I. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang Pembuatan Bibit Secara Kultur JaringanKultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.Dalam program perbanyakan benih penggunaan benih bebas pathogen /berkualitas mutlak diperlukan. Bibit kentang merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk bisa menghasilkan produksi yang tinggi disamping faktor-faktor yang lain. Apalagi bibit kentang dalam budidaya kentang merupakan salah satu faktor biaya yang cukup tinggi.Benih tersebut dapat diperoleh melalui teknik kulturjaringan dengan teknik perbanyakan cepat untuk mmeproduksi stek in vitro.

1.2 Tujuan Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan Untuk mengetahui pembuatan media perbanyakan secara in vitro Untuk mengetahui metode penanaman dan inokulasi eksplan pada kultur jaringan Untuk mengetahi cara kerja dari perbanyakan bibit kentang melalui perbanyakan in vitro

II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 Pengenalan Alat dan Pembuatan Larutan Induk2.1.1 Pengenalan alat dan ruang LaboratoriumDalam Laboratorium bioteknologi terdapat tiga ruang yang digunkan untuk praktikum kultur jaringan. Ruang I adalah ruang pembuatan media dan penyimpanan bahan kimia, berisi peralatan: kulkas (refrigator). Timbangan analitik, oven, dan almari penyimpanan alat dan bahan. Kemudian pada ruang II merupakan ruangan penanaman, berisi: alat penanaman (Laminator Air Flow Cabinet), rak ukur dan alat penggojog. Sedangkan pada ruang ke III adalah ruangan biakan/inkubasi yang berisi: AC, rakkultur, sertalampu TL (Rahardja, 1995).2.1.2 Pembuatan Larutan IndukLarutan induk adalah larutan yang akan dijadikan bahan dasar media tanam in vitrodimana terdiri dari larutan induk senyawa makro, larutan induk senyawa mikro, larutan induk senyawa besi dan unsurunsur vitamin serta zat pengatur tumbuh (Santoso, 2004).

2.2 Jenis-jenis media pada kultur jaringanMedia biakan pada kultur Jaringan tidak berbeda jauh dengan media tanah untuk media konvensional. MenurutReinertdan Bajaj (1977), media yang akan dipergunakan harus mengandung unsurunsur yang dibutuhkan bagi pertumbuhan tanaman yakni unsur makro, unsur mikro, unsur vitamin dan zat pengatur tumbuh. Media kultur jaringan sangat banyak jenisnya, dimana tiaptiap jenis media tersebut cocok bagi jenis tanaman tertentu pula. Jenis media kultur jaringan :a. Media Knop: Untuk menumbuhkan kalus, kultur kalus biasanya ditumbuhkan pada media konsentrasi garam yang rendah seperti kultur akar.b. Media White: Dikembangkan Kuldeprant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, unsur tersebut lebih tinggi daripada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau.c. Media Knudson dan Media Vaan and Went: Media ini dikembangkan untuk kultur anggrek. Penambahan 7,6mm NH4+ disamping 8,5mm NO3- sangat baik untuk perkecambahan dan pertumbuhan.d. Media MS: Perbaikan komposisi media skoog terutama kebutuhan garam organik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur.e. Media BS: Untuk kultur jaringan kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dari media MS.f. Media Schenk dan Hildebrant (SH): Media yang cukup terkena, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil.

2.3 Penanaman dan inokulasi eksplanPelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. MenurutWetherel (1975), yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Bahan tanam kultur jaringan berasal dari bagian tanaman atau jaringan tanaman, baik berupa meristem, pucuk maupun ruas yang dinamakan explant. Biasanya explant berasal dari jaringan tanaman yang masih aktif membelah, dan pada tujuan pembiakan tanaman secara mikropropagasi ini diambil organ tanaman yang bukan berasal dari organ generatif. Explant yang akan ditanam (diinokulasi) pada media kultur jaringan harus dalam keadaan steril bebas mikroorganisme. Pemisahan bagian tanaman dan proses sterilisasinya disebut isolasi. Sterilisasi dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi kultur jaringan juga harus steril (Hendaryono, 1998).

2.4 AklimatisasiAklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif(Willianms, 2003).

III. MATERI BAHASAN3.1 Pembuatan Media Perbanyakan (Inokulasi/Penanaman)3.1.1 Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)Menyiapkan bahan dasar (stokmakro, stokmikro, Fe-EDTA, vitamin)

Menentukan volume media (250 ml) -> 500 ml

Mencampur bahan dasar kedalam beaker glass

Menambahkan sukrosa 7,5 gr/250 ml, Tambahkan aquades steril hingga volume 250 ml, Tambahkan casein hydrolisate 0,029/250 ml

Mengukur pH 5,8 ( Ph< 5,8 = NaOH : Ph> 5,8 = Hcl)

Menambahkan agar 1,725 gr/250 ml sambil dipanas kan hingga mendidih

Mengaduk hingga homogen

Setelah mendidih, angkat dan dibagikan kemasing-masing botol kultur sebanyak kurang lebih 16 ml

Masukkan dalam autoclave dengan suhu 121 C dan tekanan 15 psi selama 20 menit

Note : 100 x vitamin 25 ml = D = 5 ml / 500 ml100 x Fe-EDTA 2,5 ml = C = 5 ml / 500 ml

3.1.2 Hasil Dan PembahasanBerdasarkan hasil pengamatan mengenai media yang telah dilakukan dan dibuat serta digunakan pada praktikum setelah kelompok Senin, 4 Mei 2014 pukul 06.00dapat disimpulkan bahwa pada semua botol masih dalam kondisi normal tidak terdapat kontaminan. Pada media tersebut tidak terlihat adanya kerusakan pada media ataupun bakteri yang terdapat pada masing-masing botol. Sehingga dapat diketahui bahwa media tersebut masih dalam keadaan steril. Keberhasilan dalam pembuatan media tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor yaitudalam penanaman eksplan semua alat-alat yang digunakan harus steril untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang merupakan hal yang dapat menyebabkan kegagalan dalam penanaman eksplan pada media. Hal ini sesuai dengan pendapat Gunawan dalam Kusumaningrum (2007) yang menyatakan bahwa kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Selain peralatan yang digunakan yang perlu disterilisasi maka ruangan yang digunakan juga harus dalam keadaan aseptic. Hal ini sesuai pendapat Rahardja (1995) yang menyatakan, keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Sterilisasi lingkungan penyimpanan juga sangat mempengaruhi. Oleh karena itu keberadaan botol tersebut dalam ruangan penyimpanan harus benar-benar diperhatikan dan dijaga. Alat-alat yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya pada autoklaf (Street, H. E, 1973).

3.2 Penanaman/Isolasi Dan Inokulasi Eksplan3.2.1 Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)Menyiapkan bahan tanam (kentang, krisan, mawar) potong sesuai ukuran ruas

Mencuci dengan air yang mengalir

Buat larutan deterjen 15 % dikocok selama 5menit (15ml deterjen+85 ml air)

Membuat larutan Benlate 0,2 gr / 100 ml dikocokselama 10 menitBuat larutan Clorox 10 % dikocok selama 5 menit (10 ml bayclin + 90 ml air)

Membilasdenganaquades

Memasukkan kedalam Laminator Air Flow Condition (LAFC)

Membilas dengan aquades steril dua kali ulangan

Memotong bagian eksplan yang rusak

Menanam dalam LAFC pada media tanam

3.2.2 Hasil Dan PembahasanDokumentasi% Eksplan yang hidup% Inisiasi tunas% Inisiasi akar% Kontaminasi

Pengamatan 1

100 %Belum tumbuh tunasBelum tumbuh akar0 %

Pengamatan 2

50 %Tidak tumbuh tunasTidak tumbuh akar50 %

Pengamatan 3

0 %Tidak tumbuh tunasTidak tumbuh akar100 %

1. % Eksplan yang hidupEksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan untuk perbanyakan tanaman dengan metoda kultur jaringan (kultur in vitro) adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll. Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan selama 2 minggu, media mulai terkontaminasi jamur/cendawan dan eksplan tidak tumbuh tunas maupun akar. Sehingga tidak banyak menunjukkan perkembangan dan pertumbuhan dari eksplan itu sendiri, sehingga dinyatakan gagal.Menurut literatur, eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi, tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur seperti media danalat harus steril. Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian si pelaksana. Alat-alat yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya pada autoklaf (Street, 1973).2. % Inisiasi tunas dan hari ke berapa tunas munculTunas merupakan bagian tanaman yang diperoleh dari cara perbanyakan vegetatif, yang tumbuh dalam rangka melangsungkan keturunan pada tanaman tersebut.Terbentuknya tunas menunjukkan keberhasilan regenerasi eskplan yang diinokulasi pada media kultur jaringan. Namun pada pengamatan selama 2 minggu tersebut, subkultur dari tanamana kentang yang saya tanam pada media kultu terkontaminasi dan tidak tumbuh. Sehingga presentase inisiasi tunas adalah 0%. Menurut hasil penelitan Bahrudin et al (2012) menyatakan bahwa pertumbuhan atau inisiasi tunas tanpa perlakuan ZPT eksogen rata rata 4,65 hari sedang pada penelitian Yusnita menunjukkan bahwa inisiasi tunas pada perlakuan periode gelap 0 hari (kontrol) dimana ekplan diberi perlakuan pada kondisi normal menunjukkan bahwa persentase inisiasi tunas pada krisan sebesar 8%. Tidak terdapat inisiasi tunas, karena sudah kontaminasi pada pengamatan pertama.3. % Inisiasi akar dan hari keberapa akar munculJika banyak tunas sudah dihasilkan, tahap selanjutnya adalah inisiasi akar in vitro.Namun presentase inisiasi akar dan munculnya tidak menunjukkan perkembangan, selama pengamatan belum terlihat daun maupun akar yang tumbuh. Seperti yang sudah dijelaskan diatas, subkultur yang saya amati tidak tumbuh dan terkontaminasi. George dan Sherrington (1984) menyatakan bahwa inisiasi tunas dan akar ditentukan oleh konsentrasi sitokinin dan auksin yang diberikan ke dalam media dan interaksinya dengan sitokinin atau auksin endogen yang dikandung oleh eksplan. Berdasarkan hasil penelitian Hoque (2010) menunjukkan bahwa inisiasi akar pada eksplant menunjukkan perbedaan yang dipengaruhi oleh varietas pada media ms standar. Tidak terdapat inisias akar, karena sudah kontaminasi pada pengamatan pertama.4. % KontaminasiDalam praktikum kultur jaringan dengan menggunakan subkultur kentang, presentase kontaminasi 95%, media untuk penanaman kultur jaringan mulai terkontaminasi jamur dengan adanya hifa berwarna putih. Menurut Santoso dan Nursandi (2004) tingkat kontaminasi media berbanding lurus dengan tingkat kekayaan unsur hara dalam media yaitu semakin diperkaya suatu media makatingkat kontaminasinya juga semakin besar, demikian pula sebaliknya semakin sederhana suatu media makatingkat kontaminasinya juga semakin kecil. Pada umumnya, kontaminasi karena jenis media disebabkan karena kontaminasi mikroorganisme dari lingkungan luar dan yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, jika mikroorganisme dari lingkungan luar dan eksplan tidak ada maka tidakakan terjadi kontaminasi media dan eksplan.Dokumentasi

3.3 Pembuatan Stok Media MSPada praktikum yang telah dilakukan, pembuatan media dengan menggunakan Murhasige dan Skoog. Komponen yang digunakan yaitu unsur makro A 10x25 ml dengan50 ml/500 ml; unsur mikro B 10x2,5 ml dengan 5 ml/500 ml; vitamin 100xdengan5/500 ml; dan1 00x Fe-EDTAdengan5/500 ml; 2,5 ml. setelah menyiapkan stok makro, mikro, Fe-EDTA dan vitamin, tentukan volume media 250 ml dengan 500 ml. Mencampur bahan kasar kedalam beaker glass dan tambahkan sukrosa 7,5 gr/250 ml. Lalu menambahkan aquades steril sampai 0,029 gr/250ml dan menambahkan casein hrdrolisite. Mengukur pH sampai 5,8, apabila pH < 5,8 maka perlu ditambahkan NaOh, apabila pH > 5,8 ditambahkan HCl. Menambahkan agar 1,725gr/250ml dan mengaduk hingga homogen sambil dipanaskan hingga mendidih. Angkat agar dan bagi kedalam masing-masing botol kultur sebanyak 16 ml. Kemudian autoclave 121oC dengan tekanan 15 psi selama 20 menit (Santoso, 1995).

3.4 AklimatisasiAklimatisasi merupakan kegiatanpemindahan plantlet (tanamankecil) dari media in vitro ke media in vivo (lingkungansebenarnya).Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif (Yusnita, 2005).Pada praktikum kultur jaringan yang telah dilakukan, kultur jaringan yang digunakan dalam praktikum adalah subkultur dengan tanaman kentang sebagai eksplan untuk ditanam dalam media kultur. Dalam 2 minggu pengamatan, terdapat kontaminasi jamur dalam botol kultur sehingga kegiatan kultur jaringan terhadap subkultur kentang yang dilakukan dikatakan gagal. Oleh sebab itu, tidak ada kegiatan aklimatisasi yang saya lakukan untuk memindahkan planlet krisan yang telah tumbuh ke lingkungan luar in vitro.Tanaman aklimatisasi dijaga pada kondisi yang terkontrol selama 15 hari yang kemudian dipindahkan kegreen house dengan naungan hingga semua organ telah berfungsi normal (Khadiga G, 2009).

IV. KESIMPULANDari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa penanaman eksplan haruslah dilakukan dengan steril. Mulai dari alat, perlengkapan dan juga kita yang akan melakukan penanaman. Hal ini dikarenakan kontaminan berupa jamur, bakteri, dll. sangat mudah masuk ke eksplan apabila keadaan tidak steril. Tanaman yang akan ditanam adalah subkultur kentang sebagai bahan tanamnya.Dari pengamatan yang telah dilakukan selama 2 minggu, hasilnya adalah media kultur ditemukan kontaminan berupa jamur/cendawan dengan adanya hifa putih di sekitar subkultursehingga tanaman kentang tersebut tidak dapat tumbuh. Karena media kultur terdapat kontaminasi, sehingga kegiatan aklimatisasi tidak dapat dilakukan.KRITIK DAN SARANUntuk praktikum sudah cukup baik secara keseluruhan, dan cukup menyenangkan. Cuma mungkin lebih ada toleransi lagi untuk pengumpulan laporan.

DAFTAR PUSTAKABahrudin, S., Rand R. Widiastuti. 2002. Workshop on Grain and Feed Quality, Bogor 30 Januari -1 Februari 2002. 48p.Goerge, S. and P.D. Sharrington. 1984. Plant propagation by tissueculture. Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics limited England. P:33-34.Hendaryono, Daisy P dan Wijaya, Ari. 1998. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius:Yogyakarta.Kusumaningrum, I.S. 2007.EvaluasiPertumbuhanIn Vitro danProduksiUmbiMikroBeberapaKlonKentang (Solanumtuberosum L.)HasilPersilanganKultivarAtlantikdanGranola.Skripsi.ProgramStudiHortikulturaFakultasPertanian Bogor.Rahardja, 1995. Plant Cell Culture. New York: BIOS Science Publishers.Reinert and Y.P.S. Bajaj. 1977. Plant, cell, tissue and organ culture. Springer Verlag. New York. 803 p.Santoso, U. dan F. Nursandi. 2004. KulturJaringanTanaman. UniversitasMuhammadiyah Malang Press. Malang.Street, H. E. 1973. Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 320 pages.Wetherel.1975. Tissue Culture for Eksplaned To Plants. University of Chicago : USA.Williams.2003. Teknik Multiplikasi Pada Kultur Organ. Bioteknologi Modern. Biologi : Tissue Culture of Multiplication For organisms. New York : USA.Yusnita.2005.Kultur Organ Tanaman Eksplan. Balai Pengakajian Ilmiah. Universitas Sudirman : Yogyakarta.

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI PRODUKSI BENIH KULTUR JARINGAN

Oleh:Nama : Doni HidayatNIM : 125040207111014Kelompok : Selasa ( 13.20-15.05 )Asisiten : Mba Dasa

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG2014