LAPORAN PRAKTIKUM

KETERAMPILAN DASAR LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

Disusun oleh :

Kelompok 2B

Arfi Kurniawan (1206292654)

Debie (1206178640)

Enny Nugraheni (1206178685)

Fairuz (1206178754)

Maharani Harahap

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

Jakarta

2012

PRAKTIKUM I

PENENTUAN SERAPAN MAKSIMAL LARUTAN BERWARNA

A. Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk menentukan panjang gelombang (λ) optimal dengan

serapan maksimum.

B. Landasan Teori

Radiasi elektromagnetik atau cahaya, merupakan suatu bentuk energi yang wujudnya

berupa gelombang dan partikel. Banyak interaksi antara radiasi elektromagnetik dan materi

menyebabkan absorpsi dan emisi. Jika suatu samper menyerap suatu radiasi elektromagnetik,

maka akan menyebabkan perubahan energy. Interaksi antara sampel dan radiasi

elektromagnetik paling mudah dipahami jika kita berasumsi bahwa radiasi elektromagnetik

terdiri dari sinar partikel energi yang disebut dengan foton. Ketika foton diserap oleh sampel,

maka energi tersebut juga digunakan oleh sampel.1

Frekuensi dan gelombang radiasi elektromagnetik sangat bervariasi. Tiap-tiap jenis

radiasi elektromagnetik memiliki kisaran spektrum yang berbeda-beda berdasarkan tipe

transisi atom atau molekul yang menunjukkan kemampuan penyerapan foton (Gambar 1).

Gambar 1 Pembagian spektrum elektromagnetik

Spektrum cahaya tempak memiliki kisaran spektrum antara 380-780. Gelombang

cahaya inilah yang dapat dilihat oleh manusia sehingga bisa melihat bermacam-macam warna

yang berbeda. Sinar tampak yang lewat ke suatu materi ada yang diserap dan ada yang

dilewatkan. Suatu larutan berwarna karena larutan tersebut menyerap suatu gelombang

elektromagnetik terterntu atau spesifik ketika cahaya dilewatkan pada larutan tersebut. Dan

warna yang bisa dilihat oleh mata, merupakan gelombang cahaya yang tidak diserap atau bisa

dilewatkan.2

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran

serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg

spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor

fototube. Prinsip kerja dari spektrofotometer adalah didasarkan pada fenomena penyerapan

sinar oleh spesi kimia tertentu di daerah ultra lembayung (ultra violet) dan sinar tampak.

Spektrometer menghasilkan sinar dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

mengukur intensitas sinar yang dihasilkan. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber

spektrum yang kontinyu, monokromotor, sel pengabsorbsi untuk sampel serta blanko dan

suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbs antara sampel dan blanko tersebut (Gambar

2).3-4

Gambar 2 Diagram prinsip kerja spektrofotometer.

Sinar yang digunakan pada spektrofotometer adalah sinar monokromatis. Hal ini

disebabkan karena setiap larutan memiliki serapan maksimal pada panjang gelombang

tertentu. Oleh karena itu sebelum dilakukan pengukuran konsentrasi suatu larutan, perlu

dilakukan pemilihan panjang gelombang yang menyerap molekul larutan paling maksimal.

C. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah spektrofotometer, tabung reaksi, rak

tabung reaksi dan kuvet. Bahan yang digunakan adalah larutan kobalt nitrat 1% dan aquades.

D. Cara Kerja

Larutan kobalt nitrat 1% di siapkan. Spektrofotometer dinyalakan dengan memutar

tombol on/off kemudian ditunggu selama 5 menit sampai alat menjadi panas. Dengan

menggunakan tombol pengatur panjang gelombang, dipilih panjang gelombang yang akan

digunakan untuk pemeriksaan. Panjang gelombang yang akan diukur berkisar antara 400-550

nm. Untuk pengukuran awal, diatur pada panjang gelombang terkecil.

Langkah pengukuran diawali dengan standarisasi spektrofotometer menggunakan

larutan blanko yaitu aquades. Masukkan akuades ke dalam kuvet, dengan volume ± 3 ml.

Kuvet dimasukkan ke dalam tempat sampel. Tombol pengatur cahaya diputar sehingga jarum

menunjukan nilai A= 0, T = 100%. Kuvet yang berisi aquades dikeluarkan dari

spektrofotometer, lalu diganti dengan kuvet yang berisi larutan Kobalt Nitrat 1%. Nilai

serapan larutan atau absorbansi akan ditunjukkan oleh pergeseran jarum pada layar. Hasil

serapan spektrofotometer dibaca dan dicatat. Kuvet dikeluarkan kembali, kemudian panjang

gelombang diubah ke panjang gelombang yang lebih besar, kemudian langkah pengukuran

diulangi kembali secara berurutan setiap pengukuran panjang gelombang yang ditentukan

hingga panjang gelombang terbesar.

E. Hasil

Tabel 1. Hubungan Panjang Gelombang dan Absorbansi

Panjang Gelombang(λ (nm))

Nilai Absorbansi

400 0410 0,009420 0,018430 0,027440 0,04450 0,062460 0,089470 0,11480 0,127490 0,14500 0,16510 0,17520 0,178530 0,167540 0,141550 0,115

* Serapan maksimum (0,178) pada panjang gelombang 520 nm.

380 400 420 440 460 480 500 520 540 5600

0.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

0.2

Nilai Absorbansi

Gambar 2. Nilai Absorbansi larutan cobalt nitrat dengan panjang

gelombang yang berbeda.

F. Pembahasan

Jika suatu samper menyerap suatu radiasi elektromagnetik, maka akan menyebabkan

perubahan energy. Interaksi antara sampel dan radiasi elektromagnetik paling mudah

dipahami jika kita berasumsi bahwa radiasi elektromagnetik terdiri dari sinar partikel energi

yang disebut dengan foton. Ketika foton diserap oleh sampel, maka energi tersebut juga

digunakan oleh sampel.1

Frekuensi dan gelombang radiasi elektromagnetik sangat bervariasi. Tiap-tiap jenis

radiasi elektromagnetik memiliki kisaran spektrum yang berbeda-beda berdasarkan tipe

transisi atom atau molekul yang menunjukkan kemampuan penyerapan foton.

Pada praktikum ini penentuan panjang gelombang maksimum larutan kobalt nitrat

dimulai dengan menggunakan panjang gelombang 400 nm dan dinaikkan 10 nm sampai

dengan 550 nm. Dari hasil percobaan tersebut didapatkan hasil seperti yang terlihat pada

tabel 1, bahwa panjang gelombang tertinggi dari larutan cobalt nitrat adalah 520 nm. Hal ini

ditunjukkan dengan nilai absorbansi paling tinggi yaitu sebesar 0,178

G. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa larutan

Kobalt Nitrat memiliki panjang gelombang maksimal 520 nm. Hal ini berarti terdapat

hubungan kadar dan panjang gelombang (serapan) tergantung dari tingkat kadar larutan.

PRAKTIKUM II

PEMBUKTIAN HUKUM BEER-LAMBERT

A. Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar larutan uji dan membuktikan hukum

Beer-Lambert.

B. Landasan Teori

Spektrofotometri dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa yang murni maupun

yang tidak murni. Spektrofotometri bekerja berdasarkan dua prinsip fisika yaitu Hukum

Lambert dan Hukum Beer. Hubungan antara kadar senyawa dan absorpsi cahaya dinyatakan

dengan hukum Lambert-Beer.1,2

Hukum Lambert menyatakan : “bila berkas cahaya monokromatis melalui suatu larutan

berwarna, intensitas cahay yang keluar akan berkurang secara eksponensial sejalan dengan

bertambahnya jarak yang ditempuh cahaya dalam larutan. Persamaannya dapat ditulis sebagai

berikut ini,

I = I0 e-αl

ln I0/I = α

α = 2,303 K

Dimana I0 = intensitas cahaya datang; I = intensitas cahaya yang ditransmisikan/ dilewatkan;

k = konstanta, dan l = jarak yang ditempuh cahaya dalam kuvet. Persamaan tersebut

kemudian diubah menjadi bentuk logaritama,

Log10 I0/I = Kl

Log10 I0/I merupakan nilai absorbansi (A) atau optical density (OD). Absorbansi

menunjukkan penyerapan dari suatu larutan pada panjang gelombang tertentu pada

spektrofotometri.2

Gambar 3 Cahaya monokromatis menembus kuvet yang berisi senyawa

yang menyerap cahaya.

Hukum Beer menyatakan : “bila berkas cahaya monokromatis melalui suatu larutan

berwarna, intensitas cahaya yang keluar akan berkurang secara eksponensial sejalan dengan

peningkatan kadar larutan.

Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa intensitas cahaya yang masuk akan berkurang

sesuai dengan kenaikan kadar senyawa penyerap cahaya. Penurunan intensitas cahaya (dI)

saat melewati larutan berbanding lurus dengan I, c, dan dI.

dI = -k.C.I.dI

Nilai c merupakan konsentrasi larutan. Nilai koefisiensi absdorpsi (k) bervariasi tergantung

pada panjang gelombang cahaya yang digunakan. Persamaan tersebut dapat dinyatakan

sebagai berikut:

Log10 I0/I = ε. C. l

A = ε. C. l

Nilai ε adalah koefisien molar ekstinsi. Dari persamaan Beer-Lambert dapat diketahui bahwa

bila l konstan karena menggunakan kuvet yang sama, maka nilai absorbansi akan berbanding

lurus dengan konsentrasi senyawa. Dengan menggunakan seri larutan standar dengan kadar

yang berbeda-beda maka dapat dibuat kurva standar yang berupa garis lurus sehingga dapat

dicari persamaan liniernya untuk menentuka konsentrasi senyawa yang diuji.

Persamaan kurva standar menggunakan persamaan garis: y = ax + b dengan,

a =

N (∑ xy )−(∑ x )(∑ y )

N (∑ x2)−(∑ x )2

b=

(∑ y )(∑ x2 )−(∑ x )(∑ xy )N (∑ x2 )−(∑ x )2

x merupakan variabel yang menunjukkan kadar atau konsentrasi larutan standar (sumbu x).

Sedangkan y adalah variabel yang menunjukkan nilai serapan atau absorbansi (sumbu y).5

C. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah spektrofotometer, tabung reaksi, rak

tabung reaksi dan kuvet. Bahan yang digunakan adalah larutan kobalt nitrat dengan kadar

0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%, larutan uji U1 dan U2, serta aquades.

D. Cara Kerja

Spektrofotometer dan tabung reaksi yang berisi larutan Kobalt-Nitrat disiapkan. Dengan

menggunakan tombol pengatur panjang gelombang, dipilih panjang gelombang yang akan

digunakan untuk pemeriksaan. Pada percobaan awal dihasilkan panjang gelombang untuk

serapam maksimal larutan kobalt nitrat adalah 520, sehingga dipilih panjang gelombang

tersebut untuk percobaan ini. Kuvet yang berisi aquadest dimasukkan ke dalam

spektrofotometer untuk menstandardisasi alat tersebut. Mengeluarkan kuvet yang berisi

aquadest dari spektrofotometer, lalu menggantinya dengan larutan Kobalt-Nitrat. Tombol

pengatur cahaya diputar sehingga jarum menunjukan nilai A= 0, T = 100%. Kuvet yang

berisi aquades dikeluarkan dari spektrofotometer, lalu diganti dengan kuvet yang berisi

larutan seri standar Kobalt Nitrat dengan kadar yang bervariasi dari konsentrasi 0,5%, 1%,

1,5%, 2%, 2,5%, dan 3%. Kemudian dilanjutkan dengan larutan uji 1 dan uji 2. Setiap macam

larutan diukur secara duplo. Nilai absorbansi yang ditunjukkan pada layar dibaca dan dicatat.

Setelah diketahui nilai absorbansi larutan standar, dicari persamaan linear untuk menentukan

kadar larutan uji.

E. Hasil

Tabel 2. Hubungan Konsentrasi Larutan dengan Absorbansi pada λ 520 nm

Kadar (%)(X)

Absorbansi (A)

Absorbansi Rata-rata

(Y)XY X2

I II 0,5 0,091 0,091 0,091 0,045 0,25 1,0 0,167 0,168 0,1675 0,1675 1 1,5 0,26 0,259 0,2595 0,38925 2,25 2,0 0,359 0,351 0,355 0,71 4 2,5 0,44 0,445 0,4425 1,10625 6,25 3,0 0,55 0,55 0,55 1,65 9

Σ 10,5 1,867 1,864 1,8655 4,068 22,75

Persamaan garis : y = ax + b

a=N (∑ xy )−(∑ x ) (∑ y )N (∑ x2 )−(∑ x)2

a=(6 x 4 ,068 )−(10 ,5 x 1,8655 )(6 x 22 ,75 )−(10 ,5 )2

a=0 ,18362

b=(∑ y )(∑ x2 )−(∑ x ) (∑ xy )N (∑ x2 )−(∑ x )2

b=(1 ,8655 x22 ,75)−(10 ,5 x 4 ,068 )(6 x 22 ,75 )−(10 ,5 )2

b=0 ,01043

Persamaan diperoleh Y= 0,18362x + 0,01043

0.00% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% 3.00% 3.50%0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

Absorbant

Gambar 4 Grafik Hubungan Absorbansi dengan kadar larutan

bromofenol blue

Tabel 3. Absorbansi dan Kadar Larutan Uji pada λ 520 nm

Larutan UjiAbsorbansi (A) Absorbans

i Rata-rataKadar (%)

I II

U1 0,111 0,110 0,1105 ?

U2 0,218 0,218 0,218

U3 0,4 0,4 0,4 ?

Persamaan garis : y = ax + b

U1 : Y

0,1105

X

= 0,18362x-0,0104

= 0,18362x-0,0104

= 0,659 %

U2 : Y

0,218

X

= 0,18362x-0,0104

=0,18362x-0,0104

= 1,244 %

U3 : Y

0,4

X

= 0,18362x-0,0104

= 0,18362x-0,0104

= 2,234 %

F. Pembahasan

Hukum Beer menyatakan : “bila berkas cahaya monokromatis melalui suatu larutan

berwarna, intensitas cahaya yang keluar akan berkurang secara eksponensial sejalan dengan

peningkatan kadar larutan. Pada praktikum ini cahaya monokromatis melalui suatu larutan

berwarna Bromofenol blue dengan kadar larutan yang berbeda. Didapatkan hasil setiap

kenaikan konsenntrasi terdapat penurunan intensitas cahaya yang menurun sehingga

mengakibatkan terdapat kenaikan absorbansi larutan terhadap sinar yang datang pada panjang

gelombang 520 nm.

Kemudian data yang diperoleh hasil spektrofotometer absorban Kobalt Nitrat dapat

dilihat pada Tabel 2. Metode yang digunakan dalam percobaan ini menghitung persamaan

garis dengan metode grafik, kadar larutan Kobalt Nitrat sebagai sumbu x dan absorban

sebagai sumbu y, sehingga persamaan garisnya adalah Persamaan diperoleh : 0,18362x +

0,01043

Pada kurva standar “Hubungan Konsentrasi Larutan dan Absorbansi Kobalt Nitrat”

menunjukkan bahwa peningkatan kadar larutan berbanding lurus dengan absorbansi pada

panjang gelombang () 520 nm, sehingga hukum Beer-Lambert berlaku yaitu jumlah cahaya

yang diserap oleh suatu larutan pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan kadar

senyawa dalam larutan.

Kemudian dilakukan pengujian larutan bromofenol blue yang belum diketahui

konsentrasi dengan terlebih dahulu menentukan panjang gelombang larutan tersebut dengan

memasukkan nilai a, b, dan Y (absorbansi) pada persamaan yang telah didapatkan

sebelumnya. Sehingga didapatkan hasil untuk konsentrasi larutan pertama adalah 0, 659 %,

1, 224 %, 2,234 %. Konsentrasi tersebut jika dimasukkan kedalam grafik persamaan tersebut

sesuai dengan absorbansi yang seharusnya dimiliki.

G. Kesimpulan

Dari pengujian tersebut terbukti dari pernyataan hukum beer lambert bahwa semakin

tinggi konsentrasi larutan maka cahaya monokromatis yang diteruskan semakin sedikit dan

absorbasni semakin tinggi.

PRAKTIKUM IV

PENETAPAN KADAR PROTEIN PADA λ 280 (METODE WARBURG-CHRISTIAN)

A. Teori

Banyaknya protein yang terkandung dalam suatu sampel perlu kita ketahui ketika

akan memurnikan protein. Suatu metode pengukuran digunakan untuk mengetahui

konsentrasi atau jumlah suatu substansi dalam sampel. Sejumlah metode pengkuran kadar

protein telah banyak dikembangkan , dan beberapa metode seringkali digunakan dalam

penelitian, di antaranya adalah Metode Lowry, Commasine Blue, Absorbansi 280 nm, dan

Metode Warburg-Christian.

Protein menyerap cahaya pada daerah ultraviolet dengan panjang gelombang 280nm.

Serapan cahaya terutama disebabkan oleh adanya residu asam amino triptofan dan tirosin

yang terdapat dalam protein tersebut.

Beberapa reaksi kimia penting pada asama amino disebabkan oleh gugus karboksil

dan gugus amino di dalamnya. Gugus karboksil asam amino dapat :

1. Membentuk ester dengan adanya alkohol

2. Membentuk peptida dengan gugus amino asam amino lainnya dengan ikatan

peptida

3. Gugus karboksil asam amino dapat terdekarboksilasi baik secara kimia maupun

secara biologis membentuk amina (Toha, 2009).

Metode umum ini hanya mengambil larutan protein murni, masukkan ke dalam

spektrofotometer, kemudian baca serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Namun pada

kenyataannya, bukan hanya protein yang bisa terbaca pada panjang gelombang 280 nm,

melainkan juga banyak senyawa lain yang bisa terserap pada panjang gelombang tersebut

(Whitford, 2005). Kontaminan yang paling banyak yang seringkali mengganggu pengukuran

kadar protein adalah asam nukleat.

Metode Warburg-Christian dikembangkan untuk menghilangkan gangguan asam

nukleat dalam pengukuran kadar protein, sehingga yang terbaca hanya absorbansi protein

saja. Asam nukleat diserap dengan baik pada panjang gelombang 260 nm sedangkan protein

tidak. Metode ini didasarkan pada faktor koreksi dari perbandingan absorbansi 280 nm

sampai 260 nm. Metode Warburg-Christian menggunakan absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm dan 280 nm untuk menghitung kadar protein. Tujuan penggunaan kedua

nilai tersebut adalah untuk menghilangkan pengaruh kontaminan asam nukleat dalam sampel

yang mengandung protein.

Metode ini kurang spesifik dibandingkan dengan metode kolorimetri, tetapi

keuntungannya larutan uji tidak rusak sehingga dapat dikumpulkan dan digunakan kembali.

Senyawa yang dapat mengganggu adalah asam nukleat. Dibanding protein , pergram asam

nukleat menyerap cahaya lebih besar sepuluh kali.

B. Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk menetapkan kadar larutan protein pada larutan uji

menggunakan metode Warburg-Christian pada panjang gelombang 280nm.

C. Alat dan Bahan

1. Larutan standar albumin sapi (BSA) mengandung 1mg/mL

2. Larutan uji protein (uji 1 diencerkan 800 kali, uji 2 diencerkan 400 kali)

3. Alat spektrofotometer

4. Peralatan gelas

5. Pipet.

D. Pelaksanaan

TABUNG STANDAR UJI0 50 100 150 200 300 400 500

Standar BSA 1mg/mL 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5akuades(ml) 1 0.095 0.9 0.85 0.8 0.7 0.6 0.5larutan uji 1 dan 2 (ml) 1

1. Baca serapan pada panjang gelombang 280nm2. Buat kurva standar BSA dengan menggunakan kadar BSA sebagai sumbu x dan

serapan sebagai sumbu y3. Hitung kadar protein larutan uji dengan membandingkan serapan larutan uji terhadap

kurva standar BSA.

E. Hasil

Tabel 1. Data Absorbansi Seri Larutan Standar BSA

Kadar larutan

Absorbansi 1

Absorbansi 2

Rerata Absorbansi

0 0 0 0

50 0.033 0.032 0.03250100 0.063 0.067 0.06500150 0.088 0.087 0.08750200 0.115 0.119 0.11700300 0.173 0.178 0.17550400 0.228 0.227 0.22750500 0.283 0.289 0.28600

0 100 200 300 400 500 6000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.000564736842105263 x + 0.00386842105263156

Kurva Standar BSA

kadar BSA

sera

pan

Gambar 1. Kurva Standar BSA

Untuk mengetahui kadar protein pada larutan uji kita harus mencari persamaan garis kurva standar tersebut dengan cara sebagai berikut:

Tabel 2. Data Perhitungan Kurva Standar

 Nomor

X (kadar larutan)

Y (absorbans

i) XY X2

 1 0 0 0 0 2 50 0.03250 1.625 2500

 3 100 0.06500 6.5 10000 4 150 0.08750 13.125 22500 5 200 0.11700 23.4 40000 6 300 0.17550 52.65 90000

 7 400 0.22750 9116000

0

 8 500 0.28600 14325000

0JUMLAH(Σ) 1700 0.99100 331.3

575000

a=N ¿¿

a=8 (331.3 )−(1700 )(0.991)

8 (575000 )−(1700)2

a= 965.71710000

=0.00056

b=¿¿

b=(0.991 ) (575000 )−(1700 )(331.3)

8 (575000 )−(1700)2

b= 66151710000

=0.00387

Jadi persamaan garis yang didapat:y = 0.00056 x + 0.00387

Tabel 3.Hasil pembacaan absorbansi larutan ujilarutan Absorbansi 1 Absorbansi 2 Rerata absorbansiU1 0.082 0.081 0.0815U2 0.164 0.160 0.162

untuk uji 1(U1) --> y = 0.00056 x + 0.003870,0815 = 0.00056 x + 0.00387X =(0,0815-0,00387) : 0,00056X = 138,625μg/ml

Karena dilakukan 800 kali pengenceran maka kadar protein larutan uji 1 adalah138,625 x 800 = 110900μg/ml

= 110,9 mg/ml

untuk uji 2(U2) --> y = 0.00056 x + 0.003870,162 = 0.00056 x + 0.00387X =(0,162-0,00387) : 0,00056X = 282,375 μg/ml

Karena dilakukan 400 kali pengenceran maka kadar protein larutan uji 2 adalah282,375 x 400 = 112950μg/ml

= 112,95 mg/ml

F. Pembahasan

Secara umum, protein meyerap cahaya pada daerah ultraviolet dengan panjang

gelombang 280 nm yang disebabkan oleh adanya interaksi antara radiasi ultraviolet dengan

elektron-elektron pada cincin aromatik dari asam amino seperti triptofan, tirosin, penilalanin,

dan sistein. Seperti juga semua senyawa organik, reaksi kimia asam amino mencirikan gugus

fungsionil yang terkandung. Karena semua asam amino mengandung gugus amino dan

karboksil, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugus tersebut

(Lehningger, 1982).

Metode Warburg-Christian dapat meminimalkan gangguan asam nukleat dalam

pengukuran kadar protein, sehingga yang terbaca hanya absorbansi protein pada panjang

gelombang 280 nm. Asam nukleat diserap dengan baik pada panjang gelombang 260 nm

sedangkan protein tidak. Metode ini didasarkan pada faktor koreksi dari perbandingan

absorbansi 280 nm sampai 260 nm. Metode Warburg-Christian menggunakan absorbansi

pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm untuk menghitung kadar protein. Tujuan

penggunaan kedua nilai tersebut adalah untuk menghilangkan pengaruh kontaminan asam

nukleat dalam sampel yang mengandung protein. Daya serap pada λ 280 nm ini bisa

digunakan untuk mengukur kandungan protein antara 50 – 500 µg/mL tanpa kehadiran

bahan-bahan gangguan (kontaminan).

Pada praktikum ini dilakukan pengujian kadar protein pada larutan uji (U1 dan U2, ).

Metode ini (Warburg-Christian) menggunakan spektrofotometer, dimana larutan uji dibaca

serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Hasil pembacaan masing-masing sampel

kemudian dibandingkan dengan kurva standar yang telah dibuat dari larutan BSA dengan seri

standar 0 sampai 500 µg/mL. Pembacaan absorbansi sampel dilakukan secara duplo untuk

memperoleh keakuratan data pengamatan.

Dari hasil penentuan kadar protein dengan metode Warburg-Christian terhadap larutan

BSA, diperoleh persamaan linear = 0.00056 x + 0.00387. Dari persamaan ini, kemudian

kadar protein dari masing-masing larutan uji ditentukan, caranya dengan mengganti nilai y

menjadi nilai absorbansi dan x sebagai kadar protein dalam mg/mL yang ditanyakan. Untuk

sampel larutan uji U1, diperoleh kadar protein sebesar110,9 mg/ml . Untuk U2 diperoleh kadar

protein sebesar 112,95 mg/ml. Kadar dari masing-masing sampel tidak begitu jauh berbeda

meskipun telah mengalami pengenceran yang berbeda. Ini mungkin disebabkan karena

tingginya pengenceran yang diberikan pada larutan uji.

G. Kesimpulan

Beradasarkan hasil pengamatan dan perhitungan kadar porotein yang dilakukan

menggunakan metode Warburg-Christian, diperoleh persamaan garis lurus untuk kurva

standar BSA y = 0.00056 x + 0.00387. Dari persamaan ini maka kadar protein dari larutan uji

dapat ditentukan. Untuk uji 1 kadar protein sebesar 110,9 mg/ml, sedangkan uji 2 sebesar

112,95 mg/ml.

PRAKTIKUM V

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN MIKROASSAI (BRADFORD)

A. Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dalam larutan uji

berdasarkan metode Bradford.

B. Landasan Teori

Protein merupakan komponen penting yang bertindak sebagai building block pada

hampir semua makhluk hidup. Protein terdiri atas sejumlah unsur kimia, antara lain 50%

karbon, 7% hydrogen, 23% oksigen, 16% nitrogen, 3% belerang, dan 3% fosfor. Hidorlisis

protein oleh asam atau enzim dapat menghasilkan asama-asam amino. Sejauh ini, telah

diketahui terdapat 20 jenis asam amino (Stoschek 1990: 111--116).

Pengukuran kadar protein umumnya dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara

kuatitafif dan kuantitatif. Contoh metode yang termasuk dalam kategori kualitatif antara lain

reaksi Xantoprotein, Hopkins-Cole, Millon, dan sakaguchi, sedangkan yang termasuk dalam

kategori kuantitatif antara lain metode Kjeldahl, Lowry, dan Bradford. Pada percobaain ini

dilakukan pengukuran kadar protein dalam suatu larutan dengan metode Bradford. Metode

Bradford merupakan metode analisa kadar protein yang didasarkan pada pengukuran

absorbansi protein dalam suatu larutan yang telah ditambahkan pewarna Coomassie Brilliant

Blue (CBB) (Gambar 1) (Stoschek 1990: 111--116).

Gambar 1. Metode Bradfor dengan menggunakan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB)

Pengikatan antara protein dan pewarna tersebut menyebabkan perubahan warna

CBB yang berwarna merah dalam kondisi asam menjadi biru. Selama proses pengikatan

kompleks protein dan pewarna, terjadi pemberian elektron bebas dari perwarna CBB merah

ke protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin,

triptofan, dan fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Hal tersebut

menyebabkan lapisan hidrofobik protein berikatan dengan bagian non-polar pewarna melalui

gaya van der waals yang berujung pada mendekatnya posisi positif protein ke bagian yang

bermuatan negatif dari pewarna CBB (Gambar 2) (Bradford 1976: 248--254).

Gambar 2. Kompleks pengikatan antara protein dan pewarna Coommassie Briliant Blue

Pengikatan protein menyebabkan perubahan warna dari merah kecoklatan (reagen

coomassie dalam keadaan bebas) dengan (Amax = 465 nm) menjadi biru dengan (Amax =

595 nm). Perubahan menjadi warna biru tersebut terus bersifat stabil karena terjadinya

penstabilan anion dari pewarna biru commassie oleh kation dari pewarna merah coomassie

(Gambar 3).

Gambar 3. Perubahan warna pewarna coommassie dari merah ke biru

Terdapat dua jenis assay protein dengan metode Bradford ini, yaitu standard assay

yang cocok digunakan untuk pengukuran kadar protein dengan kisaran 10--100µg, dan

microassay yang dapat mendeteksi protein dengan kisaran 1--10µg. Metode Bradford

memiliki ketelitian yang cukup tinggi, cepat, dan efisien dengan pengikatan protein dan

pewarna terjadi setelah kurang lebih 2 menit, serta stabilitas warna yang dapat berlangsung

selama kurang lebih 1 jam (Experimental Biosciences 2011:1).

C. Alat dan Bahan

Alat:

1. Alat spektrofotometer

2. Peralatan gelas

3. Pipet mikro

Bahan:

1. Zat warna biru (Bio-Rad Lab) yang dilarutkan dalam asam fosfat dan methanol

2. Larutan standar albumin sapi (BSA) (25µg/mL)

3. Larutan uji: serum

D. Cara Kerja

1. Menyiapkan tabung reaksi dan memipetkan sebagai berikut (Duplo):

Tabung Standar Uji 1 Uji 21 2 3 4 5 6

0 µg/mL

2,5 µg/mL

5 µg/mL

10 µg/mL

15 µg/mL

20 µg/mL

Standar BSA (25 µg/mL)

- 0,1mL 0,2mL 0,4mL 0,6mL 0,8mL

Larutan uji protein

- - - - - -0,8mL

0,8mL

Akuades 0,8 mL 0,7 mL 0,6 mL 0,4 mL 0,2 mL -Larutan warna

0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL0,2 mL

0,2 mL

2. Menggunakan kuvet 1mL, dilakukan pembacaan serapan pada panjang gelombang

595nm dengan tabung 1 sebagai blanko

3. Analisa hasil

E. Hasil Pengamatan

Kesimpulan

PRAKTIKUM VI

UJI PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS

A. Teori

Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi

peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono

Unsaturated Fatty Acid ). Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam

lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat

terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen

dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal

anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan

dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu

reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain

dan oleh sistem antioksidan tubuh.

Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA).

Malondialdehid (MDA) merupakan salah satu senyawa produk dari reaksi peroksidasi lipid yang

digunakan sebagai marker (petanda) terjadinya stress oksidatif. Pada keadaan stress oksidatif yang

tinggi, terjadi peningkatan kadar MDA serum secara signifikan. Bila keadaan stress oksidatif teratasi,

kadar MDA kembali menurun. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu

akan membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm.

B. Tujuan

Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis.

C. Alat dan Bahan

1. Serum

2. Larutan Asam Trichloro acetat (TCA 10 %)

3. Larutan TBA 0,67 %

4. Aquades

5. Sentrifugator

6. Penangas air

7. Vortex

8. Spektrofotometer

D. CARA KERJA

1. Pipetkan ke dalam tabung-tabung reaksi sebagai berikut, lalu dibuat duplo untuk tiap larutan uji

dan blanko.

Bahan Uji BlankoSerum 1 mL -Aquadest - 1 mLLar. TCA 10 % dingin

2 mL 2 mL

2. Dikocok dengan vortex, dipisahkan dengan sentrifugator, dan diambil supernatannya.

Lalu tambahkan larutan TBA 0,67%

Lar. TBA 0,67 % 3 mL 3 mL

A. Dimasukkan ke dalam penangas air yang sedang mendidih selama 10 menit, lalu didinginkan.

B. Dilakukan pembacaan nilai serapan tiap larutan uji dan blanko pada panjang gelombang 532 nm.

C. Catat nilai hasil pembacaan. Untuk hasil pembacaan tiap pasangan duplo nilainya dirata-rata.

E. Hasil Pengamatan

AbsorbansiBlanko U1 U2

1 0 0,11 0,122 0 0,14 0,13Rata-rata 0 0,125 0,125Absorbansi larutan uji setelah dikurangi absorbansi blanko

0,11 0,44

Pengolahan Data

Kadar MDA = A .M ɛ

A = Nilai absorbansi sampel dikurangi blanko

ɛ = konstanta yang nilainya tergantung jenis senyawa dan panjang gelombang yang

digunakan

= dalam eksperimen ini, nilai ɛ yang dipakai adalah sebesar 153000 M-1cm-1

BM = 82 gr/L

Kadar MDA Uji 1 = 0,125 . M

153.000

= 0,125 x 82 g/L

153.000

= 10,25 x 10-3 g/mL

153.000

= 10,25 x 10-3 x 109 ng/mL

153.000

= 66,993 ng/mL

Kadar MDA Uji 2 = 0,125 . M

153.000

= 0,125 x 82 g/L

153.000

= 10,25 x 10-3 g/mL

153.000

= 10,25 x 10-3 x 109 ng/mL

153.000

= 66,993 ng/mL

F. PEMBAHASAN

Senyawa peroksida lipid atau lipid peroxide (LP) dapat menyebabkan kerusakan pada

sistem membran di sel. Lipid membran memiliki struktur asam lemak tak jenuh atau

Polyunsaturated fatty acid (PUFA) pada salah satu ekornya. Struktur inilah yang diserang

oleh LP sehingga fluiditas membran menjadi terganggu. Peroksidasi juga dapet mendegradasi

fungsi enzim yang berasosiasi dengan membran. LP menyebabkan inaktivasi pemompaan ion

yang bertanggungjawab terhadap keseimbangan ion pada sel. Akibat yang ditimbulkan

peroksida lipid dapat berimplikasi terhadap munculnya beberapa penyakit, seperti bayi

prematur, diabetes, penyakit Parkison, penyakit Alzeimer, dan sebagainya.6

Senyawa mayor yang dihasilkan adalah lipid hidroperoksida (LOOH) yang cukup

stabil. Reaksi transisi kompleks metal mengkatalisis penguraiannya (Gambar 4). Beberapa

senyawa minor yang dihasilkan LP diantaranya adalah malondialdehida (MDA), 4-

hydroxynonenal (4-HNE) dan beberapa 2-alkenal. MDA yang dihasilkan inilah yang menjadi

prinsip dasar uji kadar peroksida lemak.

Gambar 4 Reaksi peroksida lipid pada sel.

Penambahan TCA bertujuan mengendapkan protein pada darah. Pengendapan protein

dilakukan karena kandungan protein yang terkandung dalam darah dapat mengganggu

penetapan kadar peroksida lipid. Mekanisme yang terjadi yaitu TCA 10 % sebagai agen

pengendap yaitu ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada

pada kondisi sebagai kation hingga membentuk garam protein. Umumnya agen presipitasi

akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa

(membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan

untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada

pemeriksaan awal materi biologis.

Penambahan TBA pada sampel merupakan prinsip dari metode ini. TBA akan bereaksi

dengan peroksida lipid menghasilkan senyawa berwarna pink. Hasil reaksi ini yang akan

diukur dengan spektrofotometer. Kemudian Pemanasan dilakukan dengan tujuan untuk

mempercepat reaksi. Perubahan warna menjadi merah muda pada larutan uji hampir tidak

kasat mata, namun spektofotometer dapat membaca nilai serapan dari larutan tersebut dengan

sensitivitas tinggi.

Hasil perhitungan konversi dari nilai absorbansi menjadi kadar MDA menunjukkan

bahwa pada sampel uji 1 dan 2 memiliki kadar MDA yang sama yaitu 66,993 ng/ml. Nilai

tersebut mencerminkan jumlah MDA yang berikatan dengan TBA. Secara tidak langsung

konsentrasi dari MDA yang didapatkan dari perhitungan di atas mencerminkan aktivitas

peroksidasi dari PUFA menjadi peroksida lipid. Semakin tinggi konsentrasi MDA, semakin

tinggi proses peroksidasi lipid.

G. Kesimpulan

Kadar peroksida lipid MDA yang terkandung di dalam kedua serum uji sama yaitu

66,993 ng/ml, sehingga aktivitas peroksidasi lipid pada kedua sampel sama besar.

Referensi :

Harvey D. Modern Analytical Chhemistry. New York: McGraw-Hill Companies, Inc; 2000.

Switzer R, Garrity L. Experimental Biochemistry, 3rd ed [E-Book]. New York: W.H.

Freeman and Company; 1999.

Huda N. Pemeriksaan kinerja spektrofotometer UV-VIS GBC 911A menggunakan pewarna

tetrazine CL 19140. Sigma epsilon. 2001 (9): 20-21.

Boyer R. Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed[E-Book]. California: Addison Wesley

Longman Inc; 2000.

Devasagayam TPA, Boloor KK, Ramasarma T. Methods for Estimating Lipid Peroxidation: An Analysis of Merits and Demerits. Indian J Chem Biophys. 2003. (40): 300-308.