaitu 4:1:3, sedangkan untuk ekstrak

etanol menggunakan perbandingan 4:1:5. Setelah elusi selesai, lempeng dikeringkan

dan disemprot dengan larutan 0,05 mM DPPH dalam etanol. Uji positif yang

bersifat anti radikal bebas menghasilkan bercak kuning dengan latar belakang

ungu dalam waktu 20 menit. Uji aktivitas antioksidan secara kualitatif juga dilakukan

pada quersetin yang digunakan sebagai standar antioksidan. Ekstrak etanol

memberikan peredaman terbesar terhadap perubahan warna DPPH, dilanjutkan

pemisahan senyawa dengan kromatografi kolom.

3.4.4.1 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom dibuat dari silika gel 60H sebagai fasa diam. Adapun

perbandingan campuran pelarut yang digunakan adalahn-heksan : kloroform : etil

asetat yaitu 1 : 2 : 3, etil asetat, etil asetat : etanol yaitu (14 : 1), (12 : 3), (10 : 5), (8 :

7), (6 : 9), (4 : 11), (2 : 13) dan etanol. Fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom

dianalisis dengan KLT menggunakan campuran pelarut n-butanol, asam asetat

32

anhidrida, akuades dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Fraksi yang memiliki noda yang

sama atau mirip dijadikan satu fraksi besar.

3.4.4.2 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif pada Fraksi Kolom

Fraksi kolom dilakukan KLT dengan campuran pelarut n-butanol, asam asetat

anhidrida dan akuades dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Setelah elusi selesai,

lempeng dikeringkan dan disemprot dengan larutan 0,05 mM DPPH dalam etanol.

Fraksi kolom yang memberikan peredaman terbesar terhadap perubahan warna

DPPH dilanjutkan dengan penentuan aktivitas antioksidan secara kuantitatif.

3.4.4.3 Uji Antioksidan dengan Peredaman Warna DPPH

3.4.4.3.1 Skrining Panjang Gelombang Maksimal Larutan DPPH0,05 mM

Larutan 0,05 mM DPPH dalam etanol diukur panjang gelombang maksimum dan

nilai absorbansinya. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji

larutan ekstrak etanol dan dan fraksi kolom terpilih yang memberikan peredaman

warna DPPH yang paling besar. Hal yang sama dilakukan pada kontrol untuk standar

yaitu quersetin.

3.4.4.3.2 Operating time Larutan Uji Ekstrak Daun Afrika Selatan

Larutan uji dari ekstrak etanol dan fraksi kolom terpilih yang memberikanperedaman

warna DPPH yang paling besar dibuat berbagai konsentrasi. Konsentrai ekstrak

uji yang dibuat adalah 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% (b/v). Fraksi kolom

0,1% diambil untuk dilakukan operating time. Operating time dilakukan dengan

cara 50 L ekstrak sampel ditambah larutan 0,05 mM DPPH dalam etanol

sebanyak3 mL. Larutan uji tersebut diukur pada menit ke-10, 20, 30, 40, 50, 60 pada

33

panjang gelombang maksimum 515 nm yang telah di peroleh. Selisih absorbansi

terbesar pada setiapwaktu merupakan operating time.

3.4.4.3.3 Penentuan Aktivitas Antioksidan

Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara 3 mL larutan DPPH

dalam etanol 0,05 mM ditambah dengan 50 L ekstrak laruta n uji. Konsentrasi

standar quersetin yang dibuat adalah 0,01% , 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% (b/v).

Campuran didiamkan selama waktu operating timeyang telah diperoleh. Larutan ini

kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 515 nm. Besarnya

konsentrasi ekstrak larutan uji untuk meredam 50% aktivitas radikal bebas

ditentukan dengan nilai IC50. IC50 dihitung dari persentase penghambatan

serapan larutan ekstrak dengan menggunakan persamaan yang diperoleh dari kurva

regresi linier (Rahayu ,Dwi Sri, dkk).

Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian

diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang 517 nm. Setelah absorbansi didapat, besarnya persentase pengikatan

radikal bebas (persen inhibisi) dihitung dengan rumus berikut :

Nilai IC50 merupakan konsentrasi dimana ekstrak dapat menangkap radikal bebas

sebesar 50% yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linear y = a + bx.

3.4.5 Uji Gugus Fungsi

34

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, A., 2011. Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: Salemba Medika.

Anonim a. 2009. Ekstraksi. http://www.blogpribadi.com/2009/07/jenisjenisekstraksi.

Barve D & Pandey N, 2011. Phytochemical and Pharmacological Review on

Annona squamosa Linn. International Journal of Research in

Pharmaceutical and Biomedical Sciences. Vol. 2(4).

Dragan Amic` et al. (2003). Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of

Flavonoids. CROATICA CHEMICA ACTACCACAA76(1) 55-61

Fessenden dan Fessenden. 1982. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga.

Goyal, A.K., Middha, S.K., dan Sen, A., 2010, Evaluation of the DPPH radical

scavenging activity, total phenols and antioxidant activities in Indian

wild Bambusa vulgaris Vittata methanolic leaf extract, Journal of

Natural Pharmaceuticals, volume 1, issue 1.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Terjemahan Padmawinata, K., dan Soediro, I., Bandung: Penerbit

ITB.

Heinrich, M. dkk. 2009. Farmakognosi dan Fitoterapi. (Penerjemah) Hadinata,

Amalia, H. Jakarta : EGC. Hollman PC, Katan MB. Absorption, metabolism

and health effects of dietary flavonoids in man. Biomed Pharmacother 1997

51:305-10

Houghton, Peter J. and A. Rahman. 1998. Laboratory Handbook for the

Fractionation of Natural Extracts. London: Chapman and Hall.

Kompas.com, juli 2012. naturindonesia.com

35

Miryanti, Arry, dkk. 2011. Ekstrak Antioksidan dari Kulit Manggis (Garcinia

mangostana L.). Bandung: Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat.

Universitas Katolik Pahrayanagn.

Rahayu, Dwi Sri. Penentuan Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak EtanolDaun

Ketapang (Terminalia catappaL) dengan Metode 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil

(DPPH). Diponegoro: Labortorium Kimia Organik, Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Diponegoro

Richa, Y. 2009. Uji aktivitas penangkap radikal dari ekstrak petroleumeter, etil

asetat dan etanol rhizoma binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen)

dengan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil). Skripsi Fakultas Farmasi,

Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta : Gadjah Mada

University press.

Skoog, et al. 1996. Principles of Instrumental Analysis. Thomson Brooks/Cole.

Syahrial Fauzi. 2014-02-18. Daun Afrika Selatan, Obat Herbal Diabetes.

Sylvi, Permata, Intania. 2006. Modul Analisis Spektrofotometri UV-Vis. Padang:

Sekolah Menengah Analis Kimia

Teyler.V.E.et.al. 1988. Pharmacognosy Edition 9th. 187 188. Phiadelphia : Lea &

Febiger.

Wiji, Resti Agestia dan Sugrani, Andis, 2009. Makalah Kimia Organik Bahan Alam

Quercetin). Program S2 Kimia.Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam.Universitas Hasanuddin.

WordPress.com site. Daun Afrika Selatan. Uncategorized on December 22, 2013

36

BAB IV

JADWAL PELAKSANAAN PENELITIAN

Penelitian ini direncanakan akan dilaksanakan pada bulan Juli sampai

September 2013. Penelusuran dan studi telah dilakukan sejak juni 2014. Adapun

rancangan jadwal penelitian adalah sebagai berikut :

No Kegiatan

Okto

ber

Novem

ber

Desem

ber

Januari

Feb

ruari

Maret

April

Mei

1. Pembuatan dan perbaikan

proposal

2. Seminar proposal

3. Persiapan dan penelitian

4. Pengolahan data dan

penyusunan hasil

Penelitian

37

BAB V

ANGGARAN PENELITIAN

Biaya penelitian ini diperkiraan sebesar Rp 3.400.000,00 (satu juta delapan

ratus ribu rupiah) dengan rincian sebagai berikut :

1. Persiapan dan Perbanyakan Proposal Rp 200.000,00

2. Biaya Operasional

a. Zat yang dibutuhkan Rp 2.000.00,00

b. Pengumpulan Data Rp 200.000,00

c. Pemakaian Spektro UV Rp 200.000,00

3. Penulisan dan Perbanyakan laporan Rp 300.000,00

4. Biaya tak terduga Rp 500.000,00+

Rp 3.400.000,00