lapres 4 niar

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

1

LAPORAN RESMI PEMBUATAN WINE I. Tujuan Percobaan Mempelajari proses fermentasi glukosa menjadi etanol oleh yeast ( khamir ) II. Data Pengamatan II.1 Metode Turbidimetri t ( jam ) 0 12 Pengenceran 10.000x 10.000x Optical density 0,013 8,7x10-3 %T 97 98

II.2 Metode Counting Chamber beserta ciri ciri lainnya Berat botol kosong Berat botol + aquades Berat botol + larutan Kadar glukosa sebelum diencerkan Kadar glukosa setelah diencerkan Indeks bias sebelum diencerkan Indeks bias setelah diencerkan Suhu saat pengambilan 50 ml dari 500 ml pH saat pengambilan 50 ml dari 500 ml Berat ragi : 2,5 gram II.2.1 Pengamatan media ( 50 ml ditambahkan ragi ) Suhu : 32oC pH :4 : 999,9 gram : 1462,1 gram : 1510,5 gram : 2,4 : 17 : 1,3365 : 1,3965 : 36oC :4

Pengenceran 10.000x Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


2

RUN 1. 2. 3.

A 24 25 22

B 22 24 23

KOTAK C 23 24 23

D 23 23 24

E 22 22 25

TOTAL 114 118 117

JUMLAH SEL KOTAK 23 24 23 = 70

Jumlah sel ragi rata rata : 23 sel / kotak Jumlah sel ragi : 575 sel/mm2 : 57500 sel/mm3 : 575.105 sel/ml

Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 575.109 sel/ml sampel II.2.2 Pengamatan t=0 jam Suhu pH : 34oC :4

Berat botol + larutan : 1512,5 gram Berat botol + aquades : 1465,2 gram Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. A 15 14 15 B 14 14 15 KOTAK C 14 13 14 D 13 12 13 E 12 11 13 TOTAL 68 64 70 JUMLAH SEL KOTAK 14 13 14 = 41


Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 35.1010 sel/ml sampel II.2.3 Pengamatan t=12 jam Suhu pH Warna Rasa Bau : 30oC :3 : mulai agak putih keruh : asam : asam

Berat botol + larutan : 1517,5 gram Berat botol + aquades : 1473,4 gram Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


3

Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. A 9 8 9 B 8 7 10 KOTAK C 8 7 10 D 7 9 8 E 8 9 8 TOTAL 40 40 45 JUMLAH SEL KOTAK 8 8 9 = 25


Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 2.1011 sel/ml sampel II.2.4 Pengamatan t=24 jam Suhu pH Warna Rasa Bau : 30oC :4 : putih keruh : asam : asam

Berat botol + larutan : 1503,5 gram Berat botol + aquades : 1460 gram Kadar glukosa Indeks bias :1 : 1,334

Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. A 6 7 8 B 6 7 7 KOTAK C 8 8 6 D 7 8 6 E 7 6 8 TOTAL 34 36 35 JUMLAH SEL KOTAK 7 7 7 = 21

Jumlah sel ragi rata rata : 7 sel / kotak Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


4

Jumlah sel ragi : 175 sel/mm2 : 17500 sel/mm3 : 175.105 sel/ml Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 175.109 sel/ml sampel II.2.5 Pengamatan t=36 jam Suhu pH Warna Rasa Bau : 30,6oC :4 : putih keruh : asam : asam, seperti tape

Berat botol + larutan : 1515,5 gram Berat botol + aquades : 1462 gram Kadar glukosa Indeks bias Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. A 3 4 4 B 2 3 4 KOTAK C 2 3 3 D 3 2 2 E 3 2 3 TOTAL 13 14 16 JUMLAH SEL KOTAK 3 3 3 = 9 :2 : 1,336


Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 75.109 sel/ml sampel II.2.6 Pengamatan t=48 jam Suhu pH Warna Rasa Bau : 30,2oC :4 : putih keruh : asam : asam, seperti tape

Berat botol + larutan : 1508,5 gram Berat botol + aquades : 1463 gram Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


5

Kadar glukosa Indeks bias Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. A 3 2 3

:2 : 1,336

B 3 1 3

KOTAK C 2 1 2

D 1 3 2

E 1 2 1

TOTAL 10 9 11

JUMLAH SEL KOTAK 2 2 2 = 6


Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 5.1010 sel/ml sampel

II.2.7 Pengamatan saat di inkubator,t=2 jam (1400) Suhu pH : 33oC :4

Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. A 18 44 B 27 41 KOTAK C 25 30 D 19 50 E 24 43 TOTAL 113 208 JUMLAH SEL KOTAK 22,6 41,6 = 64,2

Jumlah sel ragi rata rata : 32,1 sel / kotak Jumlah sel ragi : 802,5 sel/mm2 : 8025 sel/mm3

Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 8025000 sel/ml sampel II.2.8 Pengamatan saat di inkubator,t=2,5 jam (14.30) Suhu : 33oC Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


6

pH Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. A 47 29

:4 KOTAK C 27 36 JUMLAH SEL KOTAK 32,2 29,4 = 61,6

B 33 31

D 23 24

E 31 27

TOTAL 161 147

Jumlah sel ragi rata rata : 30,8 sel / kotak Jumlah sel ragi : 770 sel/mm2 : 7700 sel/mm3

Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 7.700.000 sel/ml sampel

II.2.9 Pengamatan saat di inkubator,t=3 jam (1500) Suhu pH : 33,5oC :4

Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. A 31 34 B 37 28 KOTAK C 33 31 D 23 30 E 28 26 TOTAL 152 149 JUMLAH SEL KOTAK 30,4 29,8 = 60,2

Jumlah sel ragi rata rata : 30,1 sel / kotak Jumlah sel ragi : 752,5 sel/mm2 : 7525 sel/mm3

Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 7.525.000 sel/ml sampel II.2.10 Pengamatan saat di inkubator,t=3,5 jam (15.30) Suhu pH Pengenceran 10.000x RUN KOTAK Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS TOTAL JUMLAH SEL : 33,5oC :4


7

1. 2.

A 9 16

B 19 13

C 13 14

D 12 17

E 18 19

KOTAK 71 79 14,2 15,8 = 36,0

Jumlah sel ragi rata rata : 15 sel / kotak Jumlah sel ragi : 375 sel/mm2 : 3750 sel/mm3

Jadi, jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x : 3.750.000 sel/ml sampel III. Pembahasan Produksi secara fermantasi didasarkan pada pengubahan karbohidrat menjadi bahan organik yang lebih sederhana dengan bantuan enzim yang dihasilkan oleh khamir. Suatu bahan baku yang mengandung sukrosa mengalami proses fermentasi sebagai berikut: C12H12O11 + H2O -------> 2C6H12O6 Glukosa C6H12O6 ------> 2C2H5OH + 2CO2 Dari persamaan tersebut dapat diketahui bahwa fermentasi etanol berlangsung secara anaerob. Secara teoritis dari setiap molekul sukrosa akan diperoleh empat molekul etenol dan empat molekul karbon dioksida. Pada kenyataannya hasil ini tidak dapat dicapai karena terbentuk hasil samping penggunaan gula untuk pertumbuhan dan metabolisma khamir. Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari proses fermentasi glukosa menjadi etanol oleh yeast (khamir). Pada percobaan ini digunakan khamir Saccharomyces cereviseae dan sebagai media fermentasi adalah ekstrak buah anggur hijau. Hal pertama yang dilakukan adalah mencampurkan 100 ml ekstrak buah dengan 400 ml aquadest dalam beaker glass. Kemudian melakukan proses pasteurisasi yaitu memanaskan ekstrak buah yang telah diencerkan di dalam water bath pada suhu 80 oC selama 10 menit lalu didinginkan hingga suhu 30o

C. Pemanasan dan pendinginan yang dilakukan bertujuan untuk mematikan

mikroba yang terdapat pada larutan tersebut tanpa merusak struktur dari kandungan yang terdapat dalam ekstrak. Langkah kerja ini dilakukan sebanyak 2x,agar mikroba yang ada benar-benar mati. Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


8

Selanjutnnya 50 ml larutan tadi dimasukkan kedalam Erlenmeyer dan dicampur dengan 2,5g fermipan yang mengandung saccharomyces cereviseae (proses ini dalam in case) sebagai pembuatan starter. Sedangkan 450 ml yang lain disimpan. Tujuan pembuatan starter adalah agar Saccharomyces cereviseae mampu beradaptasi terhadap media tersebut, sebelum ditempatkan pada media sesungguhnya. Suhu dan pH dari starter tersebur diukur dan dari pengukuran suhu yang didapatkan adalah 36oC dengan pH adalah 4. setelah itu, menginkubasi starter pada inkubator dengan suhu 37-38C selama 4 jam. Tujuan dari penginkubasian adalah untuk mempercepat fase adaptasi dan fase logaritmik. Dengan diinkubasi, Saccharomyces cereviseae dapat mencapai fase logaritmik sehingga pertumbuhan meningkat dan proses fermentasi akan berlangsung lebih cepat yang menyebabkan kadar etanol yang dihasilkan juga semakin besar. Saat di inkubator tersebut, setiap jam dapat diukur suhu, pH, dan jumlah sel rata ratanya Setelah diinkubasikan selama 4 jam maka starter dimasukkan di dalam sisa campuran ekstrak anggur hijau 450 ml, lalu memindahkannya ke dalam botol yang sudah disiapkan dan sebelumnya telah diukur beratnya. Kemudian menutup botol dengan proof yang diberi lubang untuk tempat selang sebagai jalan keluarnya gas CO2 yang dihubungkan dengan air kapur. Jika terbentuk CO2, maka dalam Erlenmeyer yang berisikan air kapur akan timbul gelembung gas. Jika air kapur bereaksi dengan CO2 maka terbentuk endapan CaCO3 dan warna air kapur menjadi keruh. CaO (kapur tohot) jika berada dalam air akan menjadi Ca(OH)2. Lalu Ca(OH)2 bereaksi dengan CO2 membentuk CaCO3 +H2O sesuai reaksi: Ca(OH)2 + CO2 ----------> CaCO3 + H2O Kemudian di sekeliling tepi botol dengan proof, diberi malam agar tidak ada udara yang masuk karena dalam proses fermentasi, pelakunya adalah mikroorganisme anaerob. Langkah selanjutnya yang dilakukan adalah melakukan pengamatan. Pengamatan dilakukan pada t=0 jam, t=12 jam, t=24 jam, t=36 jam, dan t=48 jam Hasil pengamatan pada t=0 jam, didapatkan suhu 34oC dan pHnya 4. Sedangkan berat botol fermentor ( yang berisi larutan ) adalah 1512,5 gram Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


9

dan berat botol pembanding ( yang berisi aquades ) adalah 1465,2 gram, %Tnya adalah 97, dan jumlah bakterinya sebanyak 35x1010 sel/ml sampel. Setelah difermentasikan selama 12 jam, suhu yang didapatkan adalah 30oC dengan pH 3. Berat botol fermentor yang didapatkan adalah 1517,5 gram. Berat botol pembandingnya adalah 1473,4 gram. Sedangkan jumlah bakteri yang didapatkan sebanyak 2x1011 sel/ml sampel. Setelah difermentasikan selama 24 jam, suhu yang didapatkan adalah 30oC dengan pH 3. Didapatkan pula indeks bias sebesar 1,334 dan kadar glukosanya adalah 1. Berat botol fermentornya adalah 1503,5 gram. Berat botol pembandingnya adalah 1460 gram. Sedangkan jumlah bakteri yang didapatkan sebanyak175x109 sel/ml sampel. Setelah difermentasikan selama 36 jam, suhu yang diperoleh adalah 30,6oC dengan pH 4. Didapatkan pula indeks biasnya 1,336 dan kadar glukosanya adalah 2. Berat botol fermentornya adalah 1515,5 gram. Berat botol pembandingnya adalah 1462 gram. Lalu jumlah bakteri yang didapatkan adalah 75x109 sel/ml sampel. Setelah difermentasikan selama 48 jam, suhu yang diperoleh adalah 30,2oC dengan pH 4. Didapatkan pula indeks biasnya 1,336 dan kadar glukosanya adalah 2. Berat botol fermentornya adalah 1508,5 gram. Berat botol pembandingnya adalah 1463 gram. Sedangkan jumlah bakteri yang didapatkan sebanyak 5x1010 sel/ml sampel. Berdasarkan perhitungan melalui cara brix percent, didapatkan kadar etanol sebesar 0,116 %. Dan berdasarkan perhitungan menggunakan massa CO2 didapatkan kadar etanol sebesar 0,28 %. Dari data-data yang diperoleh dibuat grafik,sebagai berikut : Grafik 1. Hubungan antara waktu (t=0 jam sampai t=48 jam) dengan jumlah sel

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


10

Grafik 2. Hubungan antara waktu (saat larutan starter di inkubator ) dengan jumlah sel



11

IV. Jawaban Pertanyaan 1. Perubahan glukosa menjadi etanol oleh yeast sebenarnya dilakukan oleh aktifitas enzim-enzim yang terdapat di dalam yeast. Dapatkan skema siklus glikolisis dari literatur yang menjelaskan hal ini. Sebutkan dengan lengkap literatur yang saudara pakai (Judul, pengarang, penerbit, tahun)! Glukose AMP, ADP ----- + ----> ATP, Sitrat ------ - ----> Glukose-6-fosfat ATP ADP

Fruktose-6-fosfat ATP ADP Fruktose-1,6-difosfat

Dihidroksiaseton Fosfat

Gliseraldehide-3-fosfat 2NAD 2NADH2 Asam 1,3-difosfogliserat 2ADP 2ATP

Asam 3-fosfogliserat

Asam 2-fosfogliserat Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


12

H2O Asam fosfoenolpiruvat 2ADP AMP --- + ---------> 2ATP Asam piruvat 2. Dari siklus glikolisis, sebutkan enzim apa saja yang berperan di dalam fermentasi glukosa menjadi etanol! Enzim-enzim pada kelas oksido-reduktase, dan dehidrogenase 3. Produk apa saja yang mungkin terbentuk selama proses fermentasi glukosa menjadi etanol? Gas CO2 dan energi 4. Jelaskan fungsi dari starter! Apa beda proses yang ada pada pembuatan starter dibanding dengan proses fermentasi? Apa yang terjadi jika tidak digunakan starter? Tujuan pembuatan starter adalah agar bakteri yang digunakan mampu beradaptasi terhadap media tersebut, sebelum ditempatkan pada media sesungguhnya. Perbedaannya adalah pada proses penginkubasian pada starter yang dimaksudkan agar mempercepat fase adaptasi dan logaritmik. Jika tidak menggunakan starter yang dapat terjadi adalah lebih lamanya proses fermentasi dan sulitnya mikroorganisme untuk melekukan fase adaptasi. 5. Mengapa pH pada proses fermentasi sangat penting? Jika pH selama proses fermentasi dibiarkan (tidak dikontrol), bagaimana kecenderungan perubahannya menurut siklus glikolisis yang ada ( apakah cenderung naik atau turun)? Bandingkan dengan hasil yang saudara dapatkan! 6. Setiap proses yang melibatkan mikroorganisme memiliki pH optimum dan temperatur (T) optimum. Jelaskan mengapa pH atau T di bawah atau di atas optimum ini berakibat buruk pada proses fermentasi? Setiap bakteri mempunyai habitat sendiri-sendiri dalam kelangsungan hidupnya. Dalam habitatnya dipengaruhi oleh suhu, pH, nutrien, dll. Diantaranya adalah suhu dan pH yang tentunya pada sertiap mikroorganisme mempunyai rentang pH dan suhu yang cocok bagi Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


13

hidupnya. Bakteri tersebut bila digunakan dalam fermentasi pun harus hidup pada suhu dan pH yang cocok untuknya juga. Jadi pH dan suhu harus diperhatikan dalam proses fermentasi, tidak boleh terlalu rendah ataupun tinggi, tetapi sesuai dengan kharakteristik mikroorganisme tersebut. 7. Dari persamaan reaksi fermentasi glukosa menjadi etanol, jelaskan mengapa pengurangan berat yang terjadi pada media fermentasi dapat digunakan untuk menghitung kadar etanol yang terbentuk? Dari pengurangan berat tersebut dapat diketahui berat gas CO2 yang dihasilkan, sehingga mol CO2 pun dapat dicari dangan cara membagi massa CO2 dengan Berat Molekulnya. Kemudian 2 mol CO2 ekivalen dengan 2 mol C2H5OH (etanol), menurut reaksi: C6H12O6 ------> 2C2H5OH + 2CO2 Maka dapat diketahui juga mol etanol. Kemudian didapatkan massa etanol dengan mengalikan mol etanol dengan Berat Molekulnya. Lalu untuk mendapatkan kadar etanol dengan cara membandingkan massa atanol dengan massa fermentor pada t = 48 jam dan mengalikannya dengan seratus persen. 8. Metode penentuan kadar etanol di atas adalah metode pendekatan. Jelaskan dari siklus glikolisis, mengapa metode ini memiliki kesalahan? Berikan alternatif metode lain yang mungkin mengeliminasi kesalahn ini. Jelaskan mengapa alternatif yang saudara berikan dapat mengeliminasi terjadinya kesalahan? Menurut glikolisis, proses dari glukosa menjadi asam piruvat, melewati beberapa proses dan senyawa yang lebih banyak daripada proses yang dipakai dalam metode pendekatan. Maka dari itu mungkin yang dapat menyebabkan adanya kesalahan adalah kurang kompleksnya reaksi yang dilalui untuk mendapatkan harga mol etanol. Alternatif yang dapat diberikan adalah memakai reaksi yang beruntut seperti pada proses glikolisis untuk mengeliminasi kesalahan yang ada. 9. Bandingkan kedua kurva pertumbuhan yang saudara dapatkan (pada 2 dan 4). tentukan perbedaannya!



14

Dari hasil percobaan didapatkan kurva pertumbuhan mikroorganisme yang pada awalnya mengalami kenaikan dan akhirnya mengalami penurunan. Sedangkan kurva yang kedua pun juga sama dengan kurva yang pertama. Bandingkan kurva pertumbuhan sel, buatlah konsep penentuan : i. 1. Double timing (g) Sel prokariotik membelah secara biner: 1 2 4 8 16 32 64 n. 2. Pembelahan sel dinyatakan sebagai fungsi 2: 21 22 23 24 25 26 2n 3. Apabila jumlah sel setelah waktu tertentu = Nt, maka Nt = 1 x 2n jumlah total sel tergantung pada jumlah generasi (pembelahan) yang terjadi didalam waktu tertentu. 4. Apabila jumlah sel awal = N0, jumlah sel dalam populasi dapat dinyatakan sebagai berikut : Nt = N0 x 2n 5. Jumlah total sel dalam populasi = Nt yang merupakan fungsi dari 2, dapat lebih mudah diplot dengan nilai logaritmiknya, sehingga diperoleh garis eksponensial. Didalam praktek digunakan angka dasar 10 log Nt = log N0 + n log2 n = log Nt - log N0 log 2 Kecepatan pembelahan sel : k n/t k = log Nt - log N0 log 2 (t) k = log Nt - log N0 0.301 t Kecepatan tumbuh suatu bakteri biasanya dinyatakan sebagai jumlah generasi per satuan waktu atau generasi per jam. 6. Waktu generasi (g) adalah waktu yang diperlukan sel didalam suatu populasi untuk membelah diri. Pada umumnya berlangsung konstan dan relatif singkat (menit). K = log Nt - log N0 = log (2N0) - log N0 = 0.6931 0.301 g0.301 x g g g = t/n = 1/k

0.



15

ii.

Growth rate constant maximum ( max) Fase peningkatan kecepatan pertumbuhan, sel tumbuh konstan dan mencapai kecepatan maksimum. Fase ini adalah fase eksponensial. a. Persamaan untuk fase eksponensial adalah Dimana x : konsentrasi biomasa mikrobia t : waktu (jam) : kecepatan pertumbuhan spesifik (perjam = jam-1) dx/dt = x

b. Dalam integrasi maka : c. Bila digunakan log normal :

xt = xo e

t

ln xt = ln xo + t = (ln xt - ln xo) 0.301.t

Selama fase eksponensial akan dicapai kecepatan pertumbuhan maksimum (max). kecepatan pertumbuhan maksimum sangat spesifik untuk masing-masing jenis mikrobia. Misal aspegillus nidulans mempunyai max = 0,36; Methylomonas methyanolytica max = 0,56 = (ln xt - ln xo) 0.301.t V. Kesimpulan Dari hasil pengamatan didapatkan Kadar etanol sebesar 0,116% berdasarkan perhitungan brix percent dan berdasarkan perhitungan massa CO2 adalah 0,28%, serta didapatkan hasil sampingan berupa CO2 yang mengeruhkan air kapur.



16

Daftar Pustaka Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 2008.Surabaya:Teknik Kimia ITS Hendriani,Nuniek dan Musfil.2001. Diktat Kuliah Mikrobiologi Industri. Surabaya:ITS Pelzcar,Michael J dan E.C.S.Chan.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jakarta:UI http://bioindustri.blogspot.com/2008/09/fermentasi-wine.html



17

APPENDIKS Menentukan kadar alkohol 1. Berdasarkan cara brix percent Brix sebelum diencerkan = 2,4% Massa isi fermentor = (1510,5-2,5)gram = 1508 gram Volume air = 400 ml Massa air = 400 gram Massa murni = (1508-400) gram = 1108 gram 2,4% = 2,4 gram sukrosa 100 gram larutan Massa sukrosa = 2,4 ( 1108 ) 100 = 26,592 gram **48 jam Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS


18

% Brix = 1,336 % Massa isi fermentor = (1508,5-5) gram = 1503,5 gram Gram sukrosa = 1,336x1503,5 100 = 20,086 gram Yang terkonversi menjadi ethanol = ( 26,592 20,086 ) gram = 6,506 gr Mol C12H22O11 = gram/Mr = 6,506/342 = 0,019 gram C12H22O11 + H2O 0,019 mol C6H12O6 0,019 mol C6H12O6 + fruktosa 0,019 mol 2C2H5OH + 2CO2 0,038 mol 0,038 mol

Massa etanol = mol etanol x Mr = 0,038 x 46 = 1,75 gram % etanol = (1,75/1503,5).100% = 0,116 % 2. Berdasarkan cara massa CO2 Massa CO2 = berat fermentor t=0 jam berat fermentor t=48 jam = ( 1512,5-1508,5 ) gram = 4 gram Mol CO2 = massa CO2/Mr.CO2 = 4/44 = 1/11 Mol CO2 = mol etanol = 1/11 Massa etanol = mol etanol x Mr etanol = 1/11 x 46 = 4,18 gram % etanol = ( massa etanol / massa fermentor t=48 jam ) x 100% = ( 4,18/1508,5 ) x 100% = 0,28%


lapres 4 niar

Documents