latar belakang - rgmaisyah.files.wordpress.com · reagen : • medium dubos (0 ... validasi metode...

Latar Belakang

VAKSIN

PREVENTIF

KUALITAS & STABILITAS

JUMLAH BAKTERI HIDUP

Colony Forming Unit ( CFU)

1. Waktu pengujian

yang lama 2. Tergantung pada

medium pertumbuhan

>> waktu inkubasi hingga 5 pekan.

Metode Alternatif

Metode ATP-Bioluminesens

Belum ada laporan Validasi

metode Pengembangan & Validasi metode ATP

Metode ATP-Bioluminesens

Reaksi Enzimatik ( Sistem Luciferin-Luciferase) dengan ATP :

Luminometer :

SAMPEL

Vaksin BCG SSI

Danish strain 1331

1 vial >> 0.75mg BGC liofilisasi & 3.75mg

Na.glutamat

Low Viability Sample

Suhu 37˚C selama 28 hari

Intermediate Viability Sample

Suhu 2-8˚C selama 12-18 bulan.

High Viability Sample

Suhu 2-8˚C selama 1-3 bulan.

2. Reagen :

• Medium Dubos (0.045% Tween & 0.5% Bovine

Albumin) • Reagen ATP-SL ( rekonstitusi dengan 10 mL

aqua pro injectione) • Dapar Tris-asetat 0.1 M (dengan 2 mM EDTA,

pH 7.75) • ATP-Standar , 1 x 10-5 M. • Sauton SSI encer. • Apyrase

Larutan Kerja

Larutan Kerja Standar

METODE ANALISIS

1. Penetapan ATP dalam Vaksin BCG - Ekstraksi ATP, sampel tanpa inkubasi

- Ekstraksi ATP, sampel dengan pre-inkubasi 37˚C.

- Pengukuran ATP

2. Penetapan CFU

3. Korelasi antara ATP – CFU

4. Validasi metode dengan tahapan

Pre-inkubasi.

5. Analisis data

1. Penetapan ATP

Ekstraksi ATP

Tanpa Inkubasi

Dengan Pre-inkubasi

24 jam, 37˚C

Pengukuran ATP

1 vial Vaksin BCG + 400 µl sauton SSI dan 100 µl Apyrase. Didiamkan 10 menit. Ekstraksi ATP (tiap vial 3 x 100 µl suspensi BCG) dengan Buffer Tris-Asetat dengan

EDTA ( 3 x 500 µl ) yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 98-99°C. Campuran BCG-Buffer dijaga pada suhu 98-99°C selama 6 menit, ekstrak lalu didinginkan pada

suhu kamar.

1 vial vaksin BCG + 1.0 ml Media pertumbuhan mikroba ( Medium Dubos dengan Tween dan Bovine Albumin ), Nitrogen dialirkan selama 10-15 menit, vial ditutup. Inkubasi 24 jam suhu 37˚C sebelum ATP diekstraksi. Prosedur ekstraksi ATP, mengikuti prosedur

ekstraksi ATP tanpa inkubasi.

Pengukuran ATP

Ekstrak ATP ( 100 µg Suspensi BCG +

500 µl buffer)

100 µl reagen ATP

Diukur dengan Luminometer 1251

Blanko (100 µl

Sauton/Apyrase atau medium Dubos)

Suhu 25°C, signal 10 detik

( mV x 10 detik )

10/20µl Larutan ATP Standar

Konsentrasi standar 1.0-15

x 10-12 mol ATP

Reagen ATP

Output RLU (Relative Light Unit) >> ng ATP

2. Penetapan CFU

8 vial BCG, direkonstitusi dengan Sauton SSI hingga diperoleh konsentrasi 0.75mg BCG/ml.

3 seri pengenceran diinokulasikan pada Medium Lowenstein-Jansen, diinkubasi pada suhu 37˚C selama 5 pekan dan kemudian dihitung jumlah CFU.

www.themegallery.com

3. KORELASI ATP -CFU

Tujuan :

Melihat hubungan viabilitas sampel lyophilised BCG dengan berbagai level

berbeda hasil pengukuran dengan metode ATP dan CFU

Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.53 Untuk pengukuran dengan

metode ATP : overlapping antara viabilitas rendah dan tinggi

Sampel BCG tidak.di pre-inkubasi dalam

media pertumbuhan sebelum pengukuran

ATP. Samples (n = 43)

● : viabilitas rendah

▀ : viabilitas tinggi

3. KORELASI ATP -CFU

Sampel BCG di pre-inkubasi dalam media

pertumbuhan selama 24 jam sebelum

pengukuran ATP. Samples (n = 43)

● : viabilitas rendah

▲ : viabilitas sedang

▀ : viabilitas tinggi

Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.93

Metode pengukuran ATP dengan pre-inkubasi dalam media pertumbuhan

meningkatkan korelasi antara ATP-CFU secara signifikan

4. Validasi Metode dengan Tahapan Preinkubasi

1. Robustness

2. Linearitas dan Rentang

3. Akurasi

4. Presisi



Tujuan

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode dengan cara dibuat perubahan metode dengan kondisi-kondisi tertentu, apakah berbagai faktor tersebut berpengaruh terhadap respon yang dihasilkan.

Prosedur Desain Faktorial (Software statistik JMP 6.0) Menggunakan 16 vial Vaksin BCG dengan

Intermediate Viability Terdiri dari 8 faktor kondisi percobaan dengan

2 level

1. Robustness (Kekuatan)

Desain Percobaan Robustness


Faktor Level

A. Pre-Inkubasi

•Vial airing time before incubation •Incubation temperature •Incubation time •pH in Dubos medium

5 or 30 min 35 or 39 C 21 or 27 h pH 6.6 atau 7.0

B. Ekstraksi ATP

•Time to preheat extraction buffer •Extraction buffer temperature •Heat treatment time •Covering cuvettes during extraction

10 or 20 min 97 or 100 C 5 or 10 min With or without

Hasil Robustness


Untuk masing-masing faktor, metode menunjukkan robust di masing2 level percobaan α =0.05 , tidak ada perbedaan yang signifikan pada masing2 hasil pengukuran ATP di berbagai kondisi percobaan

2. Linearitas dan Rentang

Linearitas

Kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan.

Rentang

Menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.



Prosedur Linearitas

Linearitas

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG

Linearitas Standar ATP Dibuat Variasi Konsentrasi Standar ATP dengan rentang 1.0-25 x10-12 mol ATP per kuvet

Total konsentrasi BCG (bakteri hidup dan mati) dalam sampel dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan dan hanya konsentrasi ekstrak ATP yang dibuat bervariasi.

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG


500µl Buffer Tris-

EDTA

total100 µl suspensi

BCG

Untuk Vial Suspensi BCG dengan volume : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl Volume dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan

ATP standar dengan rentang konsentrasi 1.0-

15 x 10-12 mol ATP/kuvet

untuk mengkonversi respon BCG-ATP ke dalam

mol-ATP

Hasil Linearitas


1. Kurva Linearitas ATP standar 1.0-25 x10-

12 mol ATP -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99 (kurva tidak ditampilkan) 2. Kurva Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG dengan viabilitas yang berbeda pada konsentrasi BCG konstan -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99

Hasil Rentang

Kurva ATP standard dengan rentang konsentrasi 1.0-15 x 10-

12 mol ATP menghasilkan respon dibawah konsentrasi standar (pada vial dengan low viability dengan volume terkecil ) dan respon diatas konsentrasi standar pada vial dengan high viability dengan volume terbesar.

Rentang pengukuran adalah tidak kurang dari 1.0-15 x 10-12 mol ATP untuk 100 µl suspensi BCG atau setara dengan 10-150 x 10-

12 mol ATP per vial vaksin


3. AKURASI

Tujuan

Untuk mengukur ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.

Prosedur

1. Menggunakan 15 sampel baru yang di pre-inkubasi

2. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan data korelasi antara ATP dengan jumlah CFU

3. Dibuat kurva regresi linier dengan derajat kepercayaan 95%.

4. Data hasil 15 sampel baru kemudian diplotkan tehadap kurva korelasi yang telah ada.


Hasil Akurasi


Hasil Akurasi

Terdapat korelasi positif yang signifikan dengan nilai P < 0.0001, r = 0.934

Perhitungan hubungan antara metode ATP dan CFU : log (CFU) = -1.426 + 1.398 LOG (ATP) atau CFU = 0.037 ATP1.398


4 .Presisi

Definisi

Tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan rata-rata hasil pengujian berulang

Prosedur 1. Presisi dilakukan oleh 3 analis dalam 3 hari

2. Desain faktorial dilakukan untuk menguji repeatability dan intermediate precision dari sampel dengan low viability dan high viability.

3. Repeatability: pengujian dengan 2 sampel (2x8 vial), diukur koefisien variasinya (CV) untuk repeatability.

4. Intermediate precision: Data dari desain percobaan dianalisa, dihitung sesuai dengan perhitungan intermediate precision.


Hasil Presisi


Hasil Presisi

Low Viability

1. Repeatability : 5.5%

2. Intermediate Precision : 15%

High Viability

1. Repeatability : 5.1%

2. Intermediate Precision : 9.0%


Parameter dan Hasil Validasi

Hasil Syarat Akurasi >70%

Presisi -Repeatability -Intermediate Precision

5,1%-5,5% 9%-15%

Cfu/plate 30-300 <15% 10-30 <25% <10 <35%

Linearitas 99% r > 099 >95%

Robustness Statistik tidak berbeda signifikan

Kesimpulan

Metode ATP dengan pre-inkubasi memiliki tingkat kecepatan (rapid), kekuatan (robust), ketepatan (akurasi) dan keseksamaan (presisi) yang baik untuk mengetahui estimasi dari BCG viability.

Metode ATP telah sesuai untuk tujuan pengujian rutin quality control BCG.


latar belakang - rgmaisyah.files.wordpress.com · reagen : • medium dubos (0 ... validasi metode...

Documents