laporan praktikum biologi sel molekuler

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

OLEH

NAMA : AULIDYA NURUL HABIBAH

NIM : P2BA009012

KEMENTRIAN PENDIDIKAN NASIONALUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PROGRAM MAGISTER BIOLOGIPURWOKERTO

2010

DAFTAR ISI

ACARA 1. ISOLASI DNA PLASMID

ACARA 2. RESTRIKSI DNA PLASMID

ACARA 3. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

ACARA 4. TRANSFORMASI E. coli JM 109

PRAKATA

Puji syukur ke hadirat Alloh SWT, sehingga penulis dapat menyusun laporan ini.

laporan ini merupakan hasil praktikum tentang teknologi dalam biologi molekuler. Penulis

dalam praktikum dan pembelajaran mata kuliah Biologi Sel Molekuler dibimbing oleh Dr.

Hendro Pramono, M.S. dan Ir. Alice Yuniaty, M.Sc., Ph.D. Adapun informasi ilmiah yang

mendukung penyusunan laporan, dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang

berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan

hal tersebut. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada para asisten praktikum yang

telah memberi pengarahan selama praktikum.

Akhirnya penulis berharap semoga laporan ini bermanfaat dalam ilmu pengetahuan,

khususnya di bidang biologi molekuler. Amin.

Purwokerto, Februari 2010

Penulis

ACARA I.

ISOLASI DNA PLASMID

I. PENDAHULUAN

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom

yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah

misalnya yeast. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid

biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host,

sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa

gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya

akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai

enzim. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga

region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu : a replication origin, marker yang

memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu

disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al.). Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid

pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri,

tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19

2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

3. Ampisilin

4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

6. Tabung mikrosentrifuga

7. Sarung tangan

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Lemari pendingin

10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen,

USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair

dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu

37oC selama 16 jam (semalam).

2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam

tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700

x g selama 5 menit.

4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.

5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik

sebanyak 4-6 kali.

6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.

7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama

sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.

8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm

(17,900 x g) selama 10 menit.

9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang

dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan

13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit.

10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali

ke dalam tabung mikrosentrifuga.

11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan

13000 rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column

ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan

13000 rpm selama satu menit.

13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang

untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah

dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm

selama satu menit (elusi pertama).

15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan

ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column

disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

II. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan cara isolasi DNA plasmid pUC19 yang terdapat

di dalam E. coli JM 109. Isolasi tersebut dilakukan berdasarkan kit dari Qiagen (USA), yaitu

QIAprep Spin Miniprep Kit. Hasil yang diperoleh dapat diketahui dengan cara elektroforesis

gel agarosa. Adapun hasil dari elektroforesis gel agarosa adalah sebagai berikut :

Gambar 2. 1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : tanda anak panah menunjukkan fragmen DNA plasmid yang diisolasi dari E. coli JM 109.

Berdasarkan hasil di atas, dapat diketahui bahwa pita (fragmen) DNA plasmid yang

diisolasi dari E. coli menunjukkan pita yang jelas untuk urutan terakhir dan kurang jelas

untuk urutan sebelumnya. Fragmen (pita) yang kurang jelas tersebut terjadi karena adanya

penggunaan komposisi larutan yang tidak sesuai. Penggunaan larutan yang tidak sesuai

tersebut terjadi pada saat penambahan buffer P1 sebanyak 2 x lipat dari ketentuan kit.

Penambahan buffer P1 sesuai kit adalah 250 µl sedangkan pada praktikum, ditambahkan

buffer P1 sebanyak 500 µl. Setelah penambahan buffer P1, tahap selanjutnya adalah

penambahan buffer P2. Penambahan kedua buffer tersebut bertujuan untuk melisiskan sel.

Sel yang lisis ditandai dengan berubahnya warna suspensi menjadi biru. Setelah penambahan

buffer P1 dan P2, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer N3 yang berfungsi sebagai

penetral. Menurut kit yang digunakan, penambahan buffer N3 adalah 350 µl, namun pada

kelompok dengan hasil pita kurang jelas, buffer N3 ditambahkan sebanyak 100 µl

dikarenakan tidak cukupnya tabung yang digunakan untuk menampung larutan lebih banyak.

Secara umum, isolasi DNA plasmid menghasilkan DNA plasmid yang diinginkan.

Jumlah pasangan basa DNA plasmid dapat diketahui melalui perhitungan dengan Excel, yang

menghasilkan tabel berikut ini :

Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi

bp marker

jarak marker log 10bp

unknown distance m*distance y value unknown bp

No. Sumuran

23130 13 4,364176 34 -1,054 3,69 4897,788194 2

9416 25 3,973866 33 -1,023 3,721 5260,172664 3

6557 30 3,816705 32 -0,992 3,752 5649,369748 4

4361 40 3,639586 32 -0,992 3,752 5649,369748 5

39 -1,209 3,535 3427,677865 6

30 -0,93 3,814 6516,283941 7

33 -1,023 3,721 5260,172664 8

41 -1,271 3,473 2971,666032 9

41 -1,271 3,473 2971,666032 10

42 -1,302 3,442 2766,941645 11

Keterangan : DNA plasmid hasil isolasi terdapat pada sumuran no. 10 dan 11.

Jumlah pasangan basa DNA plasmid dari hasil isolasi DNA sesuai tabel di atas adalah

2.971,67 bp untuk sumuran no.10 yang menghasilkan pita kurang jelas dan 2766,94 bp untuk

sumuran no. 11 yang menghasilkan pita jelas. Dibandingkan dengan fragmen (pita) yang lain

yang merupakan DNA plasmid yang direstriksi, pita DNA plasmid hasil isolasi memiliki

jarak yang paling jauh dari sumuran. Adapun sumuran no. 9 dengan hasil sama dengan

sumuran no. 10 adalah pita dari plasmid pUC19. Berdasarkan uraian tersebut maka dapat

diketahui bahwa salah satu penentu jarak pita dari sumuran adalah konformasi DNA. DNA

dengan konformasi bulat akan berlari lebih cepat dibandingkan DNA linier pada saat running

elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa yang dilakukan dalam praktikum

bertujuan untuk mengetahui hasil isolasi DNA plasmid. Berdasarkan hasil di atas, maka dapat

dinyatakan bahwa isolasi DNA plasmid berhasil untuk DNA plasmid yang di running dengan

sumuran no. 11. Isolasi DNA plasmid yang dilakukan menggunakan prosedur sesuai dengan

QIAprep Spin Miniprep Kit. Kit tersebut diproduksi oleh Qiagen dan terdapat kit prosedur

isolasi DNA plasmid yang lain (Brolle et al.,1997) , namun pada dasarnya tahapan isolasi

DNA plasmid memiliki langkah – langkah sebagai berikut : inokulasi sel bakteri yang

mengandung plasmid, inkubasi dalam shaker inkubator, pemanenan, penambahan buffer yang

mengandung enzim pemecah (lisozim) dan dilanjutkan dengan pemanenan plasmid,. Tahapan

pemanenan plasmid berdasarkan QIAprep Spin Miniprep Kit adalah : penyaringan sel yang

telah lisis ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan Qiaprep spin column,

penambahan buffer PB untuk mengikat plasmid pada spin column (buffer ini mengandung

etanol yang berfungsi sebagai pencuci), sentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit, cairan

di bagian bawah dibuang, sentrifugasi kembali, pemindahan kolom ke dalam tabung,

penambahan Elution Buffer (EB) untuk melewatkan plasmid dari kolom menuju tabung,

sentrifugasi pada 13000 rpm selama 1 menit. Komponen yang tertampung pada tabung inilah

yang merupakan DNA plasmid.

III. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA plasmid dapat

dilakukan menggunakan kit yang telah tersedia, pada praktikum digunakan QIAprep Spin

Miniprep Kit. Jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi dapat diketahui dengan

elektroforesis gel agarosa.

B. Saran

Isolasi DNA yang dilakukan untuk praktikum yang akan datang sebaiknya mewakili

DNA dengan konformasi linier dan DNA sirkuler sehingga dapat dibandingkan melalui

elektroforesis gel agarosa.

DAFTAR REFERENSI

Brolle, D. F., T. Henzler, S. Stefani, A. Weissenborn, D. Zell, and W. Wohlleben. 1997. Microbiology–Biotechnology, University of Tübingen, Germany

Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. Molecular Cell Biology fifth Edition.

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

25 ml LB

E.coli transforman

pUC19

Inkubasi 370C, shaker 150 rpm, 16

jam

@ 3 ml

Sp dibuan

g + 1 ml STEresuspensi

Sentrifugasi

5000 rpm, 5'

1

Sp dibuan

g

+ 250 µl Buffer P1Resuspensi (vortex, bolak

balik+ 250 µl Buffer P2

Bolak-balik sebentar

Warna mjd BIRU

+ 350 µl Buffer N3Bolak-balik sebentar

Warna BIRU

hilang

Sentrifugasi13.000 rpm, 1'

Sp dipinda

h

Cairan dibuan

g

Sentrifugasi5.700xg (5000 rpm),

5'

+ 500 µl Buffer PB

+ 750 µl Buffer PE



Cairan dibuan

gg


Cairan dibuan

g


Kolom pindah

+ 50 µl Buffer EB


DNA plasmid

Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

ACARA II.

RESTRIKSI DNA PLASMID

I. PENDAHULUAN

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan

sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi

lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam

teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA

rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang

memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom.

Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal

dari beberapa bakteri. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong

masing-masing strand DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen

DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pas-

angan basa palindrom. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang

kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen

DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Sisi pengenalan enzim restriksi

tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA, misalnya BamHI yang diperoleh dari

Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan

−G−G−A−T−C−C− ¿−C−C−T−A−G−G

¿ yang akan memotong pada basa G nomor

2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al.), AGCT merupakan sisi pengenalan AluI,

GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA

di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended), namun biasanya enzim restriksi akan

memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky

ended). Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi

DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal, yaitu : ukuran fragmen, blunt-ended atau

sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap metilasi, kompatibiliti terhadap kondisi reaksi.

Enzim restriksi dengan sekuens pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak

potongan fragmen DNA. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt

ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended.

Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga

dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola

tertentu. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua

enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim,

2007).

Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air, DNA, buffer dan enzim.

Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Volume di bawah 10 µL tidak

dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan

pipeting. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim,

2007).

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19

2. Enzim restriski (PstI)



5. Sarung tangan


7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

8. termometer

9. Lemari pendingin (Frezeer)

10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA

genom, yaitu enzim PstI.

2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA

dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan

dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA

dan PstI

3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan

hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan

komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan

PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.

4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2

detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah

tersuspensi.

5. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C

selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).

6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit

menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.

7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer.


Restriksi DNA plasmid dilakukan menggunakan beberapa enzim restriksi yaitu :

HindIII, EcoRI, PstI. Hasil dari pemotongan DNA plasmid tersebut dapat dilihat melalui

elektroforesis gel agarosa. Adapun hasil dari elektroforesis gel agarosa adalah sebagai

berikut:

Gambar 2.1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : nomor menunjukkan nomor sumuran


direstriksi (ditunjukkan oleh anak panah) menghasilkan pita-pita yang jelas, kecuali sumuran

no. 6. Hal ini terjadi kemungkinan karena pita DNA pada sumuran no. 6 belum terpotong

dengan baik sebelum di running dengan eletroforesis gel agarosa. Sumuran no. 1

2 3 4 5

6 78

menghasilkan beberapa pita karena sumuran ini merupakan marker yang merupakan DNA λ

dengan HindIII.

Jumlah pasangan basa DNA plasmid yang telah direstriksi dapat diketahui melalui

perhitungan dengan Excel, yang menghasilkan tabel berikut ini :

Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi

bp marker

jarak marke

r log 10bpunknown distance m*distance y value unknown bp

No. Sumuran/ enzim restriksi

23130 13 4,364176 34 -1,054 3,69 4897,788194 2/HindIII

9416 25 3,973866 33 -1,023 3,721 5260,172664 3/EcoRI

6557 30 3,816705 32 -0,992 3,752 5649,369748 4/PstI

4361 40 3,639586 32 -0,992 3,752 5649,369748 5/HindIII

39 -1,209 3,535 3427,677865 6/EcoRI

30 -0,93 3,814 6516,283941 7/PstI

33 -1,023 3,721 5260,172664 8/HindIII

41 -1,271 3,473 2971,666032 9

41 -1,271 3,473 2971,666032 10

42 -1,302 3,442 2766,941645 11

Keterangan : DNA plasmid hasil isolasi terdapat pada sumuran no. 10 dan 11.

Jumlah pasangan basa DNA plasmid yang telah direstriksi sesuai tabel di atas adalah

4897,79 bp untuk DNA plasmid yang dipotong dengan enzim restriksi HindIII, 5260,17 bp

untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan EcoR1, 5649,37 bp untuk DNA plasmid

yang direstriksi menggunakan PstI, 5649,37 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi

menggunakan HindIII, 3427,68 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan EcoRI

6516,28 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan PstI, 5260,17 bp untuk DNA

plasmid yang direstriksi menggunakan HindIII. Menurut Anonim (2007), jumlah basa enzim

restriksi mempengaruhi jumlah pasangan basa hasil restriksi, enzim restriksi dengan 6 bp

akan menghasilkan fragmen dengan ukuran rata – rata 4096 basa. EcoRI merupakan enzim

restriksi dengan 6 bp sehingga menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 3000 –

5000 bp pada praktikum. Sumuran no. 9, 10, dan 11 digunakan untuk me-running DNA

plasmid pUC19 dan DNA plasmid hasil isolasi. Dibandingkan dengan fragmen (pita) yang

lain yang merupakan DNA plasmid yang direstriksi, pita DNA plasmid yang direstriksi

memiliki jarak yang lebih dekat dari sumuran dibandingkan dengan pita DNA plasmid hasil

isolasi. Hal ini menunjukkan bahwa konformasi linier dari DNA memiliki kemampuan

running lebih lambat dibandingkan dengan pita DNA sirkuler dalam praktikum ini adalah

DNA plasmid. Jumlah pasangan basa juga menentukkan jarak pita DNA dari sumuran. Jarak

pita DNA dari sumuran menunjukkan kecepatan DNA pada saat dirunning. Hal tersebut

menjelaskan bahwa kecepatan DNA pada saat dirunning dipengaruhi oleh konformasi dan

jumlah pasangan basanya. Adapun sumuran no. 9 dengan hasil sama dengan sumuran no. 10

adalah pita dari plasmid pUC19. Berdasarkan uraian tersebut maka dapat diketahui bahwa

salah satu penentu jarak pita dari sumuran adalah konformasi DNA. DNA dengan konformasi

sirkuler akan berlari lebih cepat dibandingkan DNA linier pada saat running elektroforesis

gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa yang dilakukan dalam praktikum bertujuan untuk

mengetahui pita DNA hasil restriksi.

Restriksi DNA plasmid pUC19 dilakukan dengan beberapa tahapan. Tahapan yang

pertama adalah pembuatan larutan untuk optimasi reaksi pemotongan DNA menurut Promega

(2005) dengan modifikasi (Lampiran 1.). Komposisi larutan tersebut adalah ddH2O, Buffer E,

BSA, DNA pUC19, enzim restriksi. Volume larutan final tersebut adalah 25 µl, sedangkan

volume ddH2O relatif terhadap komposisi komponen yang lain. Larutan optimasi dibuat

dengan cara memipet satu persatu larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml

dengan cara menempelkan tip mikropipet yang digunakan untuk mengambil komponen

larutan pada dinding tabung. Setelah larutan optimasi dibuat tahapan selanjutnya adalah

tabung dispin dengan tujuan agar larutan yang menempel pada dinding tabung jatuh ke

tengah tabung. Kemudian tabung diketuk-ketuk. Tahapan selanjutnya adalah inkubasi pada

suhu 37 oC selama 4 jam. Suhu tersebut merupakan suhu optimum enzim bekerja. Pada saat

inkubasi ini, enzim restriksi bekerja memotong DNA plasmid yang memiliki konformasi

sirkuler menjadi linier. Kemudian enzim ini diinaktivasi dengan cara menginkubasi tabung

tersebut pada suhu 70 oC selama 10 menit. Tahapan terakhir adalah penyimpanan di freezer.

III. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa restriksi DNA plasmid

dapat dilakukan menggunakan beberapa enzim restriksi,diantara HindIII, EcoR1, dan PstI.

Jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil restriksi dapat diketahui dengan elektroforesis gel

agarosa.

B. Saran

Restriksi DNA yang dilakukan untuk praktikum yang akan datang sebaiknya dapat

menggunakan enzim-enzim restriksi yang lainnya.

DAFTAR REFERENSI

Anonim. http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0301/1017317_QN301_ITJPDIS-3- 5.pdf . Diakses pada tanggal 9 Februari 2010.


Promega. 2005

http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0301/1017317_QN301_ITJPDIS-3-5.pdf

http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0301/1017317_QN301_ITJPDIS-3-5.pdf

1 2 3 4 5 6 7

P1 P2 P3

Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid

Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005)

No. Komponen P1 P2 P3

1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl

2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl

3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl

4. DNA

pUC19 20 µl 20 µl 20 µl

5. PstI 2 µl - -

6. EcoR1 - 2 µl -

7. HindIII - - 2 µl

Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl

Spin sebentar, 2”

Ketuk-ketuk

Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam

Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menitSimpan di frezer

ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

I. PENDAHULUAN

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa

digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan

sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel

DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim, 2010).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin

rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan

membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar

(DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di

bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan

larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di

dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

TUJUAN

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

Simpan di frezer

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

a. DNA kromosom bakteri,

b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)

c. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

3. Agarosa

4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M

pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

5. Akuades

6. Gelas Ukur 1000 ml

7. Labu Erlenmeyer 50 ml


9. Sarung tangan


11. Kertas parafilm

12. seperangkat alat elektroforesis

13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;

EDTA 120 mM)

14. larutan Etidium Bromid (EtBr)

15. UV transluminator

16. Kaca mata UV

17. kamera digital

CARA KERJA

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam

245 ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam

bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa

selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir

menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika

suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid

(PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel

agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.

8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah

diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa

dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada

kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.

12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang

tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi

baki/gel ke arah sebaliknya).

13. nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V

dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber

arus.

15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai

oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki

elektroforesis.

16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di

atas UV transluminator).

17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.


Elektroforesis gel agarosa dilakukan menggunakan DNA plasmid pUC19 hasil

restriksi dengan beberapa enzim restriksi, yaitu : HindIII, EcoR1, dan PstI dan DNA plasmid

pUC19 hasil isolasi. Beberapa DNA tersebut dirunning bersama dengan marker yang berupa

DNA λ yang dipotong menggunakan HindIII dengan elektroforesis gel agarosa dan

menghasilkan pita-pita pendaran seperti gambar berikut ini :

Gambar 2. 1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : nomor menunjukkan nomor sumuran


direstriksi menghasilkan pita-pita yang jelas, kecuali sumuran no. 6. Hal ini terjadi

kemungkinan karena pita DNA pada sumuran no. 6 belum terpotong dengan baik sebelum di

running dengan eletroforesis gel agarosa. Sumuran no. 1 menghasilkan beberapa pita karena

2 3 4 5

6 781

9

10

11

sumuran ini merupakan marker yang merupakan DNA λ dengan HindIII. Sumuran ke-2

sampai dengan ke-8 adalah DNA plasmid yang dipotong dengan beberapa enzim restriksi

yang berbeda untuk tiap sumuran. Sumuran ke-9 sampai dengan ke-11 adalah DNA plasmid

hasil isolasi. Berdasarkan gambar 2.1, dapat dinyatakan bahwa DNA dengan konformasi

linier akan lebih lambat runningnya dibandingkan dengan DNA plasmid dengan konformasi

sirkuler. Selain itu, kecepatan running DNA juga ditentukan oleh jumlah basa pada fragmen

DNA. Adapun hasil perhitungan jumlah basa dari DNA pada praktikum disajikan pada tabel

2.1 berikut ini :

Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA hasil elektroforesis gel agarosa

bp marker

jarak marker log 10bp

unknown distance m*distance y value unknown bp

No. Sumuran

23130 13 4,364176 34 -1,054 3,69 4897,788194 2

9416 25 3,973866 33 -1,023 3,721 5260,172664 3

6557 30 3,816705 32 -0,992 3,752 5649,369748 4

4361 40 3,639586 32 -0,992 3,752 5649,369748 5

39 -1,209 3,535 3427,677865 6

30 -0,93 3,814 6516,283941 7

33 -1,023 3,721 5260,172664 8

41 -1,271 3,473 2971,666032 9

41 -1,271 3,473 2971,666032 10

42 -1,302 3,442 2766,941645 11

Fragmen DNA dengan jumlah basa lebih banyak memiliki jarak dari sumuran lebih

dekat dibandingkan dengan fragmen DNA dengan jumlah basa yang lebih sedikit. Hal ini

menunjukkan bahwa semakin kecil ukuran pasangan basa fragmen DNA maka semakin cepat

running fragmen DNA tersebut. Hal ini sesuai dengan pernyataan yang terdapat dalam The

QIAGENGuide to Analytical Gels (Anonim). Elektroforesis gel agarosa pada praktikum

dilakukan dengan beberapa tahapan. Tahap pertama adalah pembuatan gel agarosa dengan

komposisi 0,2 gram gel agarosa dilarutkan dalamTAE 1x sehingga dihasilkan konsentrasi

akhir 1 % kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir pada salah satu

sisinya, setelah memadat, sisir tersebut dilepas dan gel yang terbentuk direndam dalam TAE

1x sebanyak 220 ml. Tahap ke-2 adalah menyiapkan sampel DNA yang akan dirunning.

Sampel DNA tersebut dicampur dengan loading buffer terlebih dulu pada parafilm. Setelah

tercampur kemudian sampel DNA tersebut dimasukkan ke dalam sumuran pada gel yang

telah diletakkan di bejana bufer elektroforesis dengan larutan TAE 1x sebanyak 220 ml.

Tahap ke-3 adalah running sampel DNA (power supply dihidupkan). DNA yang telah

bermigrasi kemudian dilihat pada transluminator UV, tahapan ini adalah tahap terakhir pada

elektroforesis gel agarosa. Pita – pita yang terbentuk diamati.

III. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa elektroforesis gel agarosa

dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu pembuatan gel agarosa, menyiapkan sampel DNA

yang akan dirunning (sampel DNA tersebut dicampur dengan loading buffer terlebih dulu

pada parafilm), running sampel DNA, DNA yang telah bermigrasi kemudian dilihat pada

transluminator UV.

B. Saran

Elektroforesis gel agarosa dilakukan dengan menggunakan sarung tangan khusus

karena terdapat bahan karsinogenik pada saat praktikum.

DAFTAR REFERENSI

Anonim. http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0100/Practical_Hints.pdf. Diakses pada tanggal 9 Februari 2010.

ACARA IV.

TRANSFORMASI SEL E. coli JM109

I. PENDAHULUAN

LANDASAN TEORI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri

misalnya bakteri E.coli. Sel E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke

dalam plasmid. Setelah diinkubasi, sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya

menjadi banyak, karena fenotip strain E. coli hasil transforman mengandung plasmid dan

salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin), maka

untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil

transformasi pada media yang mengandung ampisilin. Strain E. coli tersebut akan berubah

karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut.

Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat

dikatakan telah ditransformasi. Transformasi merupakan hal yang penting karena

menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor.

Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi

bakteri, jamur, herbisida.

Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel kompeten

merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. E. coli biasanya

digunakan sebagai sel kompeten.

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. coli

BAHAN DAN ALAT

1. strain E. coli JM 109

2. media LB cair

3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin

http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0100/Practical_Hints.pdf

4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG

5. es batu

6. shaker-incubator

7. termometer




11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

12. jarum ose

13. batang drugalsky

14. cawan Petri

15. Erlenmeyer

16. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)

17. kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara

memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam

shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam

(semalam).

2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan

cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan

kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan

inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2

jam) pada suhu 37oC.

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung

mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2

dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2

dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung

mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16

jam.

6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel

kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19

sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.

7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut

panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam

es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit,

dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan

rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung

nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama

16 jam pada suhu 37oC.

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-

masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk

penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan

(tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).

11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan

diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan

ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,

dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal

dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih

kurang 30 menit.

14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.

15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan

dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media

LB/Amp/X-Gal/IPTG.

16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan

inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.

17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni

untuk diketahui efisiensi transformasinya.

18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut

Dimana,

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)


Transformasi pada praktikum ini dilakukan dengan tujuan menyisipkan plasmid ke

dalam sel. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel tersebut

kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut.

Sel yang telah ditransformasi disebut transforman. Hasil yang diperoleh dari praktikum

transformasi ini adalah koloni E. coli dalam cawan.

Gambar 2.1. Koloni E. coli hasil transformasi dan koloni E. coli nontransformasi dalam cawan.

Koloni E. coli tumbuh pada semua cawan. Cawan pertama berisi media tanpa

ampisilin. Cawan kedua berisi media dengan ampisilin. Cawan ketiga berisi media tanpa

ampisilin. Cawan keempat berisi media dengan ampisilin. Sel yang dikultur pada media –

media tersebut adalah E. coli transforman dan bukan transforman. Sel transforman dikultur

pada media dengan ampisilin dan tanpa ampisilin. Begitu pula sel yang bukan transforman.

Hasil yang diperoleh untuk sel transforman adalah tumbuh pada kedua cawan kultur.

Pada cawan kultur dengan ampisilin dan tanpa ampisilin, koloni E. coli tumbuh dengan

koloni – koloni kecil dan koloni lebar (TBUD) (Tabel 2.1.).

Tabel 2.1 Jumlah koloni sel transforman dan nontransforman pada media kultur.

Jenis sel Jumlah koloni pada media

Media +ampisilin Media tanpa ampisilinE. coli transforman 416 TBUD

E. coli nontransforman 16 TBUD

E. coli transforman dapat tumbuh di kedua media. Hal ini sesuai dengan teori yang

ada. Sel tersebut mampu tumbuh pada media dengan ampisilin karena di dalam selnya

terdapat plasmid. Keberadaan plasmid di dalam sel E. coli membuat sel tersebut resisten

terhadap antibiotik ampisilin (Lodish et al.).

Sel nontransformasi merupakan sel yang tidak disisipi plasmid sehingga tidak dapat

tumbuh pada media dengan ampisilin (Lodish et al.). Namun hasil praktikum menunjukkan

bahwa sel nontransformasi tumbuh pada media dengan ampisilin dengan jumlah koloni 16.

Hal ini dimungkinkan karena terjadi kontaminasi selama pengkulturan sel atau kondisi

ampisilin yang tidak mencukupi pada media kultur.

III. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa transformasi yang

dilakukan pada E. coli berhasil.

B. Saran

Pembuatan media kultur dilakukan oleh masing – masing kelompok pada praktikum

sehingga terjadi kemungkinaan perbedaan tumbuhnya sel yang dikultur pada media kultur.

DAFTAR REFERENSI


laporan praktikum biologi sel molekuler

Documents