LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN BAKTERI

D

I

S

U

S

U

N

OLEH:

NAMA : DINY ASYIFAH

NIM : 08111006048

KELOMPOK : VB

LABORATORIUM BIOLOGI FARMASIPROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS SRIWIJAYA

INDRALAYA

2013

PRAKTIKUM III

PEWARNAAN BAKTERI

I. Tujuan Praktikum

Memahami dan mengetahui macam-macam pewarnaan dan

melakukan pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan gram negatif

dan preparat tetesan bergantung.

II. Prinsip Percobaan

Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna

dan dengan ion protoplasma sel.

III. Dasar Teori

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling

banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu

jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri

mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena

sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang

digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan

pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel

bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana

ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan

sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna

dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna

yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air

furksin.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk

mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam

gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan

(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan

morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin

atau tinta cina.

2.  Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan

gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri

Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu

pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat

warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram

negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)

ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif

menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding

sel mereka.

a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram

positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan

alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat

warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini

akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri

gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi

antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan

struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar

yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol,

sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.

Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan

yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding

sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel

tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu

dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak

ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-

4%)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap

penisilin

Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)

Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif kompleks

Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap perlakuan fisik

Lebih tahan Kurang tahan

(Manurung, 2010).Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh –

Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna

tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan

penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan

permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung

pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri

menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh

zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%).

Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan

dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram.

Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan

tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat

terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah

dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.

Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan

biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada

seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar

asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian

dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci

dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3%

(hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit

kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan

dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh

permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir

(Karuniawati, 2005).

4.  Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur

khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh

pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium,

Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora

dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif,

sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan

fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan

dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel

vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di

bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan

transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,

endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a.  Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan

tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul,

karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga

memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

b.  Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias

menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c.  Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang

tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d.  Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk

DNA (Rudi, 2010).

IV. Alat dan Bahan

Alat:

Jarum ose

Kaca objek

Mikroskop

Tusuk gigi

Bahan:

Kultur bakteri

NaCl faali

Larutan biru metilen

Kristal violet

Larutan lugol

Etanol

Tinta cina

Kotoran gigi

V. Prosedur kerja

1. Pembuatan preparat ulas

Pada medium cair

Inokulum bakteri yang telah dikembangkan > dimasukkan ke

tabung reaksi > beri larutan NaCl > tetesi pada kaca objek >

keringkan preparat.

Pada medium Padat

Biakan bakteri diletakkan diatas kaca objek > teteskan 2 tetes NaCl

> keringkan preparat

2. Pewarnaan sederhana

Preparat ulas > beri larutan metilen blue > biarkan 30 detik > cuci

dan keringkan di atas kertas saring > amati dibawah mikroskop

100x.

3. Pewarnaci dengan gram

Preparat ulas > fiksasi > beri larutan kristal violet 1 menit > cuci

dengan air > beri larutan lugol > Cuci dengan alkohol > keringkan

> amati dbawah mikroskop.

4. Pewarnaan negatif

2 kaca objek > satu kaca objek ditetesi tinta cina > ambil kotoran gigi

dgn tusuk gigi > campur dgn tinta di atas objek > gesekan kaca objek

pada campuran > biarkan preparat mengering di udara > amati dibawah

mikroskop.

VI. Data Hasil Pengamatan

E. coli S. thypiiKotoran

gigi

P. sederhana p. gram p. sederhana p. gram p. negatif

Medium

Cair

(-) (-) (+) (-)

Medium

Padat

(-) (-) (-) (-)

Kotoran

gigi

(+)

VII. Pembahasan

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah

satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion

bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk

membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan

memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai

dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan

yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat

warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,

maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen

blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada

umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam

umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian

sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-

bagian inti sel (Rudi, 2010).

Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi,

peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat

warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu

dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan

salah satu pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa

sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti

sel bakteri.

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif

akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan

alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,

suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,

yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau

merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe

bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi,

2010).

1. Escherichia coli

    

Gambar  E. coli dengan perbesaran 1000 x

Klasifikasi ilmiah

   Kingdom : Bakteria

Filum   : Proteobacteria

Kelas   : Gamma Proteobacteria

Order   : Enterobacteriales

Famili  : Enterobacteriaceae

Genus   : Escherichia

Spesies : E.  coli

Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada

air WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri

tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang

berarti bahwa bakteri ini bersifat gram negatif.

Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang

termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.

coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu

sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan

tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang

menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik

uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis.

Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah

di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada

feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E.

coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa

digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang

diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan

yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008).

2. S. thypii

Berdasarkan pewarnaan gram bakteri, Salmonella typhi adalag

bakteri gram negatif. bisa berada dalam air, es, debu, sampah kering

yang bila organisme ini masuk ke dalam vehicle yang cocok (daging,

kerang dan sebagainya) akan berkembang biak mencapai dosis infekti.

Dimensi Bakteri berbentuk batang, tidak berspora dan tidak

bersimpai tetapi mempunyai flagel feritrik (fimbrae), pada pewarnaan

gram bersifat gram negatif, ukuran 2- 4 mikrometer x 0.5-0.8

mikrometer dan bergerak.

Adapun bakteri salmonella dapat diklasifikasikan sebagai berikut :

      Kelas               :Psilopsida.

      Ordo                :Psilotales.

      Family             :Psilotaceae.

      Genus              :Salmonella.

      Species            :salmonella typhi.

VIII. Kesimpulan

1. Pada pewarnaan gram bakteri ini pewarnaan menggunakan metode

pewarnan sederhana yang menggunakan larutan metilen blue sebagai

pewarna utama, pewarnaan gram yang menggunakan larutan kristal

violet sebagai pewarna uutama dan dicuci dengan alkohol, serta

pewarnaan negatif menggunakan kotoran gigi dengan menggunakan

tinta cina.

2. E.coli dan S.thypii merupakan bakteri gram negatif karena saat dibilas

dengan air maupun alkohol pewarnaan menjadi hilang, itu artinya

bakteri e.coli dan s.thypii memiliki komposisi dinding sel yang

sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat

pewarnaan kurang mempertahankan zat warna.

3. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan

Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal

atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak

sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini

berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok

besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah

utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:

a.  Pembuatan olesan bakteri

b.  Fiksasi

c.  Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

Daftar Pustaka

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7 No. 1.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November 2010.