LAPORAN PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN DENGAN TEKNIK HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK INSTRUMENdiajukan untuk memenuhi Mata Kuliah Praktikum Kimia Analitik Instrumen

Dosen Pembimbing:Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si,Tanggal Praktikum: 16 Februari 2015

Disusun olehKelompok 2Annisa Ananda (1202336)Aprista Zebua (1202425)Arini Nur Fitria (1205870)

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIAFAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA2015

A. Tanggal Praktikum :16 Februari 2015

B. Judul Praktikum :Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

C. Tujuan Praktikum :1. Memahami cara kerja instrumen HPLC. 2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC. 3. Dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan kafein dalam sampel obat.

D. Tinjauan Pustaka :Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner atau diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semuajenis kromatografi yangdikenal, terbagi menjadiempat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 1986).Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnya dikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baikuntuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif.Analisis kuantitatif denganteknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalamkromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Tim Kimia Analitik Instrumen. 2010:11)Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detector yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikansecara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untukanalisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidangantara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organik teknikHPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer. Kelebihan KCKT antara lain:1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran2. Resolusinya baik3. Mudah melaksanakannya4. Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi5. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis6. Dapat digunakan bermacam-macam detektor7. Kolom dapat digunakan kembali8. Mudah melakukan rekoveri cuplikan9. Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator danreprodusibilitasnya lebih baik10. Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif11. Waktu analisis umumnya singkat12. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar13. Ideal untuk molekul besar dan ion(Putra, Effendy De Lux. 2004 :8)Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS).Keterbatasan lainnya adalahjika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh. Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. (Hendayana,Sumar.2006:69)

Konsentrasi solut dalam setiap fasa dinyatakan sebagai koefisien partisi, K. Cs dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fasa diam dan fasa gerak.

Sebagai alternative, distribusi Solut-solut di antara dua fasa-fasa tersebutdinyatakan dengan satuan massa atau waktu keluarnya solut atau volume fasa gerak:

K adalah factor kapasitas, gs dan gm adalah masssa solut dalam fasa diam dan fasa gerak, tR dan t0 adalah waktu yang diperlukan untuk elusi solut yang berikatan dan solut yang tidak berikatan dengan fasa diam. Perkalian waktu-waktuini dengan kecepatan alir fasa gerak menghasilkan volume retensi, Vr dan volume hampa V0. Walaupun K dan K merupakan kuantitas yang berbeda, tetapi keduanya berhubungan secara linier.

Ketika senyawa-senyawa dipisahkan dalam kolom maka masing-masingsenyawa menyebar dan menjadi encer. Peristiwa ini dikenal dengan istilah bandbroadening yang terlihat dari puncak yang melebar.Diffusi Eddy merupakan salah satu penyebab pelebaran peak. Penyebab kedua berasal dari transfer massa, Solut selalu berpindah-pindah di antara fasa gerak dan fasa diam.

Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plat teori. Penerapannya pada kromatografi, jumlah teori plat, N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi. Suatu persamaan yang analog dengan persamaan Van Deemter dari kromatografi gas telah dikembangkan untuk HPLC. Persamaan ini dikenal sebagai persamaan knox, yang menyatakan pengaruh-pengaruh tiap proses band broadening terhadap efisiensi.Resolusi pada HPLC dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas(a), dan retensi (k). adalah selektivitas, k1 dan k2 adalah masing0masing factorkapasitas senyawa 1 dan senyawa 2.

Jenis retensi Solut merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahansenyawa bergantug pada jenis dan kekuatan interaksi Solut dengan fasa diam.Mekanisme retensi dapat dikelompokan menjadi lima, yaitu:a. Kromatografi adsorpsiKromatografi ini sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang agak polar. Kromatografi yang menggunakan fasa gerak nonpolar dan fasa diam polar biasanya HPLC fasa normal. Partikel-partikel silika atau alumina digunakan sebagai adsorben. Untuk mengontrol retensi solut, biasanya ditambahkan sedikit senyawa polar kepada fasa gerak sebagai modifier. Modifier bersaing dengan molekul-molekul solut untuk merebut tempat adsorpsi.b. Kromatografi partisiKromatografi partisi merupakan kromatografi fasa terbalik dimana fasagerak lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa geraknya harus dijenuhkan dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi lapisan fasa diam. Pada kromatografi ini terdapat keterbatasan selektivitas sehingga ketidak campuran kedua fasa. Fasa gerak dan fasa diam beberapa senyawa sangat kuat atau tidaktertahan sama sekali pada fasa diam.c. Kromatografi fasa terikatKromatografi ini adalah krimatgrafi yang sering digunakan, kromatografi fasa terikat memiliki persamaan dengan kromatografi partisi. Pada kromatografi ini, adsorben fasa terikat terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil. Fasa terikat merupakan fasa yang stabil. Oleh karena itu, kolom akan bertahan dan keterulangan waktu retensi yang baik.d. Kromatografi penukar ionKarakteristik fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion seperti yang diperlukan oleh jenis kromatografi lain. Fasa gerak harus melarutkan cupllikan, mempunyai kekuatan pelarut yang memberikan waktu retansi yang cocok, berinteraksi dengan solut sehingga memberikan harga selektivitas yang tepat. Fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion adalah larutan dalam air dapat mengandung sedikit metanol atau pelarut organik lain yang bercampur dengan air. Pelarut ini juga mengandung senyawa-senyawa ionisasi dalam bentukbuffer. Kekuatan pelarut dan selektivitas ditentukan oleh jenis dan konsentrasi bahan-bahan tambahan ini. Umunya, ion-ion dari fasa gerak bersaing dengan ion analit untuk memperebutkan tempat paking penukaran ion. Fasa diam dalam kromatografi penukaran ion dapat berupa penukaran ion asam sulfonat untukkation atau penukar ion amin untuk anion.e. Kromatografi eksklusi ukuranUkuranmolekulmerupakankriteriautamadalampemisahanini.Pemisahanterjadikarenasolut-solut berdifusi masuk dankeluarpori-porimaterial paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat, dan molekul kecil menempati volume pori dan tertahan lebih lama.(Hendayana, Sumar.2006:71-77)

Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLCialah sebagai berikut :1. Fasa gerakBerupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerakselain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor,juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut :1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45m. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base line.4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidakberacun.5) Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centiPoise).6) Sesuai dengan detektor. Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritisdalam keberhasilan pemisahan. Sayangnya, teori interaksi fasa gerak dengan sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan ataseksperimen trial-and errordengan berbagai jenis dan krom posisi pelaruthingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak yangbaikmemberikan faktor kapasitas k pada rentang yang seesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen, waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarut-pelarut juga bergantung pada faktorselektifitas () untuk komponen cuplikan.Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyaknoise sehingga data tidak dapat digunakan.(Harvey, David. 2000 : 581)2. Pompa Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui kolom yangberisiserbuk halus.Pompa yangdapat digunakandalam HPLC harus memenuhi persyaratan :1) Menghasilkan tekanan sampai 600 psi.2) Keluaran bebas pulsa3) Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.4) Bahan tahan korosi.Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian, yaitu pompa reciprocating,displacement,danpneumatic.Pompa reciprocatingJenis pompa ini sekarang paling banyak dipakai. Popa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontaklangsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutup saluran pelarut danpelarut yang telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. Gerakan piston mundur dan maju terjadi secara terus menerus sehingga memeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini menghasilkan pulsa yang dapat mengganggu base-line kromatogram, karena itu dipasang peredam pulsa untukmenghilangkan gangguan base-line sedangkan keuntungan pompa ini adalah memiliki volume internal yang kecil. Untuk mengurangi bond broadening. Selain itu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi, kecepatan alir konstan yang tidakbrgantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan balik klom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut.

Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompajenis murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.

3. Pemasukan cuplikanKebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh miroliter.Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop-flow, dan kran cuplikan.

Syringe

Injeksi syringeAlat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) danuntuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari 2-3% dan sering lebihjelek.

Injeksi stop-flowInjeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali, kolom maka pelarut dialirkan kembali.

Kran cuplikanJenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyakdigunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah :1) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop.2) Kran diputar untuk mengubah cuplikan load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 L. Dengansistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan pada tekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5L.

Tipe injector katup putaran4. KolomKolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif. Untukkeperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan denganfraction colector.Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion. Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenis terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi.

Fasa DiamDalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan filmyang dilapiskan padamaterialkemasanyangterdiridaripartikelsilicaberpori3-10.Fasadiam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Karena fasa diam polar, maka fasa gerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar. Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografi fasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemuidalam HPLC, fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umum menggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C-8)ataun-octyldecyl (C-18) rantai hidrokarbon.

Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya dipacking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi, yaitu untuk menyaring kotoranyang terbawa dalam fasa diam dan untukmenjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapatdihindarkan.

5. DetektorBerbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut :1) Cukup sensitif2) Stabilitas dan ketrulangan tinggi3) Respon linear terhadap solute4) Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir5) Reliabilitas tinggi danmudah digunakan6) Tidak merusak cuplikan.Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detector, yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang brsifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan.Detektor UVDetektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UVyang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organikmenyerap sinar UV padasekitar panjang gelombang tersebut. Detektor elektrokimiaDetektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik dan poligrafi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik.(Hendayana, Sumar.2006:83-94)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cairmodern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan,terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan. (Putra, Effendy De Lux. 2004 : 6)

6. RekorderUntuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak (kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.Fungsi darikromatogramantara lain:1) KualitatifWaktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yangsama dapat digunakan untuk identifikasi.2) KuantitatifLuas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dandapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.3) Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom (kapasitas k, selektifitas , jumlah pelat teoritis N, jaraksetara dengan pelat teoritis HETP, dan resolusi R).Penerapan kromatografi cairan kinerja tinggi dapat dilakukan dengan dua mode oprasional, yaitu :1) Mode isokratikMode isokratik serupa dengan mode isotermal dalam kromatografi gas,hanya dalam HPLC komposisi fasa geraknya yang sama selama pengukuran berlangsung. Tidak perlu mengatur komposisi campuran fasa gerak.2) Mode gradientKomposisi fasa geraknya divariasikan selama pengukuran berlangsung. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerakselama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan didalam kolom. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :a. Total waktuanalisis dapatdireduksib. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambahc. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peakGradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradiendapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.(Putra, Effendy De Lux. 2004 :7)

Parasetamol dan kafein umumnya terdapat bersama dalam satu tablet obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom non polar seperti C-18 dan fasa gerak agak polar campuran beberapa pelarut. Tim Kimia Analitik Instrumen. 2015:1)

ParasetamolParasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar, dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.

KafeinSuatu alkohol dengan rumus molekul C5H10N4O2. Berupa padatan kristal berwarn aputih dan berasa pahit, ditemukan dalam daun dan biji dari pohin kopi, dalam daun teh, dalam biji kola.

E. Alat dan Bahan Alat 1. Perangkat HPLC1 set2. Lumpang dan alu1 set3. Spatula1 buah4. Labu ukur 25 mL1 buah 5. Labu ukur 10 mL7 buah 6. Neraca analitik terkalibrasi1 set7. Corong pendek1 buah8. Pipet tetes2 buah9. Gelas kimia 500 mL1 buah10. Ultrasonic vibrator1 set11. Botol vial 10 mL1 buah

Bahan1. Parasetamol p.a25 mg2. Kafein12,5 mg3. KH2PO4420 mL4. Sampel obat10 mg5. Isopropilalkohol30 mL6. Aquabidestilatasecukupnya7. Asetonitril30 mL8. Kertas saring Whattman1 lembar9. Membrane PTFE dan selulosa nitratsecukupnya

F. Prosedur Kerja 1. Pembuatan fasa gerak (pelarut)Ke dalam sebanyak 420 mL KH2PO4 0,01 M ditambahkan methanol 20 mL, asetonitril 30 mL, dan isopropyl alkohol 30 mL. Dilakukan penyaringan untuk larutanmenggunakan membrane Whatman filter PTFE 0,2 m, disonikasi dengan ultrasonic vibrator selama 30 menit. 2. Pembuatan larutan induk parasetamol Ditimbang 25 mg, vitamin c 1 mg, Parasetamol p.a dan 12,5 mg kafein, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Ditambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi selama 15 menit, diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas. Dilakukan penyaringan dengan membrane dan dilakukan sonikasi. Dihitung konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan kafein.3. Pembuatan deret larutan standar parasetamol Dipipet larutan induk parasetamol dan kafein masing-masing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL ke dalam labu ukur 10 mL. Ditambahkan pelarut hingga tanda batas. Kemudian disaring semua larutan standar tersebut dengan menggunakan membrane PTFE. Ditempatkan hasil saringan ke dalam vial bertutup yang telah diberi label. Dilakukan sonikasi selama 5 menit. Larutan standar siap diinjeksikan.4. Pembuatan larutan sampel parasetamol Ditimbang 20 tablet sampel obat dan dicatat hasilnya. Kemudian ditentukan berat rerata tablet. Digerus seluruh tablet dengan lumping dan alu hingga homogeny. Diambil sampel yang telah berbentuk serbuk sebanyak 25 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan 1 mL pelarut dan disonikasi selama 10 menit. Diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas lalu dikocok dan disaring melalui penyaringan kering. Dipipet 1 mL sampel yang telah disaring dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Kemudian ditambahkan pelarut hingga tanda batas. Disaring dengan membrane Whatman lalu disonikasi selama 5 menit. Sampel siap diinjeksikan.5. Penyiapan instrumen HPLCSementara melakukan preparasi sampel dan standar, dihidupkan peralatan HPLC sesuai dengan langkah berikut :a) Dikondisikan instrumen HPLC dengan: fasa gerak dengan sistem elusi gradien dengan kondisi:Fasa gerak: KH2PO4 0,01 M 420 mL, methanol 20 mL, asetonitril 30 mL, isopropyl alkohol 30 mLKolom: C-18 (15 cm)Panjang gelombang: 215 nmLaju alir: 1 mL/menitVolume injeksi: 20 Lb) Dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.c) Ditekan tombol ON pada sakelar listrik.d) Diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan dikosongkan botol penampung.e) Ditekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor, dan pompa.f) Dilakukan pemrograman alat dengan komputer. Diikuti langkahnya sesuai instruksi dalam komputer.g) Dipilih mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumenh) Apabila kromatogram telah menunjukkan base line yang mendatar , maka instrumen siap digunakani) Diinjeksikan berturut-turut larutan standar (dimulai dari konsentrasi terendah), dan terakhir larutan sampel.j) Dicetak hasil pengukuran, dicatat kondisi percobaannya.k) Setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam komputer.l) Ditutup file sesuai petunjuk, lalu dimatikan komputer.m) Untuk mematikan, ditekan tombol OFF pada pompa, detektor, dan power secara berurutan. Diputuskan sambungan listrik.6. Perhitungan hasil analisisDari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi.Bila kurva kalibrasi diperoleh dengan koefisien regresi > 0,997 , maka boleh melanjutkan perhitungan kadar zat aditifdalam sampel. Dihitunglah kadarnya dalam satuan % b/b . Bila tidak diperoleh kurva yang linier, maka dilakukan diskusi untuk mencari penyebabnya.

I. Daftar PustakaHarvey, David. (2000).Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill Companies.Hendayana, Sumar. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Semarang: IKIP Semarang PressHendayana, Sumar. (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi danElektroforensisModern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.Khopkar, S.M. (1990). Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI PressPutra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU.R.A. Day, Jr. dan A.L. Underwood. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: ErlanggaSkoog, A. Douglas ,F. James Holler, dan Stanley R. (2004). Fundamental of Analytical Chemistry English Edition. Ontario : Brodis/Cole-ThomsonTim Praktikum Kimia Analitik Instrumen. (2015). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Bandung: Instrumen Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPITim Kimia Analitik Instrumen. (2010). Penuntun Praktikum Kimia AnalitikInstrumen (KI-431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.