Identifikasi jenis senyawa pada larutan asam amino dengan kromatografi lapis tipis

I. Tujuan

Mengidentifikasi jenis senyawa pada larutan yang mengandung asam amino

II. Prinsip percobaan

Meneteskan larutan pada plat kromatografi lapis tipis lalu diidentifikasi jenis senyawa tersebut.

III. Landasan Teori

Asam amino adalah suatu  senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH)

dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat

pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C "alfa" atau α). Gugus karboksil memberikan

sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa.[1]

Gambar 1. Struktur molekul Asam amino

Lisin adalah merupakan asam amino penyusun protein yang dalam pelarut air bersifat basa, seperti

juga histidin. Lisina banyak terdapat pada makanan yang banyak mengandung protein, seperti daging,

keju, susu, ikan dan telur untuk protein hewani.[2]

Gambar 2. Struktur lisin

Serina merupakan asam amino penyusun protein yang umum ditemukan pada protein hewan. Protein mamalia hanya memiliki L-serin. Serina bukan merupakan asam amino esensial bagi manusia.[3]

Gambar 3. Struktur Serin

Fenillalanin adalah suatu asam amino penting dan banyak terdapat pada makanan, yang bersama-sama dengan asam amino tirosina dan triptofan merupakan kelompok asam amino aromatik yang memiliki cincin benzena.[4]

Gambar 4. Struktur Fenillalanin

Fenilalanina bersama-sama dengan taurin dan triptofan merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penghantar atau penyampai pesan pada sistem saraf otak. [4]

Kromatografi adalah metode memisahkan komponen campuran berdasarkan perbedaan afinitas

untuk dua bahan kimia tersebut, salah satu yang tidak bergerak ("fase diam") dan yang lainnya

bergerak ("fase gerak"). Fase gerak melintasi suatu lapisan fase diam, itu akan membawa dengan

komponen campuran. Komponen-komponen yang berinteraksi dengan baik dengan fase gerak tapi

buruk dengan fase diam akan melakukan bergerak dengan fase gerak, yang berinteraksi buruk dengan

fase gerak namun baik dengan fase diam tidak akan bergerak dengan cepat. Sebagai fase gerak akan

bergerak membawa komponen campuran pada tingkat yang berbeda. Ketika fase gerak dihentikan,

komponen yang berbeda akan melakukan perjalanan dengan jarak yang berbeda.[5]

Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar.Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium. [5,6]

Interaksi antara komponen campuran dan fase diam dan gerak dapat termasuk interaksi muatan

atau interaksi antara zat polar, termasuk ikatan hidrogen yang berinteraksi. Sistem TLC dapat diatur

dengan fase diam yang sangat polar dan sebuah pelarut yang nonpolar. Ketika campuran yang

mengandung zat dari berbagai polaritas ditambahkan ke fase gerak dan terbawa pada fase diam,

senyawa yang lebih polar dalam campuran tidak akan melakukan pergerakan dengan cepat. Zat kurang

polar dalam campuran akan bergerak lebih jauh pada waktu yang ditentukan. [6]

Fasa diam

Kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam padat dilapisi ke kaca, kertas, aluminium,

atau plastik keras. Sampel ditempatkan pada salah satu ujung lembar dilapisi. Ketika tepi lembaran

ditempatkan ke dalam gelas pelarut, pelarut bergerak naik di lembar TLC, seperti sumbu, mengambil

dan membawa komponen campuran itu. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam

untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour

dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. [6]

Beberapa jenis fasa diam yang umum digunakan dalam percobaan kromatografi lapis tipis ialah [6]:

1. Silka gel

Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan

variasi ukuran (diameter) 10-40μm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase

geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi

dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%.

Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran: Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan

pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan

pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu

penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak. Silika gel dengan pengikat dan indicator

flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila

diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timahkadmium

sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi

pada 254 ,ג nm)

2. Alumina

Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang beraktifitas tinggi.

Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan

alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan

bebasaan pada tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa pengikat

dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan kode G.H.P.F

3. Selulosa

Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya sama seperti mekanisme

pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih

pendek dari pada serat selulosa kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 μ. Serat lebih

pendek menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit (lebih kecil).

Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa

mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.

Fase gerak

Fase gerak yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Yang digunakan

sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut

organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organik ini sangat

penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling

sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat

polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh

fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar. Berikut adalah beberapa fase gerak yang umum

digunakan diurutkan bedasarkan kepolarannya : [6]

Gambar 5. Jenis fase gerak bedasarkan kepolaran

Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi

Cara mengamati bercak pada TLC dapat digolongkan menjadi dua : Pertama dengan cara

merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak itu dan Kedua tanpa merusakkan

komponen / senyawa. Cara pertama dengan menyemprotkan pereaksi penanda. Banyak pereaksi-

pereaksi yang digunakan dapat dilihat dalam literature dan dijual dipasaran (niaga). Contoh pereaksi

semprot yang umum untuk senyawa organik adalah asam sulfat dalam metanol, selanjutnya bercak

dipanaskan di dalam oven, sebaiknya digunakan oven yang ada jendela kacanya sehingga dapat diikuti

perubahan bercak selama pemanasan menjadi bercak warna hitam. Pada dasarnya adalah reaksi

oksidasi pada senyawa organik oleh asam sulfat.

Pereaksi lain adalah dengan disemprot dengan larutan lodium dan paling mudah adalah dengan

memasukkan plat kedalam bejana yang berisi uap lodium (kristal lodium diletakkan dalam bejana,

tidak merusak 75% senyawa). Contoh pereaksi semprot dan penggunaannya dapat dilihat pada

Gambar 2. Cara ke dua, yang tidak merusak komponen/ senyawa di bercak. Untuk senyawa berwarna

atau berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi) tidak ada masalah menggunakan silika tanpa

tambahan zat berpendar. Sedangkan untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah lampu UV

digunakan fase diam dengan tambahan zat berpendar.

`

Gambar 6. Jenis peraksi / penanda[6]

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah[7]  :

Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya. Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan

dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat

serapan dari penyerap. Perbedaan penyerapakan memberikan perbedaan yang besar terhadap

harga Rf  meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan

dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran

partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap. Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat

pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan teballapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan

aliran pelarut menjadi tak rata puladalam daerah yang kecil dari plat.

Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan

sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisantipis adalah sangat penting dan bila campuran

pelarut digunakan maka perbandingan yangdipakai harus betul-betul diperhatikan.

Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

Teknik percobaan.Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya

diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan

mendatar juga digunakan).

Jumlah cuplikan yang digunakan.Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan

memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak

kesetimbangan lainnya, hingga akanmengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf .

Suhu.Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk

mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan

atau perubahan-perubahan fase.

Kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu

mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer

dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran,akan terjadi

pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih

cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

TLC jarang digunakan oleh ahli biokimia, kecuali untuk melakukan analisis asam amino. 

Prinsip-prinsip pemisahan sama dalam semua jenis kromatografi: kromatografi gas (GC), kromatografi

cair kinerja tinggi (HPLC), dan kromatografi kolom. Metode ini sering digunakan tidak hanya untuk

komponen campuran yang terpisah tetapi juga untuk mengidentifikasi komponen yang terdapat di

campuran (berdasarkan perilaku perpisahan mereka dalam keadaan terkendali). Contohnya

penggunaannya adalah menemukan obat di sampel darah atau urine, menemukan racun, mendeteksi

percikan api dalam penyelidikan pembakaran, dll. Interaksi fase diam dan fase gerak dapat dalam

berbagai jenis, termasuk yang berdasarkan pada molekul. Lembaran TLC yang dilapisi dengan silika

gel yang sangat polar. Fase gerak yang digunakan terdiri dari etanol dan asam asetat dalam rasio

90:10. Fase gerak lebih nonpolar dari fase diam. Sistem ini akan digunakan untuk memisahkan asam

amino berdasarkan tingkat polaritas. [8]

VI. Prosedur Percobaan

ALAT DAN BAHAN

Bahan :

1% larutan asam amino: lisin, serin, dan fenilalanin

larutan asam amino yang tidak diketahui (s)

0,2% larutan ninhidrin dalam botol semprot

kromatografi pelarut: 90:10 ethanol / 1 M asam asetat

Pelat TLC (sekitar 5 cm x 10 cm)

Alat:

400 mL beaker

kertas saring (Whatman 1)

Pipet Kapiler untuk bercak solusi (titik leleh kapiler terlalu besar)

lampu UV Spectroline model ENF-280 C/FE dengan panjang gelombang 254 nm Hair dryer

lateks atau sarung tangan nitril

Prosedur Kerja[8]

1. Gunakan sarung tangan agar plat TLC tidak terhalangi oleh sidik jari.

2. Lembar TLC diambil dan dipegang di tepi lembarnya untuk menghindari menyentuh

permukaan pelat. Garis tipis sekitar 1,5-2 cm ditarik dari bawah pelat di sisi sempit dengan

pensil. Tandai 4 titik di garis yang dibuat. Ini akan menjadi tempat untuk melihat sampel asam

amino dipermukaan pelat. Tandai setiap titik sehingga dapat mengidentifikasi sampel yang

ditetesi ke pelat nanti. Pelat TLC akan terlihat seperti yang ditunjukkan Gambar 7.

3. Larutan asam amino diteteskan ke setiap titik dengan pipa kapiler. Tetesan harus kecil atau

sedikit semakin besar tidak membuat lebih baik. Metode ini sangat sensitif. Bintik-bintik besar

menyebabkan hasil yang tidak tepat. Biarkan pelat tersebut kering.

4. Tambahkan pelarut untuk bagian bawah gelas beker sehingga seluruh tepi bawah dari pelat

TLC akan berada dalam pelarut (sekitar 1 cm di bagian bawah). Pelarut dalam gelas tidak

dapat berada di garis awal pelat TLC.  Tempatkan selembar kertas saring sepanjang sisi tabung

dan basah dengan pelarut. Siapkan selembar bungkus plastik untuk menutupi bagian atas.

Gambar 7. Plat TLC yang telah ditandai

5. Pelat TLC ditaruh dalam gelas, sampel berada di sisi bawah. Tutup dengan bungkus plastik

atau cawan kaca. Biasanya pelarut dibiarkan bergerak pada pelat sampai telah melakukan

pergerakan 85% dari jalan ke atas pelat (dalam beberapa centimeter). 

6. Pelat TLC dilepaskan dengan hati-hati dan segera tarik garis tipis dengan pensil di depan

pelarut. Garis yang mendefinisikan seberapa jauh pelarut telah bergerak. Biarkan kromatogram

benar-benar kering.

7. Plat TLC diambil, semprot ringan, tapi merata, dengan larutan ninhidrin. Hati-hati untuk

menjaga penyemprotan dan menghindari menghirup atau mengenai ditangan . Biarkan kering,

dan panas dengan pengering rambut. Jauhkan jari pada sudut untuk mencegah pengering

rambut dari meniup pelat. Asam amino hadir dalam campuran akan muncul sebagai bintik-

bintik ungu atau oranye / coklat. Menggambar lingkaran sekitar tepi luar dari setiap

tempat. Tandai pusat masing-masing bercak dengan pensil.

8. Kromatogram akan terlihat seperti yang ditunjukkan di bawah. Bintik-bintik tidak akan di

sama.

9. Ukur jarak (cm) dari garis start ke atas baris pelarut untuk mendapatkan jarak yang ditempuh

oleh pelarut.

10. Ukur jarak (cm) dari garis start ke pusat setiap tempat asam amino.

11. Hitung nilai Rf untuk setiap nilai amino sesuai dengan persamaan :

R f =jarak yangditempuh senyawa(cm)jarak yangditempuh pelarut (cm)

(1)

Gambar 8. Kromatogram pada permukaan TLC yang telah ditandai

V. Pembahasan

Ukur jarak Rf `nilai untuk setiap asam amino serta sampel yang tidak diketahui. Mengidentifikasi

substansi (s) terdapat dalam yang sesuatu yang tidak diketahui. Lihat hasil di bawah ini:

Gambar 9. Plat TLC yang diukur jejak kromatogram

VI. Perhitungan

Lys : 5,687,51

=0,756 Phe : 3,277,51

=0,435

Ser : 4,617,51

=0,614 Unknown : 3,277,51

=0,435

Dalam contoh ini, jelas bahwa tidak diketahui hanya fenilalanin. 

DAFTAR PUSTAKA

1. http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_amino

2. http://id.wikipedia.org/wiki/Lisina

3. http://id.wikipedia.org/wiki/Serina

4. http://id.wikipedia.org/wiki/Fenilalanina

5. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/

kromatografi_lapis_tipis/

6. http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/24048/a877915a150aeace10a6a665fa3e728d

7. https://www.academia.edu/8315572/Pengertian_Kromatografi_Lapis_Tipis_KLT

8. http://facstaff.gpc.edu/~msakuta/chem1152L/lab10.pdf