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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE

LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES FEBRILES ERUPTIVAS.

COMITI RESPONSABLE:

DR. CARLOS CARRILLO PARODI BLGO. ROSA PALACIOS SALVATIERRA

BLGO. MIGUEL COBOS ZELADA

COLABORADORES: LIC. MIRIAM STRUL - MINSA/PAI

LIC. ROSA MARÍA CARDOSO - OPS - OMS DR. FERNANDO PÉREZ CÁRDENAS. PAI/OPS

BLG. ANA CECILIA ORTIZ BLG. MAGNA SUÁREZ SRTA .NELLY ROJAS

SRTA. MARÍA PAQUITA GARCÍA

COMITÉ EDITOR: DR. ALFONSO ZAVALETA M.V. DRA. ANA MARIA ESPINOZA S.

DR. CESAR CABEZAS S. LIC. LILIANA VIGIL E.

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NAOONAL DE SALUD

CAPAC YUPANQUI 1400 LIMA 11, PERÚ

TEL. 471-3254 FAX 471-7443

AUSPICIO: ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD OPS/OMS

1995

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PRESENTACION

La presente Norma Técnica constituye la continuaci6n de la Serie de Normas que el Instituto Nacional de Salud inició en 1991, con la finalidad de difundir, normar y actualizar las técnicas de trabajo de laboratorio utilizadas en ésta sede, fortaleciendo de ésta manera la Red Nacional de Laboratorios de Salud.

En circunstancias del inicio de acciones del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión, consideramos necesaria y oportuna la publicaci6n de este Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de Laboratorio de las Enfermedades Febriles Eruptivas, el cual brindará la información necesaria a los laboratorios de los diversos niveles de la red para que participen apoyando la vigilancia epidemiológicay los programas de control.

DR. CARLOS CARRILLO PARODI Jefe Instituto Nacional de Salud

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CONTENIDO

1. Introducción

Objetivos - Alcance

Generalidades

2. Normas de Bioseguridad en el Laboratorio

3. Criterios para la selección de casos

4. Criterios para la selección de muestras

5. Obtención y procesamiento de muestras para estudio serológico

6. Obtención y procesamiento de muestras para estudio virológico

7. Conservación y transporte de muestras

8. Identificación de muestras

9. Técnicas de Diagnóstico

10. Anexos

I. Preparación de medios y re activos

II. Ficha de investigación epidemiológica

III. Diagramas

IV. Ilustraciones

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INTRODUCCION

Las enfermedades febriles eruptivas (EFEs) de alta transmisibilidad, principalmente sarampión y rubéola. y en áreas endémicas el dengue, continúan siendo un problema de salud en diversos grupos poblacionales. a pesar de la disponibilidad de vacunas eficaces y el fomento de programas extensivos de prevención. por lo cual se hace necesario intensificar su vigilancia.

Varios factores ameritan la necesidad de contar con el diagnóstico confirmatorio

diferencial de laboratorio; así, se sabe que al verse reducido el número de casos genuinos de una de éstas entidades, puede incrementarse la probabilidad de diagnósticos erróneos entre ellas. También cuando la inmunidad pasiva persiste, la infección subsiguiente puede ser modificada pero no prevenida por la inmunización, y en general el significado del hallazgo de casos confirmados se acentúa cuando existe la intención de eliminar una enfermedad, ya que la vigilancia de la cadena de transmisión en función de la detección de vacíos dentro de los límites de protección en la comunidad, así lo exige.

El personal de salud que establece el diagnóstico debe tomar decisiones que van a

repercutir en la salud del individuo, de sus contactos y de la comunidad; así, dentro del Plan de Eliminación del Sarampión, es necesario que nuestro país pueda realizar la confirmación etiológica en los casos probables, teniendo en cuenta el diagnóstico diferencial con rubéola y dengue, para que cada brote epidémico pueda ser confirmado tan pronto se presente.

Con éste propósito el Instituto Nacional de Salud, como órgano normativo referencial

ha diseñado el presente manual de procedimientos para su uso en la Red Nacional de Laboratorios en lo que respecta a colecta, conservación y transporte de muestras y procesamiento por parte de los laboratorios intermedios.

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OBJETIVOS

− Servir como manual de referencia para los procedimientos de confirmación del

diagnóstico etiológico de las EFEs. − Normar la ejecución del diagnóstico diferencial de laboratorio de las EFEs. − Incentivar la participación de los laboratorios regionales en la notificación y

confirmación de brotes epidémicos de EFEs.

ALCANCE

− Destinado a los laboratorios de nivel local en cuanto a la toma de muestras, su

conservación y transporte hacia los laboratorios intermedios.

− Destinado a los laboratorios de nivel intermedio en cuanto al procesamiento para el diagnóstico serológico de tamizaje y remisión de muestras para confirmación hacia el laboratorio central.

− Destinado a todo laboratorio dedicado a tareas de diagnóstico viral en salud pública.

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GENERALIDADES

Creemos necesario puntualizar ciertos aspectos sobre generalidades de los agentes virales involucrados como etiol6gicos, a fin de fundamentar el carácter y naturaleza de los procedimientos a realizar y la importancia de efectuarlos en las condiciones indicadas.

El virus del Sarampión presenta un genoma RNA y pertenece a la familia Paramyxoviridae, género Morbillivirus. Estos virus son de forma esférica, grandes, de 120 a 150 nm de diámetro; poseen una cubierta glicoprotéica y lipídica, con proyecciones de superficie. La cubierta encierra una nucleocápside helicoidal alargada en la cual se disponen de forma espiral las unidades de proteína alrededor del ácido ribonucleico.

Es relativamente termolábil y su infectividad decae cuando permanece a 37°C por dos horas. Se mantiene por varios meses a 4°C, en un medio con proteína o en presencia de estabilizadores. De ésta forma también puede ser preservado indefinidamente a-70° C. Se inactiva completamente a 56° e en 30 minutos y; también por exposición a la luz visible y ultravioleta. Es estable a pH entre 5 y 10.5, siendo óptimo a pH 7.27.

Posee antígenos de envoltura con propiedades hemaglutinantes (hemaglutinina) y hemolíticas (proteína de fusión), que sirven para su identificación específica.

El único hospedero natural del virus es el hombre. La transmisión es en forma directa o por aerosoles. El virus se replica en las células epiteliales de las membranas mucosas y la piel, produciendo inclusiones intranucleares y células gigantes sinciciales multinucleadas que se diseminan al tracto respiratorio.

El virus de la Rubéola, también tiene genoma RNA. Es miembro de la familia Togaviridae, género Rubivirus, son pequeños, con un diámetro promedio de 58 nm, cubierta lipoprotéica con proyecciones en la superficie, pleomórfico. Se inactiva a 37° ó 56°C en 1 hora.

Termoestable a 4°C por 7 días e indefinidamente a -70°C. Estable a pH entre 6.0- 8.1.

Posee antígenos hemaglutinantes, precipitantes y agregadores de plaquetas. También posee una hemolisina.

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La transmisión es por vía respiratoria, siendo las secresiones nasofaríngeas la principal fuente de infección. La replicación primaria ocurre en las células epiteliales de la nasofaringe; la viremia conduce a una amplia diseminación del virus en el organismo, por ello es posible aislar virus de diversos fluidos y localizaciones corporales. El único reservorio natural es el hombre a diferencia de otros miembros de la misma familia. La infección post-natal es benigna en contraste con la infección pre-natal, particularmente durante las primeras 16 semanas de embarazo, siendo el efecto teratogénico grave.

En cuanto al virus del Dengue y sus cuatro serotipos que también pertenecen a la familia Togaviridae, género Flavivirus, son tratados con detenimiento en el manual correspondiente a la vigilancia de los Arbovirus.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. Mantener el laboratorio siempre limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que

no tenga relación con el trabajo que se realiza.

2. En la zona de trabajo del laboratorio no está permitido comer, beber, fumar, guardar alimentos ni cosméticos.

El acceso al laboratorio debe ser restringido solo a personas autorizadas.

3. Es necesario el uso de mandiles y otros protectores (gorras. mascarillas) dentro del laboratorio; no se debe llevar la ropa del laboratorio fuera de éste. Las prendas contaminadas deben desinfectarse por procedimientos apropiados.

4. El personal de laboratorio debe lavarse bien las manos antes y después de manipular

muestras y material infectado, así como antes de abandonar el laboratorio. Es recomendable el empleo de guantes para protección.

5. Las superficies de trabajo se deben desinfectar, al iniciar y al terminar la labor, utilizando

fenol o hipoclorito de sodio al 5 % u otro desinfectante eficaz. Se debe tener cuidado al manipular sustancias tóxicas o corrosivas.

6. Está absolutamente prohibido el pipeteo con la boca; pueden utilizarse aditamentos pro-

pipeta y otros similares. 7. En general todo procedimento debe realizarse usando técnica aséptica. Es preferible el uso

de cubículos y cabinas aislantes con conexión de gas para mecheros Bunsen, al efectuar

procedimientos que pueden ocasionar formación de aerosoles (abrir tubos con muestras

centrifugadas, carga y descarga de jeringas hipodérmicas, pipeteo para resuspensión, etc.)

8. La eliminación de material contaminado debe hacerse previa descontaminación por autoclavado de los deshechos y materiales.

9. Todo accidente u exposición a material infeccioso debe ser inmediatamente notificado al

jefe del laboratorio y deben tomarse oportunamente las medidas preventivas del caso. Se recomienda la inmunización previa del personal contra los agentes con los que se

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mantiene en contacto, evaluando periódicamente su seroconversión.

CRITERIOS PARA LA SELECCION DE CASOS

Las enfermedades febriles eruptivas (EFEs) son el resultado de infecciones sistémicas que han repercutido en la piel.

Antes de emitir un diagnóstico presuntivo, debe considerarse la diversidad de agentes etiológicos virales, bacterianos, micóticos, parasitarios y no microbiológicos involucrados con las EFEs.

Para el diagnóstico clínico de las EFEs es fundamental la descripción de las características de las lesiones, por lo tanto el diagnóstico clínico debe basarse en un interrogatorio cuidadoso del paciente, en el análisis de algunos antecedentes clínico-epidemiológicos y una exploración física bien orientada. El interrogatorio debe incluir preguntas sobre las manifestaciones prodrómicas, la erupción en su Inicio, sus características, distribución y progresión, tipo de fiebre en relación con la erupción, otras manifestaciones respiratorias, neurológicas. etc.

Los antecedentes clínico-epidemiológicos claves son la edad, lugar de procedencia, antecedentes de contacto con un enfermo con erupción, enfermedades eruptivas previas, esquema de vacunación y aplicación reciente de vacunas, ingestión de medicamentos diversos, antecedentes alérgicos, inmunodeficiencias, picaduras de insectos, viajes realizados.

La exploración física identifica diferencialmente las lesiones y califica la necesidad de obtener muestras para diagnóstico etiológico por aislamiento en casos específicos.

Dada su trascendencia como problemas de salud pública, la vigilancia epidemiológica de las EFEs solamente incluye: sarampión, rubéola y dengue, que con algunas diferencias de distribución, son endémicas en el Perú.

En todas éstas infecciones virales se observan los llamados erupciones máculopapulares, que combinan dos tipos morfológicos:

La mácula, una lesión circunscrita con cambio de color en la piel, sin elevación, depresión o cambio en su consistencia, con aspecto diferente al de la piel circundante debido a la diferente cantidad de pigmento de sangre o productos sanguíneos contenidos completa-mente aplanada. La pápula, a diferencia de la anterior, es una pequeña lesión sólida, elevada por encima de la piel circundante, que puede palparse; resulta de la acumulación o proliferación de células, acumulación de líquido o depósitos metabólicos en la dermis o la epidermis. La presentación del sarampión atípico y el dengue hemorrágico, en cambio, están asociados a exantemas petequiales purpúricos, con acumulación de sangre extravascular en la dermis o en tejido subcutáneo, y requieren estudios adicionales a la vigilancia.

CRITERIOS PARA LA SELECCION DE MUESTRAS Muestras para estudio serológico. Según orden de prioridades para casos de EFEs, en primera instancia debe obtenerse muestra para confirmación del sarampión por serología en el laboratorio a todo caso clínico que cumpla estrictamente la definición de: caso probable. A continuación se incluye las definiciones operacionales establecidas por el plan nacional de eliminación del sarampión.

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Lo óptimo es obtener la muestra entre el tercer al quinto día de la aparidón de la erupdón hasta el veintiunavo día de inidada la enfermedad, que es el periodo de prevalencia de anticuerpos drculantes espedficos.

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Las variaciones que se dan para el caso de rubéola deben ser tomadas en cuenta para el diagnóstico diferencial. No tomar la muestra si el paciente recibió vacunación en los 20 días previos al inicio de la erupción. Muestras para estudio virológico

El criterio para seleccionar muestras con proposito de aislamiento viral es detectar el caso en su etapa febril mas aguda que es cuando el número de partículas virales es mayor, si bien desde el inicio de la sintomatología hasta varios días después de la aparición del exantema hay buenas posibilidades en función de la disponibilidad de contar con los instrumentos necesarios del caso.

OBTENCION YPROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO

SEROLOGICO

Equipo y material necesario para la obtención 1. Estufa de 25° C a 37° C

2. Jeringas descartables de 5 mI., con aguja N° 22 (adultos) y N° 23 (niños).

3. Tubos de vidrio borosilicato 13 x 100 mm con tapa de rosca ó tubos de polipropileno x 10

mi, con tapa, para centrífugar.

4. Marcador indeleble. Procedimiento

Se obtienen 5 ml de sangre venosa periférica por venopunción aséptica con jeringa hipodérmica estéril y la aguja respectiva. Las venas del antebrazo a nivel del pliegue del codo o cualquier vena sobresaliente bien afirmada puede servir a éste propósito. Debe limpiarse previamente la zona de punción con algodón embebido en alcohol. Trabajando junto a un mechero, abrir un tubo estéril y deslizar suavemente el émbolo de la jeringa para dejar caer la muestra de sangre por las paredes del tubo, evitando de este modo la hemólisis por golpe que perjudica la calidad del suero. Tapar rápidamente los tubos para no contaminar. Rotular. La sangre total así obtenida debe mantenerse a temperatura ambiente (25°C) en posición

oblicua hasta que se retraiga completamente el coágulo y se desprenda el suero. Nunca congele la sangre total destinada a estudio serológico.

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Equipo y material necesario para el procesamiento 1. Cubículo aislante, con mechero bunsen. 2. Centrífuga (opcional) 3. Pipetas pasteur de transferencia x 2.5 ml, punta fina, estériles. 4. Gradillas para tubos 13 x 100 mm 5. Bandejas con hielo 6. Viales de polipropileno, x 2 mi, con tapa de rosca, estériles, 7. Bandejas autoclavables para descarte de material contaminado. 8. Marcador indeleble.

Procedimiento Para la separación del suero debe emplearse centrífuga (si se dispone de ella),

centrifugar a 2.500 rpm durante 10 minutos, manteniendo el tubo bien tapado. No detener bruscamente el accionar de la centrífuga. Una vez centrifugados manipular

lentamente los tubos para no alterar la separación de las fases. En caso de no contar con centrífuga debe aprovecharse al máximo la acción de separación natural y sin remover extraer el suero.

De manera aséptica destapar cuidadosamente los tubos junto al mechero y empleando pipeta pasteur estéril trasvasar el suero hacia viales estériles de 2 mI. No llenar los viales completamente, si hay cantidad extra de suero utilizar otro vial para una misma muestra.

Utilizar una pipeta por muestra. Tapar herméticamente y sellar los bordes de la tapa con cinta adhesiva. Rotular con el nombre del paciente y la fecha de obtención de la muestra.

Mantener los viales con suero en bandeja con hielo y luego seguir las instrucciones para su conservación.

Nota: Toda muestra inactivada por calor, contaminadas con bacterias u hongos, hemolisada o lipidémica debe ser descartada.

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OBTENCIONY PROCESAMIENTO DEMUESTRAS PARA ESTUDIO VlROLOGICO Equipo y material necesario para la obtención 1. Torundas de algodón poliéster estériles, 16 mm. 2. Catéteres de succión con trampa de mucus, 5 mI. 3. Tubos de 16 x 125 cc con 2 ml de medio de transporte MTV. 4. Tubos 13 x 100 cc con heparina 1:4.000 5. Refrigeradora 6. Bomba de vacío. 7. Jeringas descartables de 5 mL. Procedimiento

Es posible obtener muestras de secresiones nasofaríngeas por gargarismos con 5 mL de solución salina o por hisopado, colectado friccionando cuidadosamente la pared posterior de la nasofaringe con una torunda de algodón poliéster estéril, sin tocar la lengua ni la mucosa bucal, colocándola luego dentro de un tubo con medio de transporte MTV para enviar lo al laboratorio en refrigeración.

Hisopados de mucosa conjuntival son colectados cuidadosamente.

También aspirados nasofaríngeos obtenidos con equipo adecuado (catéter de succión accionado por bomba de vado). Las secresiones son depositadas en la trampa de mucus y mantenidas a 4°C.

Se obtiene sangre total heparinizada durante el estadío prodrómico o máximo 1 a 2 días después que aparece el rash.

Equipo y material necesario para el procesamiento 1. Centrífuga refrigerada. 2. Pipetas Pasteur de Transferencia. 3. Vórtex o mortero pequeño con pilón. 4. Tubos 13 x 100 cc con 1.5 ml de Ficoll-Hypaque. 5. Tubos de centrífuga 13 x 100 cc 6. Solución Hank's con antibióticos. 7. Solución antibiótica-antimicótica. 8. Tubos de 16 x 150 cc, con perlas de vidrio (estériles). 9. Viales 2.5 ml con tapa rosca 10. Bandejas con hielo 11. Bandejas autodavables para descarte. Procedimiento En general los establecimientos de nivel local no llevarán a cabo esta labor, las muestras serán enviadas tal cual fueron obtenidas.

El procesamiento elimina residuos y contaminación que podrían interferir con el aislamiento. Las muestras deben ser procesadas de preferencia de Inmediato en condiciones que permitan conservar la viabilidad del virus, ésto solo es posible en ciertos laboratorios

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intermedios y en el referencial. Las secresiones de garganta o conjuntiva, colectadas con torunda se retiran de su

inmersión en medio de transporte y se someten al machacado de sus algodones mediante un mortero pequeño con pilón. Puede emplearse tambíén un vórtex para desprender, por agita-ción el material adherido a los algodones o simplemente frotar contra las paredes del tubo. El material recuperado se resuspende, se le agrega gotas de solución antibiótlca-antimicótica y se centrifuga a 1 .500 rpm por 30 min. para recuperar el sobrenadante hacia viales de 2.5 mI. Se tapan bien y se almacenan en condiciones óptimas o envian al laboratorio de acuerdo a las instrucciones del caso que se dan más adelante.

Las secresiones nasofaríngeas colectadas con catéter, se retiran de la trampa de mucus mediante pipeta Pasteur hacia tubos 13 x 100 mm, se les agrega gotas de solución antibiótica-antimlcótica. Si son muy mucosas, se someten a la acción de perlas de vidrio en tubos de 16 x 150 mm. Se resuspenden suavemente con solución salina de Hank's para dejar en tratamiento a 4°C durante 18 horas y luego ser centrifugadas en frío a 1 ,500 rpm por 15 minutos. El sobrenadante clarificado se recupera con pipeta Pasteur hacia viales de 2.5 ml y se mantiene a -20°C o se inocula de Inmediato para aislamiento.

El sedimento resultante se destina a preparar improntas sobre láminas portaobjetos, distribuyendo un máximo de 12 gotas por lámina, secando al aire ambiental o con secadora al frío, se fijan con acetona fría a Tº ambiente durante 10 minutos. Se mantienen en cajas portaláminas a -20°C.

La sangre total heparinizada obtenida por venopunción aséptica y depositada en un tubo con heparina 1:4,000, se diluye 1:3 y se procede a colocarla en zona, lentamente sobre un tercio del volumen de Ficoll-Hypaque en un tubo de centrífuga. El tubo es centrifugado a 1,000 rpm por 45 minutos a Tº ambiente. Se retira con cuidado de la centrífuga, manteniendo en posición vertical para poder apreciar una banda central de linfocitos entre las 2 fases de diferente densidad. Con una pipeta pasteur estéril se aspira éste anillo de linfocitos y se coloca en otro tubo de centrífuga para lavar tres veces por centrifugaciones sucesivas con solución salina de Hank's y antibióticos, en las condiciones indicadas: después de lo cual las células lavadas se resuspenden en una pequeña cantidad de solución Hank's o medio de cultivo, para almacenar en condiciones óptimas (-20°C) o enviarlos al laboratorio central de referencia.

Nota: Toda muestra que haya estado expuesta a inactivación por calor o contaminación debe ser evaluada para su descarte. CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS Equipo y material necesario 1. Refrigeradora 2. Congeladora de -20°C 3. Cajas contenedoras insufladas con hielo seco. 4. Cojines conservantes refrigerados. 5. Material absovente y amortiguante (algodón, espuma plástica, dunlopillo, papel, etc.) 6. Cinta adhesiva masking tape. 7. Marcador indeleble.

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Procedimiento En general es preferible el transporte de toda muestra dentro de las 24 horas de obtenida.

En lugares en donde no se separe el suero, la sangre total, aún después de coagulada no debe ser congelada, solo guardar a 4°C y enviarla al laboratorio con la mayor prontitud posible.

Los sueros pueden permanecer a 4°C por periodos cortos de tiempo (no más de 5 días). Se almacenan a -20° e por tiempo indefinido. En caso de no contar con refrigerador o congelador, los termos con bloques refrigerantes o cajas con hielo seco pueden ser una altemativa de conservación por cortos periodos, excepto con la sangre total para serología.

Las muestras para aislamiento también deben enviarse al laboratorio referencial central lo más rápidamente posible, conservándolas a temperatura de refrigeración por cortos periodos o en congelación durante largo tiempo (-20°C).

Todas las muestras deben transportarse en condiciones óptimas que aseguren el buen estado de las muestras al llegar a su destino y proporcionen seguridad al personal que las manipula. Para evitar roturas y derramamientos se emplean recipientes secundarios (de cartón. plástico. etc.) donde se colocan los tubos o viales.

Durante el transporte debe mantenerse la misma temperatura que en el almacenamiento. No congelar y descongelar repetidamente. Utilizar termos-hieleras o cajas conservantes con hielo seco o paquetes frfos (bolsas con hielo, cojines refrigerados) y material absorvente y amortiguante (algodón, papel corrugado), disponiendo de tal manera que las muestras queden bien acondicionadas al frío y protegidas. Sellar con cinta masking tape. Acompañar con la ficha de identificación en cada caso.

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IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS

Cada muestra enviada debe adjuntar la respectiva ficha clínicoepidemiológica de identificación (ver anexo) con los datos: nombre del paciente, edad, sexo, dirección domiciliaria, nombre del establecimiento de salud, signos y síntomas principales, fecha de inicio de la EFE, estado vacunal, fecha de toma de muestra y alguna otra observación adicional de interés para la interpretación de los resultados de laboratorio (p. ej.: Tipo de muestra. etc.).

Los viales con muestra deben rotularse con marcador indeleble o lápiz grafito sobre esparadrapo, con el nombre del paciente y la fecha de obtención de la muestra.

Los contenedores más externos como termos y cajas conservantes deben llevar etiqueta con los datos de procedencia de las muestras, naturaleza del envío y dirección del destinatario, indicando a su vez la importancia de un cuidadoso manipuleo y la urgencia del transporte inmediato.

TECNICAS DE DIAGNOSTICO

Los procedimientos de laboratorio para diagnóstico de las EFEs implican el demostrar la intervención del virus en el desarrollo de la enfermedad ya sea por aislamiento, detección de antígenos, y/o la presencia de anticuerpos específicos a éste. Todo resultado de laboratorio deber ser interpretado en base a la historia del paciente, la presentación clínica y otras pruebas diagnósticas similares. l. PRUEBAS SEROLOGICAS

El presente manual incluye pruebas clásicas para detección de anticuerpos específicos (modalidades ELISA indirecta y de captura IgM, inmunofluorescencia indirecta para IgM) y pruebas funcionales de anticuerpos: inhibición de la hemaglutinación y neutralización en cultivos celulares.

PRUEBA INMUNORUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECCION DE ANTIGENO EN MUESTRAS CLINICAS O ANTICUERPOS EN SUERO

La técnica de anticuerpos fIuorescentes se basa en la unión inmunológicade un anticuerpo, marcado con el fluorocromo isotiocianato de fluorescefna (FITC), a su antígeno homólogo.

Las moléculas proteicas de los anticuerpos se unen al marcador fluorescente mediante firmes enlaces químicos que no alteran esencialmente la actividad inmunológica de tales anticuerpos manteniendo intacta su capacidad de unirse a los antígenos homólogos. Esta prueba es aplicable tanto a la detección de antígeno como de anticuerpo, según el reactivo de referencia utilizado.

Su aplicación implica además del empleo de equipo adicional, un entrenamiento especializado en lecturas de fluorescencia específica para evitar errores de interpretación.

a. Material biológico y reactivos 1. Suero humano anti-antígeno específico (referencial y problema). 2. Conjugado FITC anti-humano IgM o IgG.

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3. Láminas portaobjetos x 12 agujeros, impregnadas con antígeno referencial cultivado en células de Iíneas contínuas. 4. Láminas portaobjetos x 12 agujeros, impregnados con muestras de secresión nasofaríngea, conjuntival o exudados. 5. Acetona qq pura 6. PBS pH 7.2 7. Glicerina buferada. 8. Azul de Evans b. Equipo y materiales 1. Microscopio de fluorescencia 2. Potenciómetro 3. Estufa de 37°C 4. Congeladora de -20°C 5. Balanza analítica 6. Agitador magnético 7. Cámara húmeda 8. Pipetas pasteur 9. Probetas 10. Jarras coplin con barra magnética 11. Tubos de 13 x 100 mm y 16 x 150 mm 12. Laminillas cubreobjetos 13. Gradillas para tubos 14. Lapicero con punta de diamante o tinta indeleble c. Procedimiento Prueba IFI 1. Se retira de la congeladora los portaobjetos con las improntas ya previamente fijadas y se

dejan secar. Se puede acelerar éste paso mediante refijación por 10 minutos sumergiendo en acetona fría y luego ventilar al ambiente.

2. Se remarca la identificación de las láminas con lápiz de diamante o tinta indeleble en base a codificación establecida según protocolo.

3. Una vez que esté bien seca la lamina, se agrega a cada agujero, suero humano anti-sarampión en dilución apropiada previamente determinada portitulación y en cantidad suficiente para cubrirla por completo, a manera de burbuja (aprox. 20 ul). Mantener en cámara húmeda a 37°C por 1 hora.

4. Escurriendo las láminas se colocan en jarra coplin y se añade PBS pH 7.2 para eliminar al instante, agregar mas PBS y realizar tres lavados, agitando suavemente por 10 minutos cada vez.

5. Se extraen las láminas de las jarras coplin y se secan cuidadosamente por la cara opuesta a las muestras. Se añade el conjugado FITC anti-humano IgM o IgG previamente titulado. Se Incuba en cámara húmeda por 1 hora a 37°C.

6. Se efectúan tres lavados en las mismas condiciones anteriores. 7. Escurriendo las láminas agregar sobre las improntas solución Azul de Evans diluído

1:20.000 durante 1 segundo y nuevamente escurrir para colocar en la jarra coplin donde se realizarán 3 lavadas más según la descripción anterior.

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8. Secando por el lado contrario a las muestras y sobre los bordes, con papel tisú, se añade una gota de glicerina buferada colocando a continuación sobre ella cuidadosamente una laminilla cubreobjeto en ángulo de 45 grados con relación a la superficie, de manera tal que no forme burbujas. Leer con objetivo 100X.

9. Lectura: Positivo: Color verde brillante en inclusiones intranucleares y citoplasma de células gigantes sinciciales multinucleadas. Negativo: Color rojo opaco.

10. Interpretación: El antígeno viral en muestras se localiza en sus sitios de replicación que vienen a ser las células epiteliales de las membranas mucosas y piel, donde produce inclusiones y sincicios. Las láminas patrón aparecen con fluorescencia en la membrana celular de las células de línea continua.

11. Observaciones Ocasionalmente las muestras pueden contener complejos inmunes pre-formados de inmunoglobulina, los cuales deben ser eluidos de las muestras antes de la prueba. Se logra incubando con buffer de Sorensen con glicina y ácido hidroclórico con cloruro de sodio 0.1 M pH 2.2 por 2 horas a 37°C lavando luego en PBS pH 7.2 por 30 minutos, antes de la incubación con el suero inmune.

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTlNACION (IHA):

Está basada en el hecho de que la capacidad biológica de virus como el sarampión, rubéola entre otros, de poderse unir a los receptores de los hematíes de ciertas especies y aglutinarlos, puede ser evitada o inhibida si el virus previamente forma complejos con anticuerpos específicos circulantes en aquellas personas expuestas a infección o en vacunados.

Ciertos componentes séricos que no son anticuerpos también pueden inhibir hemaglutinación y por ello es necesario un previo tratamiento del suero para remover los o inactivarlos.

La especificidad y sensibilidad de ésta prueba es alta pero su limitación principal para el caso específico del sarampión es que requiere hematíes de monos de determinadas especies no siempre disponibles.

a. Material biológico y reactlvos 1. Antígeno referencial hemaglutinante. 2. Kaolín al 25 % 3. Solución anticoagulante Alsever (colecta y conservación de hematíes). 4. Hematíes de pollito (rubéola) o de mono Rhesus o Verde Africano (sarampión), se retiran

con pipeta pasteur del Alsever en la cantidad necesaria para preparar las soluciones al 50% y 0.5% en PBS-SAB. Se lavan con PBS durante 10 minutos por centrifugación a 1,500 rpm, descartando el sobrenadante y recuperando el paquete de hematíes para resuspender y repetir la operación 3 veces.

5. Buffer fosfato salina (PBS) M/1 5. pH 7.2 6. Muestra de suero problema

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7. Antisuero referencial para IHA 8. Seroalbúmina bovina (SAB). b. Equipo y material de laboratorio 1. Refrigeradora 2. Estufa de 37°C 3. Baño maría de 56°C 4. Centrífuga refrigerada 5. Agitador de tubos (opcional) 6. Tubos de vidrio 13 x 100 mm 7. Gradilla para tubos 13 x 100 mm 8. Pipetas volumétricas de 1 ml y 10 ml 9. Matraces Erlenmeyer de 125 ml 10. Bandejas con hielo 11. Reloj de intervalos. Material opcional extra para microtitulación : 12. Placas microtituladoras de 96 agujeros, fondo en U 13. Micropipeta automática de 20 a 200 ul, multicanal 14. Puntas (tips) de 25 ul 15. Pipetas gotero de 50 y 25 ul 16. Espejo bicóncavo 17. Agitador de placas c. Procedimiento

Puede emplearse macrotécnica si se cuenta con sufidente provisión de reactivo biológicos o en su defecto utilizar el micrométodo con volúmenes a la décima. Consta de tres pasos: 1. Titulación del antígeno hemagIutinante referencial 1.1 Se distribuye 0.4 ml (ó 0.04 ml = 40ul) de PBSM/15 hada cada uno de 12 tubos 13 x 100

mm ó agujeros de una placa microtituladora, según el método usado. 1.2 Una vez reconstituído el antígeno hemaglutinante referencial debe mantenerse en hielo, se

adidona 0.4 mi (ó 40 ul) de éste hacia el primer tubo o agujero, se mezcla bien y se traslada el mismo volumen hada el segundo y así sucesivamente hasta el último, descartando al final el mismo volumen.

1.3 Agregar a todos los tubos o agujeros utilizados un volumen de 0.2 ml (ó 20 ul) de una suspensión de hematíes de especie afín al 0.5 % en PBS M/15 con SAB al 0.1 %. Agitar bien y uniformemente. Se prepara un control de hematfes al combinar 0.4 mi (ó 40 ul) de PBS con 0.2 mi (ó 20

ul) de suspensión de hematíes, para comprobar si están funcionando. 1.4 Se deja incubando 2 horas en estufa de 37°C o al ambiente (25°C). 1.5 Lectura

Positivo: Formación de malla de hemaglutinación total en el fondo del tubo ó agujero. Negativo: Formación de botón de hematíes en el fondo del tubo ó agujero.

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1.6 Interpretación La mayor dilución de antígeno en la que se presenta hemaglutinación completa viene a ser la unidad hemaglutinante, a partir de la cual se toma en cuenta las diluciones hacia adelante para obtener las 4 unidades (4 UHA) que necesitamos para la prueba IHA.

2. Tratamiento de sueros 2.1 Distribuir los sueros en tubos 13 x 100 mm 2.2 Inactivar los sueros problema y los referenciales en baño maría de 56°C por 30 minutos. 2.3 Diluir 0.2 ml de suero inactivado en 0.8 ml de PBS 2.4 Agregar 0.8 ml de Kaolín al 25 % 2.5 Agitar y dejar 20 minutos a temperatura ambiente. 2.6 Centrifugar a 2,000 rpm por 10 minutos. 2.7 Colectar el sobrenadante en un tubo limpio. 2.8 Adicionar 0.2 ml de hematíes al 50 %. 2.9 Agitar y dejar 1 hora a temperatura ambiente, volviendo a agitar ocasionalmente, 2.10 Centrifugar a 2.000 rpm por 10 minutos. 2.11 Colectar el sobrenadante en un tubo limpio, éste constituye el suero diluído 1: 10 listo

para la prueba. 3. Técnica IHA 3.1 Distribuir 0.2 mi (ó 20 ul) de PBS M/15 hacia cada uno de 12 tubos 13 x 100 o agujeros de

microplaca. 3.2 Disponer 0.2 ml (ó 20 ul) de cada suero problema hacia los primeros tubos o agujeros de la

serie, agitar y pasar el mismo volumen hacia los segundos tubos o agujeros y así sucesivamente hasta completar con los últimos, descartando al final el mismo volumen. Ejecutar el mismo procedimiento con un suero patrón referencial como control positivo.

3.3 Agregar 0.2 ml (6 20 ul) de antígeno hemaglutinante con 4 UHA a cada tubo o agujero con diluciones de sueros. Agitar bien y dejar 1 hora al ambiente.

3.4 Añadir 0.2ml (620ul) de la suspensión de hematíes al 0.5% a cada uno de los tubos o agujeros. Agitar bien e incubar en estufa de 37°C por 1 hora ó un máximo de dos horas.

3.5 Preparar controles de hematíes colocando 0.4 ml (ó 40 ul) de PBS mas 0.2 ml (ó 20 ul) de la suspensión de hematíes al 0.5% hacia cada uno de dos tubos o agujeros.

3.6 Efectuar una titulación simultánea del antígeno empleado para comprobar que se ha trabajado con 4 UHA para ello se emplean ó tubos o agujeros de microplaca procediendo en idéntica forma que en la pre-titulación.

3.7 Lectura Positivo: Formación de botón de hematíes en el fondo del tubo o agujero.

Negativo: Formación de malla de hemaglutinación completa en el fondo del tubo o agujero.

3.8 Interpretación La presencia de anticuerpos específicos en el suero se verifica por la ausencia de hemaglutinación al haber sido inhibida la unión del virus con los receptores celulares de los hematíes. El título de anticuerpos del suero corresponde a la mayor dilución capaz de inhibir totalmente la hemaglutinación. Para que la prueba sea válida los controles de hematíes y de suero control positivo deben presentar botón en tanto la titulación del antígeno debe presentar malla hasta un título

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exacto de 4 UHA

PRUEBA INMUNOENZIMATICA (ELISA)

Para simplificar la intervención de los laboratorios regionales de nivel intermedio, el método de elección es la prueba serológica inmunoenzimática (ELlSA), una es técnica altamente sensible y específica de fácil realización y adaptable a diversas condiciones de trabajo. Se fundamenta en el hecho de que los sustratos químicos están sujetos a cambios de color cuando se encuentran en presencia de una enzima apropiada y la factibilidad de unión estable entre un determinado anticuerpo y tal enzima.

Aquí el inmunoensayo enzimático se emplea sólo para detección de anticuerpos en muestras de suero, en dos de sus modalidades: PRUEBA ELISA INDIRECTA: a. Material biológico y reactivos 1. Antígeno soluble, titulado a 16 UHA. 2. Sueros problema 3. Sueros humanos control positivos y negativos. 4. Conjugado Inmunoglobulina anti-humana-peroxidasa ó conjugado Inmunoglobulina anti-

humana-fosfatasa alcalina. 5. Buffer Carbonato-bicarbonato 0.05M, pH 9.5 6. Buffer fosfato salina (PBS) pH 7.4 7. Seroalbúmina bovina 8. Tween 20 9. Sustrato OPD + peróxido de úrea (a peroxidasa) ó sustrato para-nitrofenilfosfato (a fosfatasa

alcalina). 10. Solución de parar reacción: ácido sulfúrico al 12.5 % ó Hidróxido de sodio 3M.

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NOTA:

Para efecto de la participación de los laboratorios regionales piloto de la red de Laboratorios a nivel nacional, se utilizará KITS comerciales ELlSA para detección de IgM, cuyos manuales de instrucción detallan los reactivos utilizados en la mayoría se considera procedimientos de pre-tratamiento para in activar tanto anticuerpos IgG como factores reumatoides presentes en las muestras, lo cual incrementa la especificidad de la prueba en cuanto a detección de IgM específicas.

La presencia de soluciones concentradas de lavado ya preparadas y juegos de calibradores además de controles positivos y negativos para la interpretación de las lecturas, también resulta conveniente.

Se detallan asimismo los procedimientos específicos a seguir que deben ser cumplidos fielmente a las instrucciones dadas y que básicamente son los mismos descritos a continuación, obviando el paso de preparación y sensibilización de la placa, ya que las tiras de polivinilo vienen ya impregnadas con antígeno viral.

b. Equipo y material de laboratorio 1. Placas de poliestireno o polivinilo, fondo plano, con 96 agujeros ó tiras de poliestireno con

soporte. 2. Micropipeta multicanal, de 20 a 200 ul 3. Micropipetas graduadas de 2 a 20 ul y de 20 a 200 ul 4. Puntas tips para micropipetas. 5. Probetas de 1 Lt. 6. Frascos de vidrio unos transparentes y otros color ámbar, con tapa hermética, 125 mi, 250

mi y 500 mI. 7. Lector espectrofotómetro EIA para placas o tiras, con filtros de 405 492 nm y 600 nm. 8. Potenciómetro o cinta de medir pH. 9. Estufa de 37°C 10. Congeladora de -20ºC 11. Lavador de placas o kitasato de 10 Lt. con aditamentos para bomba de vacío. 12. Cámaras húmedas (cajas plásticas con papel filtro húmedo) 13. Bolsas plásticas autoadhesivas para placas. 14. Pisetas 15. Reservorios de re activos para pipetas multicanal. 16. Papel absorvente. 17. Bandejas para descarte. 18. Reloj de intervalos. 19. Parafilm o cinta adhesiva transparente. 20. Cámara oscura, franela negra.

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c. Procedimiento 1. Preparación de la placa:

Diferentes plásticos tienen diferentes características de absorción para las proteínas. Las más empleadas son las de PVC (cloruro de polivinilo) y poliestireno.

1.1 Se lava las placas o tiras tres veces con PBS o agua. 1.2 Secar golpeando la placa en posición invertida sobre papel absorvente. 2. Sensibilización:

Viene a ser el recubrimiento de la fase sólida con antígeno soluble previamente preparado en cultivo celular.

2.1 Diluir el antígeno en Buffer Carbonato-bicarbonato pH 9.5, según su titulo hemaglutinante, a 16 UHA.

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2.2 Impregnar las placas o tiras distribuyendo con micropipeta multicanal 100 ul del antígeno hacia cada pocillo.

2.3 Incubar toda la noche a 4°C o hasta el momento de su uso. Mantener cubierta la tira con parafilm o cinta adhesiva. Pueden almacenarse 2 a 3 semanas en cajas con ambiente húmedo a 4°C o por mayor tiempo a 20°C.

3. Lavado: Lavar 3 veces cada pocillo con solución de lavado PBS con Tween 20 al 0.5 %, utilizando el lavador de placas o sistema de bomba de vado con kitasato. Después de cada lavado se golpea sobre papel absorvente para secar.

4. Bloqueo: para reducir la unión no específica de las proteínas al antígeno impregnado. 4.1 Llenar hasta el borde los agujeros con 150 ul de seroalbúmina bovina al 4 % en PBS pH

7.2. 4.2 Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 5. Lavar 3 veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %.

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6. Muestra de suero Se incluyen controles positivos y negativos además de las muestras problema. 6.1 Diluir los sueros a 1:40 en PBS con seroalbúmina bovina al 0.5 %. 6.2 Distribuir 100 ul de cada suero a los respectivos agujeros previamente identificados según

protocolo. 6.3 Incubar en cámara húmeda a 37°C por 90 minutos. 7. Lavar 3 veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. 8. Conjugado: Se trata de una inmunoglobulina anti-humana preparada en conejo o cabra y conjugada

con peroxidasa o fosfatasa alcalina. Se titula previamente junto con controles positivos y negativos a varias diluciones.

8.1 Diluir el conjugado reconstituido con PBS-SAB al 0.5%, de acuerdo al titulo obtenido. 8.2 Distribuir en no mas de 5 minutos. 100 ul del conjugado diluido a cada uno de los agujeros

en prueba. 8.3 Incubar a 37°C por 1 hora en cámara húmeda. 9. lavar 3 veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. 10. Sustrato: El sistema sustrato debe ser preparado al momento de su uso. Según la enzima presente

en el conjugado los más empleados son el OPD (ortofenilendiamina) en solución buffer fosfato-dtrato con peróxido de Urea o Hidrógeno cuando se trata de peroxidasa y paranitrofenilfosfato para el caso de la fosfatasa alcalina.

10.1 Preparar el sistema sustrato y mantenerlo en la oscuridad. Frasco color ámbar y cubierto con franela negra.

10.2 Distribuir 100 ul del sustrato a cada uno de los agujeros de la prueba. 10.3 Incubar a 37°C por 30 minutos en oscuridad, cubrir la placa con la franela negra. También

se puede incubar a temperatura ambiente. 11. Parar la reacción: Concluídos los 30 minutos de incubación con el sustrato es necesario detener la reacción

para mantener los valores de absorvancia y poder detectarlos, por ello se inactiva la

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actividad enzimática modificando el pH. 11.1 Distribuir 100 ul de solución de ácido sulfúrico al 12.5% ó hidróxido de sodio 3M a cada

uno de los agujeros de la prueba, procediendo en la misma secuencia como se añadió el sustrato.

12. Continuar con el desarrollo de color a temperatura ambiente hasta que el control positivo tenga una densidad óptica de al menos 1.0 que es en aproximadamente 1 hora.

13. Lectura

Puede ser visual (cualitativa) o con lector a 405 (cuantitativa). Para optimizar la precisión se recomienda una lectura diferencial a 492 nm y 600 nm.

14. Cálculo Cada KIT induye los cálculos recomendados para la lectura cuantitativa de absorvenda. En caso de no ser lector programable, se puede aplicar: - Calcular la media de la D.0, de los controles negativos Xn. - Calcular la media de la D.0, de los controles positivos Xp. - Para verificar la validez de los resultados obtenidos debe cumplirse que: Xp > 5Xn siendo el Valor Límite = 2Xn En otros casos se emplea valor de corte y curva de calibración.

15. Interpretación Se considera positivos los valores de absorvancia superiores o iguales al valor límite. Se considera negativos los valores de absorvancia inferiores al valor límite. Las muestras que resulten no reactivas en un primer ensayo pueden considerarse como negativas a la presencia de anticuerpos contra el virus. Toda muestra que resulte positiva en un primer ensayo debe ser nuevamente probada en duplicado. Si resulta repetidamente reactiva debe ser considerada positiva para presencia de anticuerpos específicos.

PRUEBA ELlSA DE CAPTURA PARA IgM

Se empleará la modalidad ELlSA de captura IgM para detectar infección reciente. El principio de la prueba es capturar los anticuerpos IgM del suero problema. Inmovilizándolos en

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el fondo de los pozos de una microplaca al absorverlos con anticuerpos anti-lgM humana previamente fijados. Entonces, para efectuar la prueba primero se absorben anticuerpos anti-IgM humana preparados en cabra, se bloquean los pocillos y se agrega el suero del paciente y cualquier IgM presente se unirá a la anti-lgM. Todas las otras inmunoglobulinas se eliminan en el lavado siguiente. A continuación se añade el antígeno específico a las IgM <<capturadas>>. Si existe IgM capturada específica contra el virus, se forman complejos antígeno-anticuerpo que se revelan al agregar anticuerpos anti-sarampión marcados con peroxidasa (conjugado). La adición del sustrato adecuado a la enzima determinará el desarrollo de una reacción coloreada, cuya Intensidad puede ser cuantificada mejor con la ayuda de un lector fotocolorimétrico. Reactivos biológicos necesarios 1. Inmunoglobulinas anti-lgM purificadas. 2. Sueros humanos control positivo de alto título. 3. Suero humano normal (SHN). 4. Antígenos referenciales 5. Sueros problema. 6. Conjugados anti-antígeno marcados con peroxidasa. 7. Buffer carbonato-bicarbonato 0.05 M, pH 9.5 8. Buffer fosfato salina (PBS) pH 7.4 9. Buffer fosfato-citrato 0.05 M con peróxldo de úrea. 10. Seroalbúmina bovina (SAB) fracción V. 11. Tween 20. 12. Sustrato OPD (O-fenilendiamina) ó 5AS (ácido 5aminosalicílico) 13. Solución hidróxido de sodio 3M ó ácido sulfúrico 3M. Equipo y material necesario 1. Lector espectrofotómetro de tiras, filtros 450 y 492 nm. 2. Potenciómetro o cinta de medir pH. 3. Estufa de 370 C. 4. Lavador de tiras o kitasato con bomba de vacío. 5. Tiras de poliestireno o polivinilo, fondo plano, con soporte. 6. Micropipeta multicanal de 20 a 200 ul 7. Micropipeta unicanal de 2 a 20 ul 8. Puntas estériles para micropipetas. 9. Probeta de 1 Lt. 10. Frascos de vidrio con tapa de rosca, 125 ml, 250 ml, 500 ml: ámbar y transparentes. 11. Cámaras húmedas (cajas plásticas con papel filtro húmedo). 12. Reservorios de reactivos para pipetas multicanal. 13. Papel filtro secante u otro papel absorvente. 14. Bandejas para descarte. 15. Reloj de intervalos. 16. Cámara oscura o franela negra.

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Procedimiento Preparación de la placas 1. Lavar los pocillos de la tira tres veces con PBS pH 7.4.

Sacudir las tiras en posición invertida sobre papel absorvente para escurrir. Sensibilización 2. Distribuir con pipeta multicanal, a cada uno de los pocillos de la tira que se empleará en la prueba, 100 ul de Ig anti-IgM diluída a su Concentración óptima obtenida en titulación previa. 3. Incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda.

Las tiras así impregnadas pueden ser almacenadas por 2 a 3 semanas a 4°C en humedad, por mayor tiempo a -20°C.

Lavado 4. Lavar cinco veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %, utilizando lavador automático o

sistema de bomba de vado con kitasato. Secar sobre papel absorvente. Bloqueo S. Agregar a cada pocillo 150 ul de seroalbúmina bovina al 4 % en buffer carbonato-bicarbonato. 6. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Lavado 7. Lavar cinco veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. Muestra de suero 8. Distribuir 50 ul de cada suero (sueros problema y control),diluídos en PBS-SAB al 0.5 %,

según el titulo del conjugado, a cada agujero identificado en un esquema de protocolo diseñado para tal efecto.

9. Incubar en cámara húmeda a 37°C por hora y media. Lavado 10. Lavar cinco veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. Captura 11. Agregar 50 ul del antígeno correspondiente titulado a 16 UHA y diluído en PBS-SHN al 20

% a cada uno de los pocillos. 12. Incubar a 4°C por toda la noche. Lavado 13. Lavar cinco veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. Conjugado 14. Agregar 50 ul de conjugado peroxidasa anti-antígeno diluído en PBS-SHN AL 20 % según

el título obtenido en una titulación previa, a cada pozo en no más de 5 minutos por placa.

15. Incubar 1 hora a 37°C. Lavado 16. Lavar siete veces cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0.5 %. Sustrato 17. Agregar 100 ul de sustrato OPD ó 5AS a cada pocillo de la prueba menos al blanco.

Mantener cubierto con franela negra durante 30 minutos. Parar la reacción 18. Detener la reacción con 100 ul de NaOH 3M ó HCI 3M para cada pocillo. En reactividad se

observa coloración marrón.

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Continuar con el desarrollo de color a temperatura ambiente hasta que el control positivo tenga una densidad óptica de al menos 1.0.

Lectura 19. La lectura puede ser visual ó con lector con filtros de 450 y 492 nm. 20. Cálculos:

Seguir las instrucciones del KIT. También es aplicable lo siguiente: - Calcular la media de la densidad óptica de los controles negativos Xn. - Calcular la media de la densidad óptica de los controles positivos Xp. - Para la validez de los resultados obtenidos debe cumplirse que: Xp > 5Xn. siendo el valor limite = 2Xn. Esto en el caso de no contar con lector programable.

21. Interpretación: Se considera positivos los valores de absorvacia superiores o iguales al valor límite. Se considera negativos los valores de absorvancia inferiores al valor límite. Las muestras que resulten no reactivas en un primer ensayo pueden ser consideradas como negativas a la presencia de anticuerpos contra el virus. Toda muestra que resulte positiva en un primer ensayo debe ser nuevamente probada en duplicado. Si resulta repetidamente reactiva debe ser considerada positiva para presencia de anticuerpos específicos lo cual indica infección reciente. Los resultados obtenidos deben ser evaluados con el informe clínico para su mejor interpretación y significado diagnóstico.

Recomendaciones adicionales a los procedimientos ELlSA • Todos los reactivos deben conservarse a temperatura ambiente (25°C) antes de iniciar

el ensayo. • Conserve las tiras impregnadas no usadas en la bolsa con el indicador de humedad y

el desecador todo el tiempo. • Saque del refrigerador únicamente el volumen de reactivos a utilizar en su prueba. • Nunca pipetee directamente de los viales si no es con material estéril y bulbos pro-

pipeta para no contaminar. • No devuelva reactivos sobrantes hacia los viales originales. • Use agua destilada o deionizada de buena calidad. • Su material de vidrio a utilizar debe estar completamente limpio y estéril. • No permita que sus pocillos de reacción se sequen. Agregue los reactivos

correspondientes inmediatamente despues de cada lavado o despues de descartar los reactivos del paso anterior.

• Evite la contaminación entre reactivos. Lave bien sus manos antes de manipular cada reactivo.

• Asegure un buen lavado de las tiras durante los respectivos tiempos de lavado. • Manipule cuidadosamente todos los re activos del equipo como potencialmente

infecciosos. • Usar siempre reactivos de un mismo lote. No mezclarlos.

Causas posibles de variaciones Importantes entre ensayos • Contaminación de los reactivos. • Pipeteo Impreciso. • Empleo de material de vidrio sucio. • Lavado insuficiente o excesivo de las tiras. • Temperaturas de incubación por encima o por debajo de lo recomendado. • Confusión entre tapas o identificación de reactivos. • Manipulación errónea de la tableta de OPD. • Almacenamiento inadecuado de la tira.

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ALGORITMO PARA OBTENCION y PROCESAMIENTO SEROLOGICO DE MUESTRAS

De acuerdo a lo establecido en el diagrama de flujo para definiciones operacionales establecido en coordinación con el Programa Ampliado de Inmunizadones dentro del Plan de Eliminación del Sarampión, las muestras serán procesadas en primer lugar para detección de IgM anti-sarampión por ELlSA indirecta en el laboratorio central de referencia o laboratorios piloto regionales. Si la prueba resulta positiva, se confirma el diagnóstico de sarampión; si el resultado es negativo, se procesará la muestra subsiguientemente para detección de anticuerpos a rubéola y en áreas endémicas específicas para dengue.

En el laboratorio central además se aplicará las pruebas IFI o lHA o una ELISA de captura para confirmación, en caso de resultados inconcluyentes.

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II. AISLAMIENTO VlRAL No obstante que los intentos de aislamiento viral deben hacerse únicamente en

situaciones especiales, debido al alto costo, a que requieren de mucho tiempo y que generalmente las muestras clínicas casi siempre contienen bajas concentraciones de partículas viables, siempre es posible efectuarlo si las condiciones del caso se presentan favorables. Debe determinarse la Iínea celular mas apropiada para el aislamiento según el grupo viral que se desea aislar. Es útil entre otras, el empleo de Iíneas estables de origen renal como la VERO de mono para serampión y la RK-13 de conejo para rubéola, las cuales son propagadas en forma de monocapas.

Equipo y material necesario 1. Cabina de flujo laminar. 2. Pipeteador automático o pro-pipetas. 3. Microscopio invertido. 4. Estufa de 37°C. 5. Frascos descartables de 75 cc, para cultivo celular. 6. Pipetas volumétricas de 10 ml, 5 ml, 1 ml estériles, descartables, 7. Frascos de 75 cc con línea celular confluente. 8. Frascos de 500 ml o 250 ml con medio esencial mínimo MEM Eagle con 5 a 10 % de suero

bovino fetal (SBF) y antibióticos. 9. Solución de tripsina-versene 1X. 10. Solución antibiótica-antimicótica. 11. Frascos bocales. 12. Toallas o gasas estériles embebidas en alcohol. 13. Tubos de 16 x 125 ce estériles. 14. Tapones de silicona para tubos 16 x 125 cc. 15. Gradillas para cultivos celulares (tubos 16 x 125 cc). 16. Cámara de NeuBauer

Procedimiento

Trabajando en cabina de flujo laminar y junto a un mechero, en primer lugar se decanta el medio del cultivo de los frascos con monocapas confluentes y se les agrega 5 ml de tripsina-versene 1x, descartando inmediatamente para añadir 3 ml mas de tripsina, dejando que actúe su efecto proteolítico sobre los enlaces intercelulares. Se resuspende las células desprendidas en medio esencial mínimo suplementado con 10% de SBF, homogenizando bien. Disponiendo los tubos 16 x 125 cc en gradilla para cultivos, se reparte a cada tubo 2 mL de la suspensión celular ajustada a una concentración de 3 x 105, (determinada por contaje en cámara de NeuBauer). Se incuban en posición semihorizontal a 34°C durante 48 horas. Cuando las células de los tubos formen una monocapa confluente, se cambia a medio de mantenimiento con 5% de SBF para ser inoculadas con 0.2 mL de muestra procesada usando pipeta de 1 mL; volviendo a incubar en las mismas condiciones anteriores durante siete a quince días (dependiendo de la buena conservación de las células en monocapa), controlando diariamente para evidenciar la presencia del virus.

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Evidencia de la presencia viral a) Por efecto citopático viral: Al observar al microscopio compuesto invertido la aparición de

cambios morfológicos en la células, que pueden ser mínimos o severos; en el caso del virus sarampión las formaciones sinciciales por fusión celular son típicas, células gigantes multinucleadas que desorganizan la monocapa y terminan desprendiéndola del frasco.

b) Por la aparición de una hemaglutinina: Se busca determinar presencia cualitativa o

cuantitativa de un virus con capacidad hemaglutinante, empleando el mismo método de

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hemaglutinación que se utilizó para titular virus durante la prueba IHA. c) Prueba de hemadsorción: efecto observado al cubrir la monocapa con una suspensión

de hematíes al 0.5 % en PBS pH 7.2, incubar a 34°C por 30 minutos, decantar la suspensión, lavar ligeramente con PBS y observar al microscopio invertido la adhesión de grupos de hematíes a las membranas celulares producto de la actividad de los receptores de superficie viral.

d) Interferencia: prueba poco utilizada dada su complejidad, se detecta la actividad viral indirectamente, al co-cultivar dos virus diferentes en un mismo cultivo de Iínea celular. Ha sido ensayada con Rubéola, pero contando con una Iínea susceptible para este virus no es necesaria su aplicación.

Pasajes para confirmación de aislamiento o descarte de negativos Cuando se tiene comprobada la presencia de un virus por cualquiera de los métodos

indicados y éstos no resultan suficientes para su identificación, entonces se procede a enfrentarlo a una batería de antisueros de referencia para tipificarlo por neutralización.

En caso de no aparecer ECP u otra evidencia de actividad viral, se hace un pasaje ciego, congelando los tubos y descongelando para inocular hacia nuevos tubos con monocapa e incubar en las mismas condiciones que para el aislamiento, controlando durante el mismo periodo de tiempo, para declararlo negativo si no hay evidencia alguna de actividad viral.

SERONEUTRALIZACION VIRAL EN CULTIVOS CELULARES

Se basa en el hecho de que si un virus es capaz, como en el caso del Sarampión, de ocasionar efecto citopático manifiesto en las Iíneas celulares, éste efecto puede ser neutralizado por la presencia de anticuerpos en el medio de cultivo. Es una prueba eminentemente cuantitativa, ya que se emplean concentraciones standard de virus determinadas según una previa titulación, lo cual establece la dosis infectante que se enfrentará a diluciones de los suero problema en paralelo con antisueros referenciales.

Se puede emplear para identificación de aislamientos y también para evaluación de anticuerpos circulantes.

Equipo y material necesario 1. Cabina de flujo laminar 2. Microscopio compuesto invertido 3. Incubadora con camiseta de agua y suministro de CO2 4. Pipeteador automático o pro-pipeta. 5. Placas descartables de microtitulación para cultivo de células, fondo plano, 96 agujeros ó

24 agujeros. 6. Tubos 16 x 125 mm. 7. Tapones de silicona para tubos 16 x 125 mm. 8. Tubos 13 x 100 mm. 9. Gradilla para tubos 13 x 100 m. 10. Pipetas descartables volumétricas de 10 mL, 5 mL, 1 mL, 11. Pipetas gotero

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12. Micropipetas de 200 a 1000 uL Procedimiento Todos los procedimientos emplean técnicas asépticas en cabina de flujo laminar y con dispositivos pro-pipeta, además de material descartable estéril. Titulación del virus

Una cepa de virus standard cultivada en líneas celulares se titula efectuando diluciones a la décima e inoculando a razón de 0.1 mL de cada dilución hacia cada uno de tres tubos con monocapa confluente. A partir de las 48 hrs. de incubación se controla para efecto citopático y al quinto o sétimo día se tendrá el punto final de titulación que viene a ser la mayor dilución en la que se observa ECP, cuando éste efecto es total representa la 100 Dosis Infectante y el título se expresa en log 100 CCID 50/0.1 mL.

Prueba de seroneutralización Se hacen diluciones dobles de los sueros problema y se mezcla cada dilución con volúmenes iguales del virus titulado para contener 100 CCID 50/0.1 mL. Se ensayan en paralelo controles de referencia y se corre una titulación simultánea del virus para comprobar que se está trabajando correctamente. Se incuba una hora a 4°C y se inocula 0.2 mL de cada mezcla hacia tres tubos de cultivo celular con monocapa confluente. Se incuba a 37°C controlando a partir de las 48 horas hasta que la titulación simultánea control del virus alcance su 100 CCID 50. Entonces ya se puede hacer la lectura de los tubos problema identificando la más alta dilución de suero capaz de neutralizar el efecto citopático.

Seroneutralización por micrométodo:

La prueba se realiza empleando volúmenes a la décima de los mencionados. Se trabaja con placas descartables de 96 agujeros, en cada uno de tres agujeros de la placa se adiciona 20 uL de las mezclas incubadas de antígeno y sueros problema por cada dilución y el de referencia y enseguida la suspensión celular ajustada para contener 3 x 105 células/0.1 ml incubando en atmósfera húmeda y suministro de C02, durante 7 días.

También se corre una titulación simultánea de antígeno con volúmenes a la décima.

Interpretación Cuando se trabaja con dos muestras de suero, una de fase aguda y otra

convaleciente, la prueba se utiliza para confirmación de infección y un aumento de más del cuádruple entre ambos sueros se considera significativo, siempre y cuando no haya historia previa de vacunación. Cuando se trabaja una sola muestra se emplea sin diluir para determinar el estado inmune y todo valor por encima de 1:2 se considera positivo.

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ANEXO 1

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Buffer fosfato salina (PBS) pH 7.4

Cloruro de sodio 8.00 gr. Cloruro de Potasio 0.20 gr. Fosfato de Potasio 0.14 gr. Fosfato de Sodio 0.91 gr.

Agua destilada 1.000 ml

Mezclar todos los ingredientes en frasco erlenmeyer con barra magnética para disolver bien en el agitador magnético o por fuerte agitadón. Medir el pH y ajustar a 7.4.

Buffer carbonato bicarbonato 0.05 M pH 9.5

Carbonato de sodio anhidro 1.59 gr. Bicarbonato de sodio 2.93 gr. Disolver en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH a 9 .5, mantener a 4°C por no más de 15 días.

Solución de lavado PB5-Yween 20 pH 7.4

PBS pH 7.4 1litro Tween 20 0.5ml Mantener a temperatura ambiente.

Sistema Sustrato OPD

Ortofenilendiamina (OPD) 10 mgr.

Peróxido de úrea 10 ul Buffer fosfato citrato 25m

Depositar en frasco acaramelado, proteger de la luz. El OPD es considerado un carcinógeno, hay que manipularlo con cuidado.

Sistema sustrato PNPP

Disolver el Para-nitrofenilfosfato a razón de 1 mg/ml en Buffer dietanolamina pH 9.8 con 0.0005 M de cloruro de Magnesio y 0.02 % de Azida de Sodio.

Buffer fosfato-cltrato pH 6.0, O. t M Solución A: Acetato de sodio 8.2 gr.

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Agua 1.000 ml Solución B: Acido cítrico 2.1 gr.

Agua 100ml Agregar pequeñas cantidades de la solución B a la solución A. aproximadamente 10 ml de ácido cítrico a 1 litro de acetato de sodio. Chequear el pH, ajustar a 6.0. Filtrar, esterilizar y repartir en alícuotas. Guardar a 40°C.

Solución salina balanceada Hank's 10X (Stock)

Cloruro de Caldo 1.4 gr. Disolver en 200 mi de agua bidestilada Cloruro de Sodio 80.0 gr.

Glucosa 10.0 gr. Cloruro de Potasio 4.0 gr.

Sulfato de Magnesio heptahidratado 2.0 gr. Fosfato ácido de Potasio 0.6 gr.

Fosfato ácido de Sodio monohidratado 0.6 gr. Disolver éstos 6 reactivos en 800 ml de agua bidestilada. Agregar lentamente y con agitación constante ésta segunda solución a la primera. Añadir 4 ml de cloroformo. Esterilizar por filtración o autoclavar a 15 libras de presión por 15 minutos en caso de no haberse adicionado previamente la glucosa, pudiendo agregar ésta posteriormente como ingrediente estéril. Almacenar en refrigeración.

Solución salina balanceada Hank's t (Uso)

Solución Hank's 10X 100 ml

Agua bidestilada estéril 900 ml Rojo de Fenol al 0.2 % 6 ml Ajustar el pH a 7.4 añadiendo aproximadamente 3 ml de solución de bicarbonato de sodio al 8.8 % estéril, por litro.

Solución antibiótica-antimicótica 100X En una solución de Cloruro de Sodio al 0.9 % diluir Penicilina G sódica en la cantidad necesaria para contener 10.000 UI por ml, Di-Estreptomicina a razón de 10 mg por ml y Anfotericina B (solubilizada con Dimetilsulfóxido ó dimetilformamida) a una concentración de 25 ugr, por mI.

Anticoagulante Alsever

Dextrosa 20.50 gr Citrato de sodio dihidratado 8.00 gr Acido cítrico 0.55 gr

Cloruro de Sodio 4.20 gr Agua destilada 1.000 ml

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El pH final debe ser de 6.0 a 6.1. Ajustar con NaOH 1 N o HCI 1 N. Esterilizar por filtración. Guardar a 4°C.

PBS M/15

Na2HP04 16.71 gr KH2P04 2.72 gr ClNa 8.5 gr Agua bidestilada 1,000 ml Esterilizar por autoclave a 121°C por 30 minutos.

Medio de Transporte Viral (MTV) Solución salina balanceada de Hanks 86 ml Albúmina bovina fracción V al 10 % en agua destilada 10 ml Bicarbonato de sodio al 5.6 % en agua destilada 2 ml Penicilina (1 millón UI/ml)+ Estreptomidna (10 mg/ml) 1 ml Nistatina (2500 UI/ml) 1 ml Rojo de Fenol al 0.4 % 0.4 ml Preparar los reactivos por separado, esterilizar por filtración los ingredientes termolábiles y combinar en frío, distribuír en tubos de vidrio con tapa de rosca en volúmenes de 2 mI. Conservar en refrigeración hasta su uso.

MEM EAGLE EN SALES DE HANK'S

MEM Eagle Hank's en polvo 10.20 gr. Bicarbonato de sodio 0.35 gr. Agua bidestilada autoclavada o demonizada 1 Lt. Rehidratar el medio en el agua bidestilada, agregar el bicarbonato y homogenizar bien. Esterilizar en membrana filtrante de 0.22 um. Almacenar a 4°C.

SOLUCION TRIPSINA - VERSENE

NaO 8.0 g KO 0,4 g Dextrosa 1.0 g Tripsina 1:250 0.5 g Versene 0.2 g NaHC03 0.58 g Rojo de renol 1 % 0,45 mL

Agua desmineralizada 1000.00 mL Esterilización: Filtro de membrana AP25/ HAWP/ AP32/ GSWP/ AP32 Almacenamiento: - 20°C

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REFERENCIAS

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