makalah biola mikroarray

32
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Seluruh gen manusia telah berhasil ditentukan urutan nukleotidanya. Persoalan yang kini dihadapi oleh para ahli biologi molekuler adalah melakukan analisis dan menentukan struktur dan fungsi gen serta pemetaan hubungan gen satu dengan lainnya. Analisis ini sangat bermanfaat untuk mengenali lebih jauh mengenai proses normal biokimia dan fisiologi yang terjadi di dalam tubuh manusia dan organisme lainnya. Analisis ini juga akan dapat membantu manusia untuk mengenali keadaan patologis seseorang serta dapat memperkirakan proses tanggapannya terhadap adanya rangsang dari luar, misalnya terhadap pemberian obat. Pemahaman tentang sistem kesehatan yang didasarkan pada analisis genomik saat ini telah melahirkan suatu cabang disiplin ilmu baru yang dinamakan Farmakogenomik. Salah satu teknologi utama yang digunakan untuk pengembangannya adalah DNA microarray. Melakukan analisis fungsi dan pemetaan hubungan satu dengan lainnya memang sulit dibayangkan. Bagaimana membuat kemungkinan hubungan dari unsur-unsur sebanyak itu. Ini akan menjadi sebuah gambaran yang menarik, karena hal itu terjadi di dalam tubuh manusia sehingga memungkinkan bagi manusia untuk lebih dapat memahami secara rinci mengenai peristiwa yang terjadi di dalam tubuhnya. 1

Upload: non-rosliana

Post on 29-Jun-2015

785 views

Category:

Documents


32 download

TRANSCRIPT

Page 1: makalah BIOLA mikroarray

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Seluruh gen manusia telah berhasil ditentukan urutan nukleotidanya. Persoalan

yang kini dihadapi oleh para ahli biologi molekuler adalah melakukan analisis dan

menentukan struktur dan fungsi gen serta pemetaan hubungan gen satu dengan

lainnya. Analisis ini sangat bermanfaat untuk mengenali lebih jauh mengenai proses

normal biokimia dan fisiologi yang terjadi di dalam tubuh manusia dan organisme

lainnya.

Analisis ini juga akan dapat membantu manusia untuk mengenali keadaan

patologis seseorang serta dapat memperkirakan proses tanggapannya terhadap adanya

rangsang dari luar, misalnya terhadap pemberian obat. Pemahaman tentang sistem

kesehatan yang didasarkan pada analisis genomik saat ini telah melahirkan suatu

cabang disiplin ilmu baru yang dinamakan Farmakogenomik. Salah satu teknologi

utama yang digunakan untuk pengembangannya adalah DNA microarray.

Melakukan analisis fungsi dan pemetaan hubungan satu dengan lainnya

memang sulit dibayangkan. Bagaimana membuat kemungkinan hubungan dari unsur-

unsur sebanyak itu. Ini akan menjadi sebuah gambaran yang menarik, karena hal itu

terjadi di dalam tubuh manusia sehingga memungkinkan bagi manusia untuk lebih

dapat memahami secara rinci mengenai peristiwa yang terjadi di dalam tubuhnya.

Oleh karena itu tidaklah berlebihan bila program tersebut dikatakan sebagai

suatu program ambisius yang sedang dikerjakan oleh manusia mengawali abad 21 ini.

Selain itu, mengikuti keberhasilan program sekuensing genom ini, juga dilakukan

program analisis keragaman genetik individu yang dinamakan Single Nucleotide

Polymorphism (SNP). Keberhasilan program tersebut akan berdampak sangat besar

terhadap kehidupan manusia, bahkan bisa jadi akan lebih luas dari perkiraan yang ada

pada saat ini.

Hasilnya, produk dari program ini akan menyediakan data lengkap mengenai

karakterisik asal manusia yang tersimpan di dalam gen-gen yang telah dipetakan

tersebut. Data lengkap gen atau data genomik ini akan membuka tabir mengenai

keseluruhan proses biokimiawi yang terjadi pada tubuh manusia yang berpengaruh

pada sifat-sifatnya. Pengetahuan yang lengkap tentang proses yang terjadi di dalam

1

Page 2: makalah BIOLA mikroarray

tubuh manusia ini akan dapat merubah paradigma dalam ilmu-ilmu yang berkaitan

dengan manusia, misalnya ilmu biokimia kesehatan dan psikologi medis.

Adanya pergeseran atau perubahan, baik wujud, saat ataupun jumlah dalam

penyediaan protein yang signifikan, akan dapat menimbulkan kelainan atau penyakit.

Perbedaan pola penyediaan protein (ekspresi gen) sebenarnya secara alami terjadi di

antara individu. Bahkan dapat dikatakan bahwa tidak ada dua individu yang memiliki

kesamaan dalam pola penyediaan protein tersebut. Namun demikian, perbedaan-

perbedaan yang ada tersebut masih berada dalam batas kenormalan fungsi secara

keseluruhan sehingga masih akan kelihatan kewajarannya.

Perbedaan dalam hal penyediaan protein inilah yang menyebabkan adanya

kepastian perbedaan antara orang satu dengan lainnya. Perbedaan-perbedaan tersebut

dalam kenampakannya (fenotipe) akan terlihat misalnya dalam hal bentuk fisik,

kecerdasan, emosi, kemampuan dalam hal tertentu (bakat), kepekaan terhadap segala

rangsangan, penyakit bawaan, kerentanan terhadap segala pengaruh termasuk obat-

obatan dan sebagainya. Singkatnya, segala sifat-sifat yang melekat pada pribadi

seseorang dapat dilacak dari karakter sel-selnya dalam penyediaan protein (genotipe).

Masalahnya sekarang adalah bagaimana caranya untuk mendapatkan data pola

penyediaan protein dari seseorang dari sejumlah gen yang banyak itu? Masalah ini

tidak sederhana. Kalau hanya satu atau dua atau beberapa jenis gen yang akan

dianalisis memang dapat digunakan metoda-metoda yang sudah mapan yang tersedia

pada saat ini, misalnya, Northern blot (RNA), Southern blot (DNA) dan Westhern

blot (protein) ataupun dot blot. Akan tetapi, dengan jumlah gen yang sebanyak

puluhan ribu itu, metoda-metoda tersebut sudah tidak memungkinkan lagi.

Pengembangan teknologi baru yang dinamakan chip DNA atau DNA

microarray, telah menjanjikan untuk dapat mengatasi persoalan dalam analisis pola-

pola ekspresi sejumlah besar gen yang dimiliki manusia. Dinamakan chip DNA

karena teknologi ini menggunakan lempengan kecil (chip) yang terbuat dari kaca yang

di atasnya ditata sejumlah ribuan atau bahkan puluhan ribu jenis gen dalam bentuk

fragmen DNA hasil penggandaan dari cDNA. Selanjutnya chip yang memuat fragmen

DNA dari ribuan jenis gen tersebut digunakan untuk menganalisis ekspresi gen dari

suatu jenis sel dengan hibridisasi. Pola ekspresi genetik dan jenis gen yang dapat

dianalisis dengan teknik ini tergantung pada ketersediaan DNA dari gen yang ada

pada chip DNA.

2

Page 3: makalah BIOLA mikroarray

Apabila seluruh gen yang dimiliki oleh manusia sudah dikenali, kemudian

semuanya dapat ditata pada chip DNA maka alat tersebut akan mampu menganalisis

ekspresi seluruh gen yang terdapat di dalam sel manusia. Dalam praktiknya, teknologi

ini membutuhkan alat bantu pengolah data yang berupa seperangkat komputer beserta

software-nya. Teknologi ini akan membantu manusia dalam melakukan identifikasi

seluruh sifat yang melekat pada seseorang. Selain itu teknologi ini juga akan dapat

membantu manusia dalam melakukan diagnosis, memonitor, dan memprediksi suatu

penyakit, menemukan dan mengembangkan obat baru serta menentukan pilihan obat

yang paling tepat untuk suatu penyakit dan pasien tertentu.

Teknik microarray tidak hanya berlaku untuk studi mengenai DNA, tapi juga

untuk protein. Hanya saja, untuk studi protein tidak semudah studi DNA dikarenakan

sifat protein yang dinamis, selalu berubah tergantung lingkungan sel sekitarnya. Pada

kesempatan kali ini akan dibahas mengenai studi DNA dan protein melalui teknik

microarray.

1.2 Perumusan Masalah

a. Apakah yang dimaksud dengan microarray DNA?

b. Bagaimanakah prinsip dasar dari kerja microarray DNA?

c. Bagaimanakah tahapan-tahapan dari sebuah teknologi microarray DNA?

d. Apakah yang dimaksud dengan proteomic profiling?

e. Bagaimanakah prinsip dasar dari kerja proteomic profiling?

f. Bagaimanakah tahapan-tahapan dari sebuah teknik proteomic profiling?

1.3 Tujuan

a. Menjelaskan pengertian dari microarray DNA?

b. Menjelaskan prinsip dasar dari kerja microarray DNA?

c. Menjelaskan tahapan-tahapan dari sebuah teknologi microarray DNA?

d. Menjelaskan pengertian proteomic profiling?

e. Menjelaskan prinsip dasar dari kerja proteomic profiling?

f. Menjelaskan tahapan-tahapan dari sebuah teknik proteomic profiling?

3

Page 4: makalah BIOLA mikroarray

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Microarrays DNA

2.1.1 Definisi dan Sejarah Microarrays DNA

Microarray DNA merupakan salah satu teknik dalam biologi molekuler,

perkembangan dari teknik Southern bolt, dimana fragmen DNA ditempelkan pada

suatu substrat dan kemudian dikenali dengan sebuah gen atau fragmen nukleotida

yang telah diketahui urutannya. Teknik ini pertama kali digunakan untuk menganalisa

378 urutan nukleotida dari koloni bakteri yang telah mengalami lisis sel, masing-

masing mengandung urutan nukleotida yang berbeda yang kemudian diperiksa

keseluruhan replikannya untuk diekspresi pada jaringan normal dan jaringan tumor

(Augenlicht dan Kobrin, 1982). Teknik ini kemudian diperluas penggunaannya untuk

menganalisa lebih dari 4000 urutan DNA manusia menggunakan scan komputer dan

print-outnya digunakan untuk analisis kuantitatif urutan DNA jaringan tumor dan

jaringan normal pada manusia (Augenlicht et al, 1987), kemudian dibandingkan

dengan jaringan dengan kemungkinan sifat genetik yang berbeda (Augenlicht et al.,

1991). Pemanfaatan kumpulan urutan DNA yang berbeda dalam pengenalan ekspresi

gen juga ditemukan pada tahun 1987 dan urutan DNAs tersebut digunakan untuk

mengidentifikasi ekspresi mana yang dimodulasi oleh adanya interferon. Pada

awalnya urutan DNA ini diperoleh dari pembacaan cDNAs pada kertas filter

menggunakan pin-spotting device. Manfaat miniatur microarray untuk ekspresi gen

telah dipublikasikan pada tahun 1995 dan disusul dengan adanya penemuan genom

lengkap Saccharomyces cerevisiae pada tahun 1997.

Microarrays DNA dapat digunakan untuk mengetahui perubahan pada tingkat

ekspresi gen, utnuk mendeteksi single nucleotide polymorphisms (SNPs), atau untuk

penyusunan ulang urutan gen pada genom yang mengalami mutasi. Teknik ini sangat

sensisitif dan memberikan hasil dengan keakuratan yang tinggi.

2.1.2 Prinsip Dasar Miroarrays DNA

Microarrays DNA mendeteksi ekspresi pada tingkat genetik dengan cara

mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada ribuan gen terimobilisasi di atas permukaan

gelas (chip). Prinsipnya adalah mensintesis cDNA dari RNA yang diisolasi dari dua

kondisi yang berbeda (misal sel tumor dan sel normal), kemudian dilakukan

penandaan dengan menggunakan unsur radioaktif fluorosens multiwarna. cDNA yang

4

Page 5: makalah BIOLA mikroarray

telah dilabeli ini kemudian dihibridisasi dengan sejumlah besar gen dari pustaka gen.

Hasil hibridisasi kemudian dianalisis dengan menentukan intensitas fluorosens relatif

untuk masing-masing gen dengan menggunakan scanner laser.

Gambar 1. Skema Tahapan Microarrays DNA

2.1.3 Tahapan-Tahapan dalam Microarrays DNA

Pada umumnya, ada beberapa tahapan utama yang harus dilakukan pada

microarrays DNA yaitu, preparasi microarrays, preparasi probe cDNA yang telah

dilabeli oleh fluoresens, proses hibridisasi, proses scanning serta analisis data dan

gambar.

2.1.3.1 Preparasi Miroarrays

Microarrays dapat dilakukan dengan dua format yang berbeda, yaitu :

oligonukleotida arrays dan cDNA microarrays. Array oligonukleatida diperoleh dari

proses pencetakan urutan pendek oligonukleatida yang mewakili suatu gen dengan

cara mensintesis secara langsung urutan nukleotida pada permukaan padatan

pendukung. Panjang urutan nukleatida dapat beragam, mungkin lebih panjang (60

probe) seperti Agilent atau lebih pendek sekitar 25 probe seperti Affymetrix. Panjang

urutan nukleotida bergantung pada tujuan penggunaan, probe yang lebih panjang akan

lebih spesifik dalam pengenalan gen individu target, namun probe yang lebih pendek

akan lebih murah dalam produksi pembuatannya.

5

Page 6: makalah BIOLA mikroarray

Oligonukleatida dapat disintesis secara in situ, langsung di permukaan chip

atau disintesis terlebih dahulu kemudian disimpan ke dalam chip. Teknik ini tidak

membutuhkan pengelolaan pustaka klon sebagai database. Teknik ini sesuai untuk

analisis ekspresi genetik suatu organisme dengan susunan genomik yang lengkap.

Pada sintesis oligonukleatida secara in situ, oligonukleatida langsung dikemas

ke dalam suatu padatan pendukung. Affymetrix memperoleh urutan DNA dengan

menggunakan pendekatan potolitografi, dimana lampu merkuri digunakan untuk

menyinari permukaan chip melalui penutup potolitografi, secara selektif

menghilangkan gugus yang bersifat photo-labile dari rantai tumbuh oligonukleatida.

Masing-masing elemen berukuran sekitar 10µm, pada miniaturisasi lanjut, elemen-

elemen ini ditambahkan dengan menggunakan teknologi photoresist semikonduktor

non-linear. Teknik sintesis ini tidak memerlukan proses pemurnian oligonukleatida

dikarenakan randemen yang didapat sekitar 95% dan oligonukleatida yang disintesis

tidak lebih dari 25 basa nukleotida.

Sedangkan cDNA arrays diperoleh dari mencetak untai ganda cDNA ke

dalam padatan pendukung, seperti gelas atau nilon menggunakan robotic pins.

Terdapat dua tahapan utama dalam mikroaray cDNA adalah preparasi klon cDNA

yang diamplifikasi menggunakan teknik PCR lalu kemudian menotolkan klon cDNA

pada tingkat densitas yang tinggi ke atas slide kaca mikroskopik. Walaupun pada

umumnya kumpulan cDNA terbuat dari slide kaca, namun DNA dapat juga ditotolkan

pada fasa padat pendukung, misalnya nitroselulosa atau membran nilon yang

bermuatan. Tipe aray yang menggunakan fasa padat pendukung ini dikenal sebagai

paper arrays atau makroaray. Microarray yang menggunakan slide kaca hanya dapat

dipergunakan sekali dan membutuhkan biaya operasi yang tinggi pada proses

pelabelan kit dan proses scanningnya.

2.1.3.2 Preparasi Pelabelan cDNA dan Hibridisasi

Dalam microarray, nukleotida yang akan dianalisa disebut sebagai probe.

Probe merupakan mRNA yang diperoleh dari sel makhluk hidup, misalnya rambut,

kuku, air liur dan lain sebagainya. Untuk memperoleh mRNA, maka mRNA harus

dipisahkan dari seluruh komponen yang terdapat dalam suatu sel.

Dalam teknik isolasi mRNA, hal yang pertama dilakukan adalah lisis sel. Lisis

sel dapat dilakukan secara fisik maupun kimiawi. Cara kimiawi merupakan cara yang

paling sering digunakan dalam proses lisis sel dengan cara menambahkan dua jenis

6

Page 7: makalah BIOLA mikroarray

senyawa, dimana senyawa pertama berfungsi untuk merusak dinding sel sedangkan

senyawa lainnya berfungsi untuk merusak membran sel. Proses lisis sel biasanya

dilakukan dengan cara menambahkan lisozim, etilendiamintriasetat (EDTA) dan

sodium dodesil sulfat (SDS). Lisozim berperan untuk merusak dinding sel karena

senyawa tersebut dapat memotong senyawa polimer. EDTA dapat mengikat ion

magnesium yang berfungsi dalam mempertahankan selubung sel dan sebagai kofaktor

bagi enzim-enzim yang dapat merusak DNA. SDS diperlukan untuk menghilangkan

molekul lipid, sehingga dapat digunakan untuk merusak membran sel. Sel yang telah

ditambahkan ketiga jenis senyawa tersebut kemudian dimasukkan ke dalam water

bath.

Di dalam ekstrak sel terkandung mRNA, DNA dan protein. Protein dapat

dihilangkan dengan cara menambahkan fenol atau campuran fenol-kloroform 1:1.

pelarut organik tersebut akan mengendapkan protein, namun DNA dan RNA akan

tetap berada dalam fasa larutannya. Jika jumlah protein cukup banyak, maka sebelum

penambahan fenol-kloroform, ke dalam campuran dapat ditambahkan proteinase K,

suatu enzim yang dapat memecah polipeptida menjadi fragmen-fragmen yang mudah

dihilangkan dengan penambahan fenol. Campuran kemudian disentrifugasi dan

didekantasi untuk memisahkan supernatan dan residunya. Fasa supernatan kemudian

ditambahkan isopropil alkohol, RNA yang tidak larut dalam isopropil alkohol akan

mengendap.

Langkah selanjutnya adalah mengkonversi mRNA menjadi cDNA kemudian

melakukan penandaan terhadap cDNA menggunakan bahan fluoresens. Fluoresens

yang sering digunakan adalah Cy3 yang berwarna hijau sebagai kontrol dan Cy5 yang

berwarna merah sebagai tes. Baik RNA total ataupun poli(A+) RNA dapat digunakan

dalam reaksi reverse transkriptase.

Terdapat dua macam penandaan yang dapat digunakan, yaitu direct labelling

dan indirect labelling. Pada direct labelling, Cy3 atau Cy5-labelled dUTP bergabung

secara dengan cDNA selama reverse transcription berlangsung. Walaupun ini paling

umum digunakan dalam microarray DNA, namum ini memiliki kekurangan yaitu

kompleks Cy5-labelled nukleotida lebih sukar untuk bergabung dengan cDNA

dibandingkan dengan kompleks Cy3-labelled nukleotida.

Pada indirect labelling, kompleks antara amino-allyl dan nukleotida yang

telah dimodifikasi bergabung dengan cDNA selama berlangsungnya proses sintesis

7

Page 8: makalah BIOLA mikroarray

untai pertama cDNA untuk kedua sampel, dan selanjutnya terbentuk NHS-ester pada

senyawa sianin yang sesuai melalui suatu ikatan kovalen.

Pada proses direct labelling, labelled nukleotida yang tidak bergabung dengan

cDNA harus dihilangkan dari kompleks Cy5-labelled nukleotida-cDNA. Sedangkan

pada proses indirect labelling, kompleks amino-allyl-labelled nukleotida dan

fluoresens yang tidak berpasangan harus dihilangkan dari cDNA yang telah ditandai

dengan cara yang tepat. Teknik peghilangan yang tidak sesuai dapat memberikan hasil

berupa background yang kurang baik. Hal ini disebabkan karena Cy3 ataupun Cy5

sangat sensitif terhadap cahaya. Terpaan cahaya selama proses berlangsung harus

dihindari atau dibuat seminimal mungkin.

Tabel 1. Beberapa Kit Pelabelan dalam Microarray

Company Kit LabellingTotal RNA yang

dibutuhkan

Stratagene Fair Play labelling kit Indirect 10-20 µg

Clontech AtlasTM PowerscriptTM

fluoroscent labelling kit

AtlasTM Glass

fluoroscent labelling kit

Indirect 3 µg

10 µg

Agilent

Tech.

Direct labelling kit Indirect 10 µg

Perkin Elmer MICROMAXTM direct

labelling kit

MICROMAXTM TSA

labelling kit

Direct 20-30 µg

0,5-1 µg

Genetix Hyspot direct labelling

kit

Direct

Qiagen LabelStarTM array

labelling kit

Direct dan indirect 0,2-50 µg

Genisphere ARRAY 350RPTM 0,5-2 µg

Hasil dari reaksi penandaan dapat dianalisa baik menggunakan

spektofotometer ataupun menggunakan gel agarosa. Pada spektrofotometer,

8

Page 9: makalah BIOLA mikroarray

pengukuran perbandingan antara nukleotida dan senyawa fluorosens dilakukan

dengan cara membaca absorbansi pada 260 nm untuk DBA dan 550 nm untuk Cy3

atau 650 nm untuk Cy5. Cara lainnya adalah dengan melakukan running terhadap

sejumlah cDNA yang telah ditandai menggunakan laser scanner untuk memverifikasi

ukuran rata-rata dan kualitas dari cDNA yang telah ditandai.

Langkah selanjutnya adalah menghibridisasi cDNA yang sebelumnya telah

ditandai menggunakan radioisotop fluorosens dengan pustaka gen yang dimuat dalam

chip. Seperti halnya proses hibridisasi yang lain, hibridisasi dalam microarray DNA

pun membutuhkan spesifikasi yang tinggi dan sinyal background seminimal mungkin

untuk hasil yang baik. Selama proses hibridisasi berlangsung, pembentukan

gelembung harus dihindari karena dapat memberikan dampak pada analisis dengan

terbentuknya background yang berlebih.

2.1.3.3 Scanning serta Analisis Data dan Gambar

Setelah proses hibridisasi selesai, slide kemudian discan menggunakan laser

scanner yang mampu membedakan antara Cy3 dan Cy5-labelled probe untuk

menghasilkan scanning yang berbeda secara terpisah untuk masing-masing

penandaan. Hasil scanning kemudian dianalisis untuk menghitung jumlah relatif

ekspresi untuk masing-masing gen.

Hasil scanning yang baik memiliki background yang rendah, seragam serta

rasio yang baik antara sinyal dan pulsa. Analisis hasil scanning terdiri dari identifikasi

titik, determinasi background dan kalkulasi background dikurangi dengan intensitas

fluoresens untuk masing-masing sampel. Lokasi spot perlu diidentifikasi lebih dulu

dikarenakan adanya probe yang mengendap, artefak hibridisasi dan kontaminan

seperti debu di permukaan slide, dapat memberikan sinyal yang keliru.

Spot dapat diidentifikasi dengan mudah dikarenakan spot terletak dengan

susunan tertentu. Setelah spot berhasil teridentifikasi, langkah selanjutnya adalah

estimasi sinyal background. Background pada umumnya dapat dihitung di sekitar

posisi masing-masing spot. Kemudian background dikurangi dengan intensitas

fluorosens untuk masing-masing sampel. Rasio perbandingan Cy3 dan Cy5 yang

terukur digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan ekspresi gen.

Data yang diperoleh kemudian dinormalisasi untuk menyesuaikan perbedaan

reaksi penandaan untuk kedua sampel, efisiensi deteksi penandaan menggunakan

fluorosens dan juga perbedaan pada kuantitas RNA dari sampel yang digunakan.

9

Page 10: makalah BIOLA mikroarray

normalisasi yang biasa digunakan adalah mengukur intensitas fluorosens

total. Jumlah intensitas fluorosens di seluruh spot harus sama untuk kedua channel

karena jumlah RNA yang digunakan untuk reaksi penandaan masing-masing sampel

sama. Walaupun intensitas mungkin berbeda untuk beberapa spot pada kedua

channel, namun intensitas rata-rata per spot adalah sama. Intensitas rata-rata per spot

dapat dihitung dengan membagi intensitas total semua spot umtuk satu channel

dengan jumlah keseluruhan spot.

lain, satu atau lebih sampel RNA dapat ditambahkan pada konsentrasi yang

sama untuk masing-masing sampel, kemudian normalisasi dilakukan dengan

menganggap jumlah dari intensitas dari spot-spot tersebut dengan gen kontrol adalah

sama. Setelah normalisasi selesai, ekspresi gen yang berbeda dapat diidentifikasi.

2.2 Proteomic Profiling

2.2.1 Definisi Proteomic Profiling

Microarrays DNA telah memberikan hasil yang luar biasa dalam pengukuran

tingkat ekspresi gen. Bagaimanapun, sulit, jika tidak mungkin untuk memprediksi

lingkungan seluler yang senantiasa berubah-rubah hanya dengan memperhatikan

tingkat transkripsi DNA. Pada kenyataannya, tidak ada korelasi yang reliable antara

aktivitas gen dan konsentrasi protein. Hal inilah yang menyebabkan, pentingnya studi

proteomik dilakukan.

Proteomik merupakan kelanjutan dari studi genomik pada sistem biologi,

mengenai protein yang diproduksi oleh sebuah sel serta fungsi fisiologisnya. Studi

proteomik jauh lebih rumit daripada studi genomik dikarenakan DNA organisme

bersifat konstan sedangkan protein setiap sel berbeda dari waktu ke waktu tergantung

pada pengaruh lingkungan dan stimultan. Perilaku biologis sel ditentukan berdasarkan

pola ekspresi gen di dalam sel tersebut. Setiap sel manusia memiliki milyaran subunit

DNA yang mengkode puluhan ribu gen dan setiap sel hanya memiliki beberapa fraksi

gen yang aktif. Gen abnormal memberikan perubahan ekspresi gen atau protein yang

secara fungsional mewakili genom.

Bekerja dengan protein jauh lebih sulit daripada dengan asam nukleat. Selain

karena hal yang telah disebutkan, kesulitan lainnya adalah sifat protein yang tidak

dapat diamplifikasi. Selain itu, protein mudah terdenaturasi dengan adanya sedikit

perubahan kondisi percobaan, yang menyebabkan perubahan struktur.

Karena pentingnya fungsi yang dimiliki protein seperti metabolisme,

reproduksi sel, dan lain-lain maka studi proteomik menjadi hal yang penting untuk

10

Page 11: makalah BIOLA mikroarray

dilakukan. Studi proteomik digunakan untuk mengidentifikasi penyakit sehingga

dapat bermanfaat dalam tindakan pencegahan, diagnosis dan pengobatan. Dengan

diketahuinya protein yang terekspresi untuk penyakit tertentu maka obat untuk

penyakit tersebut dapat diproduksi.

2.2.2 Deteksi Protein Menggunakan Teknik Microarray

Microarray protein hampir serupa dengan microarray DNA, terdiri atas spot

berukuran mikro dari antibodi, protein, atau peptida yang disusun pada sebuah chip.

Proteomik dengan microarray memiliki banyak keuntungan, diantaranya adalah

cepat, akurat, sensitif, dapat menganalisis ribuan analit dalam satu kali percobaan

serta jumlah sampel yang dibutuhkan relatif sedikit, baik jumlah material yang

disusun pada chip serta jumlah sampel yang harus dianalisis. Karena sampel yang

digunakan sedikit sehingga dapat meminimalkan jumlah reagen yang digunakan.

Perkembangan aplikasi microarray protein lebih lambat dibandingkan

microarray DNA karena adanya peningkatan komplesifitas protein. Sebagai contoh,

urutan asam nukleat berukuran hingga 50 pb dapat langsung diubah menjadi untai

komplementernya dan kekuatan ikatan antara keduanya pun dapat diketahui. Namun,

berbeda halnya dengan protein. Sejauh ini tidak ada persamaan matematika yang

dapat digunakan untuk mengkalkulasinya. Protein pasangan dan kekuatan ikatan yang

terbentuk ditentukan secara empiris. Lebih lanjut, asam nukleat lebih mudah disintesis

dan direplikasi. Sedangkan untuk sintesis peptida diperlukan biaya mahal dan protein

yang terekspresi sulit dimurnikan dan digandakan. Struktur dan sifat kimia yang

beragam menyebabkan satu teknik microarray tidak dapat digunakan untuk seluruh

protein.

Microarray protein dimulai dengan menempatkan larutan protein dari sumur

plate microtiter ke permukaan slide mikroskop. 40.000 unit protein, dengan diameter

150-250µL dapat dicetak pada slide mikroskop. Larutan protein diinkubasi dan

interaksi ikatan spesifik menempatkan komponen spesifik pada spot yang sesuai.

Protein yang saling berikatan dideteksi menggunakan luminecent atau radioisotop.

I. Array Printing

A. Chip atau Surface Array

Salah satu chip yang digunakan dalam microarray protein adalah FAST Slides

produksi Whatman. FAST Slides merupakan polimer berbasis nitroselulosa dengan

reprodusibilitas dan sensitifitas yang tinggi dalam uji microarray. Tidak seperti chip

11

Page 12: makalah BIOLA mikroarray

lain, FAST Slides memiliki lapisan polimer tiga dimensi yang telah digunakan untuk

immobilisasi biomolekul selama beberapa dekade. Sifat material dan kombinasi

dengan area permukaan yang sangat luas dari struktur tiga dimensinya memberikan

kapasitas ikatan yang lebih tinggi dibanding struktur planar dan chip tiga dimensi

yang lainnya. Struktur tiga dimensinya memberikan respon yang linear antara jumlah

interaksi protein dan intensitas sinyal.

Gambar 2. Struktur Tiga Dimensi FAST Slides dari Analisis SEM, Perbesaran 10000x

FAST Slides dapat digunakan untuk mendeteksi interaksi protein-protein

(termasuk antigen-antibodi), protein-DNA, protein-RNA dan protein-ligan, baik di

bawah kondisi denaturasi ataupun tidak terdenaturasi. Studi proteomik dengan FAST

Slides pada umumnya digunakan untuk microarray protein di bawah kondisi tidak

terdenaturasi. Tidak seperti teknik blot, dengan menggunakan FAST Slides, protein

langsung disusun tanpa melewati tahap SDS-PAGE dan transfer elektron, yang dapat

mengakibatkan terjadi pengurangan aktivitas protein. Kontras dengan array

konvensional, sifat alami protein yang disusun dan dikeringkan pada matriks

nitroselulosa FAST Slides dapat senantiasa dipertahankan.

12

Page 13: makalah BIOLA mikroarray

Gambar 3. Grafik Hasil Deteksi Protein dengan FAST Slides dan Film Nitroselulosa 2 Dimensi, Diinkubasi dalam Larutan Rekombinan IL-6 pada Konsentrasi 2,5 mg/ml Menggunakan

Biotinilasi Anti-IL-6-Antibodi dan Streptavidin-Cy5

B. Buffers

Pada studi proteomik, diperlukan suatu pelarut yang sesuai untuk

mempertahankan sifat alami dari protein yang akan dianalisis. Karena itu, diperlukan

suatu buffer dengan pH dan kekuatan ionik yang sesuai, zat penstabilisasi seperti

inhibitor protease, khelator, dan lain-lain sebagainya. Pada umumnya, buffer yang

sering digunakan adalah PBS.

C. Buffer Tambahan

Beberapa studi proteomik memerlukan penambahan suatu detergen dan/atau

urea untuk merusak dinding sel atau kelarutan protein. Penggunan DMSO (Dimetil

Sulfat Oksida) pada umumnya tidak dianjurkan, dikarenakan tingginya konsentrasi

DMSO dapat memberi pengaruh negatif terhadap nitratselulosa dan bahkan

merusaknya. Penambahan DMSO yang masih diperbolehkan adalah konsentrasinya

tidak melebihi 5% dari total larutan.

D. Konsentrasi Protein

Konsentrasi protein dapat berbeda untuk satu protein yang satu dan yang lain.

Sebagai contoh, untuk studi antibodi, protein yang dispotkan ke chip memiliki

konsentrasi antara 250 dan 1000 µg/ml.

13

Page 14: makalah BIOLA mikroarray

E. Waktu Pengeringan

Berdasarkan pengamatan telah diketahui bahwa ikatan protein terhadap

nitroselulosa (chip) akan meningkat sejalan dengan bertambah panjangnya waktu

pengeringan. Oleh karena itu, disarankan untuk menyimpan slide sehari semalam

dalam desikator pada suhu ruangan setelah proses arraying untuk memaksimalkan

kekuatan ikatan protein yang telah diarray.

F. Ukuran Spot

Pada umumnya, spot diusahakan sekecil mungkin untuk memberikan

kerapatan yang maksimal dan perbandingan sinyal terhadap background yang baik.

II. Assay Process

A. Attachment dan Blocking

Proses attachment yang sempurna hanya mengikat protein yang spesifik.

Namun, untuk memperoleh hal tersebut tidaklah mudah disebabkan beragamnya sifat

protein, misal dalam hal kepolaran, hidrofobisitas, muatan, ukuran dan struktur.

Proses attachment dapat berlangsung melalui mekanisme adsorpsi, afinitas ikatan

maupun ikatan kovalen. Mekanisme attachment secara adsorpsi adalah yang paling

mudah, dimana penempelan protein melalui gaya elektrostatis ataupun hidrofobik.

Chip yang biasa digunakan untuk adsorpsi protein yaitu poly(vinylidene

fluroide) (PVDF), nitrocelulose, polystirene atau poly-L-lysine yang dilapisis kaca

Seperti yang telah disebutkan, kesulitan dalam proses attachment protein adalah

terbentuknya ikatan dengan protein non spesifik. Untuk mencegahnya, diperlukan

suatu teknik blocking menggunakan suatu blocking agent, contohnya protein susu.

Teknik blocking lain yang dapat digunakan adalah penambahan larutan garam pekat,

surfaktan pekat, protein terdenaturasi atau pelapiasan chip dengan protein anionik.

Teknik blocking tersebut dapat mengurangi jumlah ikatan dengan protein non

spesifik. Walaupun demikian, kemungkinan untuk terbentuknya ikatan dengan protein

non spesifik masih ada. Dengan kata lain, tidak pernah diperoleh blocking yang

sempurna. Kesulitan lain adalah kemungkinan terjadinya pelepasan ikatan dengan

protein spesifik pada saat pencucian, terutama jika menggunakan larutan garam atau

surfaktan pekat.

14

Page 15: makalah BIOLA mikroarray

Tabel 2. Beberapa Attachment Protein

Attachment yang diperoleh melalui mekanisme afinitas ikatan memiliki daya

ikat yang kuat dan selektifitas yang tinggi terhadap protein spesifik. Misalnya, ikatan

antara biotin dan avidin atau antara protein A dan IgG. Baik chip dan protein yang

akan ditempelkan, keduanya harus diderivatisasi terlebih dahulu dengan komponen

yang terlibat dalam interaksi biologis. Bila chip yang telah terderivatisasi resisten

terhadap adsorpsi protein non spesifik, maka background akan minimal sedangkan

intensitas dari ikatan spesifik akan meningkat.

Contoh derivatisasi adalah pelapisan chip dengan poli etilen glikol (PEG) yang

diderivatisasi dengan biotin atau septavidin. Antibodi yang mengandung biotin akan

terikat pada chip, sedangkan protein non spesifik akan dihilangkan oleh PEG.

Kelemahan dari tipe attachment ini adalah diperlukannya pekerjaan tambahan dalam

mempreparasi protein yang akan ditempelkan. Modifikasi pada tahap preparasi dapat

mengubah struktur alami protein tersebut.

Mekanisme attachment yang lain adalah berdasarkan ikatan kovalen. Protein

yang ditempelkan memiliki daya ikat yang paling kuat dibandingkan mekanisme

attachment lainnya. Daya ikat yang kuat ini memungkinkan untuk dilakukannya

perlakuan menggunakan hard surfactant untuk menghilangkan protein yang terikat

15

Page 16: makalah BIOLA mikroarray

lemah dari chip. Reaksi antara gugus amin pada protein, baik dari residu lysin atau

gugus terminal amin, dengan gugus fungsi terimobilisasi, misalnya aldehida atau

suksinimida adalah metoda ikatan kovalen yang paling umum digunakan.

Pembentukan gugus aldehida pada permukaan chip melibatkan reaksi oksidasi

karbohidrat pada poliakrilamid atau agarosa serta ikatan silang gluteraldehida

terhadap poliakrilamid yang terimobilisasi atau aminoxilen. Contoh ikatan kovalen

lainya adalah molekul IgG yang terikat secara kovalen melalui reaksi oksidasi dengan

karbohidrat pada daerah Fc molekul membentuk aldehida dan mereaksikan aldehid

tersebut dengan hydrazide activated surface. Reaksi oksidasi terhadap antibodi

sebenarnya dapat merusak ikatan antigen. Mekanisme attachment secara kovalen

yang terbaik diperoleh dengan mereaksikan gugus amina protein dengan ikatan silang

gugus amina yang terimobilisasi.

Buffer yang biasa digunakan pada proses attachment adalah PBS (pH 7,2-7,5)

yang mengandung 0,05% Tween 20, 0,1% BSA dan zat aditif yang lain seperti

inhibitor protease. Waktu inkubasi biasanya selama 1-2 jam pada suhu ruangan untuk

studi antibodi.

G. Deteksi

Microarray protein dapat dideteksi menggunakan Enzyme-Linked

Immunosorbent assay (ELISA), deteksi radioisotop dan fluorosens baik secara

langsung maupun tidak langsung. Deteksi secara langsung menggunakan penandaan

langsung terhadap protein yang akan dianalisa. Sedangkang deteksi secara tidak

langsung melalui labelled-antibodi yang terikat terhadap protein yang dianalisis.

Deteksi secara tidak langsung umumnya menggunakan sandwich ELISA, dimana

antibodi monoklonal yang terikat pada plat mengikat antigen spesifik kemudian

antigen tersebut akan mengikat labelled-antibodi. Jumlah labelled-antibodi yang

terikat pada antigen menunjukkan jumlah antigen tersebut.

16

Page 17: makalah BIOLA mikroarray

Gambar 4. Sandwich ELISA

Deteksi secara langsung ini paling efektif digunakan dalam microarray bila

hanya satu analit yang harus diidentifikasi, misalnya sebuah antigen tunggal atau

sebuah immunoglobulin. Antibodi kedua dapat dilabel menggunakan fluorosens atau

enzim yang menghasilkan senyawa luminesens.

Deteksi langsung terhadap protein yang akan dianalisis berguna untuk

mendeteksi protein nonantibodi dalam jumlah banyak. fluorosens adalah yang sering

digunakan. Namun, penandaan radioisotop adalah yang paling sesuai jika sejumlah

tertentu protein akan diinkubasi pada chip. Kelebihan penandaan menggunaan

radioisotop adalah tidak merusak struktur protein yang dilabel, seperti jika

ditambahkan senyawa fluorosens atau senyawa enzimatik.

Penandaan menggunakan flourosens lebih mudah dibandingkan menggunakan

radioisotop dan biasanya diperoleh dari ikatan kovalen antara gugus amina protein

dan gugus reaktif fluorophore terkonjugasi. Seperti N-hydroxysuccinimide. Penandaan

menggunakan fluorosens digunakan untuk mendeteksi protein suatu individu.

Kegunaan fluorosens adalah kemampuannya untuk mendeteksi banyak panjang

gelombang secara simultan dan perbandingan analit dengan jumlah sampel awal

secara kuantitatif.

deteksi yang lain adalah menggunakan spektrometri massa (MS). Tetapi ini

kurang efektif dikembangkan secara laboratorium. Teknik rolling cyrcle amplification

(RCA) merupakan teknik dengan sensitifitas tinggi yang ditunjukkan dengan

rendahnya limit deteksi. Teknik RCA ini dilakukan pada fasa padat untuk jumlah

protein lebih dari 100 lipatan. Pada deteksi secara tidak langsung, antibodi

ditempelkan dengan primer DNA dimana untai DNA diperpanjang menggunakan

RCA setelah antibodi terikat pada target. Oligonukleotida yang telah ditandai

17

Page 18: makalah BIOLA mikroarray

berpasangan dengan komplementernya kemudian dihibridisasi untuk memperpanjang

untai DNA. Hasilnya adalah sinyal deteksi amplifikasi rata-rata.

Proses microarray protein menggunakan senyawa fluorosens ditunjukkan pada

Gambar 3.

Gambar 5. Microarray Protein

Dua buah sampel protein kompleks, protein standar dan protein tes ditandai

berturut-turut dengan senyawa fluorosens Cy3 dan Cy5, kemudian diinkubasi.

Senyawa fluorosens yang tidak terikat dengan protein kemudian dihilangkan dari

campuran. Kedua sampel kemudian digabungkan dan dipindahkan pada permukaan

chip. Setelah protein kedua sampel terikat secara kovalen pada spot yang sesuai

dengan ikatan protein spesifik, intensitas relatif sinyal dari fluorosens diukur.

Intensitas fluorosens menunjukkan ukuran kelimpahan protein. Penentuan intensitas

fluorosens sangat akurat dikarenakan ke dalam sampel ditambahkan suatu standar

internal untuk tujuan normalisasi.

2.3 Aplikasi Microarray

2.3.1 DNA Profilling

Salah satu aplikasi microarray DNA dalam biologis kanker adalah untuk

mempelajari proses metastasis pada tumor. Untuk beberapa kasus tumor, tumor yang

semula berada di dalam sel, kemudian berkembang dan menyebar ke organ lain,

misalnya tulang. Untuk mempelajari urutan DNA sebagai penyebab munculnya

18

Page 19: makalah BIOLA mikroarray

metastasis tumor dapat dilakukan melalui teknik microarray DNA. Melalui suatu

teknik isolasi secara in vivo diperoleh sel tumor yang telah mengalami metastasis dan

urutan DNA tersebut kemudian dibandingkan dengan sel tumor yang belum

mengalami metastasis.

Studi microarray telah digunakan untuk mempelajari urutan DNA penyebab

metastasis tumor pada otak (Nishizuka et al., 2002). Aplikasi lain dari microarray

DNA adalah identifikasi dan analisis gen yang telah mengalami mutasi,

penelompokkan tumor, identifikasi biomarker tumor dan drug discovery.

2.3.2 Protein Profilling

Suatu array antigen, protein dan juga peptida berguna untuk studi mengenai

fungsi biologis protein dalam suatu organisme melalui suatu pengukuran interaksi

protein-protein, protein-asam nukleat, protein-molekul kecil, dan enzim-substrat.

Suatu array peptida dan protein juga dapat digunakan untuk menentukan respon imun

atau karakterisasi autoantigen dalam suatu penyakit autoimun. Contohnya, Robinson

et al. telah mengkoleksi dan menyusun ratusan peptida yang merupakan autoantigen

dalam sistem lupus erythematosus dan rhematoid arthritis. Setelah serum darah

diinkubasi pada chip, ikatan antibodi menunjukkan reaktivitas immunologis terhadap

protein yang bersangkutan. Penggunaan peptida arrays memberikan hasil yang lebih

baik untuk pemetaan dari penyebaran sisi autoreaktif. Sebagai tambahan, pola

penyebaran reaktifitas antigen pada individu dapat digunakan untuk merencanakan

proses perawatan/pengobatan terhadap penderita.

19

Page 20: makalah BIOLA mikroarray

BAB III

PENUTUP

Microarrays DNA mendeteksi ekspresi pada tingkat genetik dengan cara

mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada ribuan gen terimobilisasi di atas permukaan

gelas (chip). Prinsipnya adalah mensintesis cDNA dari RNA yang diisolasi dari dua

kondisi yang berbeda (misal sel tumor dan sel normal), kemudian dilakukan

penandaan dengan menggunakan unsur radioaktif fluorosens multiwarna. cDNA yang

telah dilabeli ini kemudian dihibridisasi dengan sejumlah besar gen dari pustaka gen.

Hasil hibridisasi kemudian dianalisis dengan menentukan intensitas fluorosens relatif

untuk masing-masing gen dengan menggunakan scanner laser.

Microarrays DNA telah memberikan hasil yang luar biasa dalam pengukuran

tingkat ekspresi gen. Proteomik merupakan kelanjutan dari studi genomik pada sistem

biologi, mengenai protein yang diproduksi oleh sebuah sel serta fungsi fisiologisnya.

Studi proteomik jauh lebih rumit daripada studi genomik dikarenakan DNA

organisme bersifat konstan sedangkan protein setiap sel berbeda dari waktu ke waktu

tergantung pada pengaruh lingkungan dan stimultan. Microarray protein dimulai

dengan menempatkan larutan protein dari sumur plate microtiter ke permukaan slide

mikroskop. 40.000 unit protein, dengan diameter 150-250µL dapat dicetak pada slide

mikroskop. Larutan protein diinkubasi dan interaksi ikatan spesifik menempatkan

komponen spesifik pada spot yang sesuai. Protein yang saling berikatan dideteksi

menggunakan luminecent atau radioisotop.

Dengan adanya micoarray DNA dan protein ini dapat membantu manusia

dalam melakukan diagnosis, memonitor, dan memprediksi suatu penyakit,

menemukan dan mengembangkan obat baru serta menentukan pilihan obat yang

paling tepat untuk suatu penyakit dan pasien tertentu.

20

Page 21: makalah BIOLA mikroarray

DAFTAR PUSTAKA

Albala, Joanna S., Ian Humpheiy-Smith.2003. Protein Arrays, Biochips and Proteomic. University Of Utrecht: Marceld Ekkerin,Inc .

Augenlicht et al.. 1987. “Expression of Cloned Sequences in Biopsies of Human Colonie Tissue and in Colonie Cells Induced to Differentiate In Vitro”. Cancer Research, 47, 6017-6021.

Augenlicht et al.. 1991. ” Patterns of Gene Expression that Characterize the Colonic Mucosa in Patients at Genetic Risk for Colonic Cancer”. Proceedings National Academy of Sciences, 88, 3286-3289.

Augenlicht, LH, dan Kobrin. 1982. ” DE Cloning and Screening of Sequences Expressed in A Mouse Colon Tumor”. Cancer Research, 42, 1088-1093.

Nishizuka I, et al.. 2002.”Analysis of Gene Expression Involved in Brain Metastasis from Breast Cancer Using cDNA Microarray”. Breast Cancer, 9, 26-32.

Somasundaram, Kumaravel et al. 2002.” DNA Microarray Technology and its Application in Cancer Biology”. Applied Genomic and Proteomic, 1, (2), 1-10.

21