LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

KUANTITAS MIKROBA : HITUNGAN CAWAN

Rabu, 1 April 2015

Kelompok 2

Rabu, Pukul 13.30 16.30 WIB

Nama NPM Tugas

Winda Ratna Pratiwi 260110130096 Alat dan Bahan, Prosedur,

Pembahasan

Femmi Anwar 260110130097 Tujuan, Prinsip, Teori Dasar

Mega Trinova Durika 260110130098 Editor, Data Pengamatan,

Pembahasan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Shintya) (Benedictus)

KUANTITAS MIKROBA : HITUNGAN CAWAN

I. Tujuan

1. Melatih melakukan pengenceran serial.

2. Menentukan konsentrasi suspensi bakteri dengan metode hitungan cawan.

II. Prinsip

1. Teknik hitung cawan

Salah satu metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah

mikroba langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop

2. Metode pengenceran

Pengenceran adalah penambahan pelarut kedalam suatu larutan jadi pada

prinsipnya jumlah mol zat sebelum dan sesudah diencerkan tetap

3. Teknik aseptis

Teknik aseptis adalah suatu cara yang dilakukan agar tidak adanya

mikroba yang dapt masuk kedalam tubuh yang kemungkinan besar akan

mengakibatkan infeksi. Dalam hal ini, teknik aseptis bertujuan untuk

mengurangi atau menghilangkan mikroorganisme yang terdapat pada

permukaan benda hidup atau benda mati.

4. Inkubasi

Inkubasi adalah proses pertumbuhan biaakan bakteri atau perbanyakan

biakan dengan menyediakan keadaan lingkungan yang sesuai.

Lingkungan dalam hal ini adalah suhu.

III. Teori Dasar

Metode hitungan cawan (TPC) merupakan metode yang paling

banyak digunakan dalam analisa, karena koloni dapat dilihat langsung dengan

mata tanpa menggunakan mikroskop. Feliatra menyatakan bahwa total

bakteri/Total Plate Count (TPC) merupakan salah satu metode yang dapat

digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan. Metode

hitungan cawan (TPC) merupakan metode yang paling banyak digunakan

dalam analisa, karena koloni dapat dilihat langsung dengan mata tanpa

menggunakan mikroskop. Untuk menghitung total bakteri dengan metode

cawan digunakan Nutrient Agar (NA) (Sitorus, 2013).

Menurut Alaerts, G dan Santika, SS (1984), standard plate count

dipergunakan untuk menentukan kerapatan bakteri aerob dan anaerob

fakultatif heterotrop dari air. Penentuan dengan cara ini merupakan

pengukuran empiris saja, oleh karena tiap spesies bakteri membentuk koloni

tersendiri dalam pertumbuhannya. Semua bakteri dari sampel akan tumbuh

pada media tertentu dan setiap golongan bakteri akan tumbuh menjadi satu

koloni yang spesifik, sehingga jumlah bakteri dapat diketahui dengan

menghitung jumlah koloni (Sitorus, 2013).

Media adalah suatu substrat untuk menumbuhkan bakteri yang

menjadi padat dan tetap tembus pandang pada suhu inkubasi (Pelczar et

al.,1986). Alaerts juga menyatakan bahwa pada umumnya dibutuhkan

pengenceran sampel, yang tergantung dari perkiraan populasi bakteri.

Semakin tercemar suatu badan air, semakin tinggi konsentrasi bakteri dan

semakin kecil volume sampel yang diperlukan, agar jumlah koloni dapat

dihitung. Air pengencer yang digunakan harus selalu mengandung garam

nutrient (Sitorus, 2013).

Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient yang

disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang

dipakai bergantung kepada banyak faktor, salah satu diantaranya adalah

macam mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Jika kita ingin mengisolasi

biakan murni bakteri dari mulut kita, maka air liur itu diinokulasikan sedikit

saja pada medium yang cocok sedemikian rupa hingga sel-sel mikroba

tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi. Bahan yang diinokulasikan pada

medium itu disebut inokulum. Dengan menginokulasi medium agar nutrien

(nutrient agar) dengan metode cawan gores atau metode cawan tuang, sel-

sel itu akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikrobe

individu itu memperbanyak diri sedemikian cepatnya sehingga di dalam

waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan

koloni. Koloni ini dapat dilihat oleh mata telanjang. Setiap koloni yang

berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda, setiap koloni

merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme. Jika dua sel mikrobe

pada inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar, maka

koloni yang terbentuk dari masing-masing sel dapat bercampur dengan

sesamanya, atau paling tidak bersentuhan, jadi massa sel yang dapat diamati

itu bukanlah suatu biakan murni (Sutton, 2006).

Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme dilakukan dengan metode

hitungan cawan. Prinsip dari metode ini adalah sel mikroba yang masih hidup

ditumbuhkan pada medium sedemikian sehingga mikroba tersebut akan

berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan

dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Ashad, dkk, 2006).

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel

mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut

akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung

dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat

dibedakan atas dua cara yaitu: metode tuang (pour plate) dan metode

permukaan/sebar (surface/spread plate) (Fardiaz, 1993).

Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk

dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut

dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam

sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor

pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk

menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming

units) (Waluyo 2008).

Jumlah koloni mikroorganisme dihitung berdasarkan Standar Plate

Count (SPC). Metode ini cukup sensitive karena hanya sel mikroorganisme

yang hidup yang dapat dihitung. Selain itu beberapa sel yang berdekatan

dapat dihitun sekaligus sebagai suatu koloni (Ashad, dkk, 2006).

Tujuan pengenceran adalah supaya diperoleh isolat yang tidak begitu

padat dan mewakili semua jenis bakteri yang terdapat pada sampel (Pastra,

dkk, 2012). Semua dilakukan dalam kondisi aseptik dengan menggunakan api

Bunsen (Pastra, dkk, 2012).

Metode cawan tuang untuk memperoleh koloni murni dari populasi

campuran mikroba dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang

telah disterilkan dan dicairkan kemudian didinginkan 50C yang kemudian

dituang ke cawan. Karena kadar sel-sel mikroba di dalam spesimen pada

umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan

beberapa tahap sehingga sekurangkurangnya satu di antara cawan-cawan

tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan ataupun di

dalam agar. Metoda ini memboroskan bahan dan waktu, namun tidak

memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi (USU digital library, 2004).

Sampel diinokulasi dengan metode agar tuang, diambil sebanyak 1 ml

untuk diinokulasi pada media NA dalam cawan petri 15 ml secara aseptik

kemudian diinkubasi pada suhu 37C di dalam inkubator selama 2 x 24 jam

(Pastra, dkk, 2012).

Menurut Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi (2008), bakteri

akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24

jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat

digunakan alat colony counter yang biasanya dilengkapi dengan pencatat

elektronik (Sitorus, 2013).

Perhitungan bakteri dengan metode cawan hitung ini dianggap bahwa

setiap sel yang dapat hidup di dalam media akan tumbuh menjadi suatu

koloni. Sehingga jumlah koloni yang tumbuh atau muncul pada cawan

merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme bakteri yang dapat hidup

yang terkandung didalam sampel. Pemilihan cawan yang digunakan untuk

perhitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 atau 25-250

koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya koloni dalam cawan, maka

diperlukan adanya perlakuan pengenceran terhadapap sampel. Jumlah

organisme yang terdapat didalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan

jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang

terkait (Sutton, 2006).

IV. Alat dan Bahan

4.1. Alat

1. Cawan petri

2. Kapas

3. Labu Erlenmeyer

4. Pembakar Spirtus

5. Pipet volume

6. Rak tabung reaksi

7. Tabung reaksi

4.2. Bahan

1. Aquadest

2. Media Agar

3. Sample uji air minum

4.3. Gambar alat

No. Nama Alat Gambar

1. Cawan Petri

2. Kapas

3. Labu

Erlenmeyer

4. Pipet volume

5. Tabung reaksi

7. Pembakar

Spirtus

V. Prosedur

Pada praktikum ini hal yang pertama dilakukan yaitu alat dan bahan

disiapkan. Alat alat yang sudah disterilisasi yaitu 3 cawan petri, 3 tabung

reaksi dan 1 pipet volume dan bahan bahan seperti sample yang mengandung

bakteri dan aquadest disiapkan. Setelah itu, nyalakan pembakar spirtus.

Dipipet aquadest dan dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi masing masing 9

ml. setelah ketiga tabung reaksi terisi aquadest, di ambil tabung reaksi

pertama kemudian sample sebanyak 1 ml di masukan ke dalam tabung

tersebut. Lalu di homogenkan. Kemudian dari tabung reaksi pertama dipipet

sebanyak 1 ml dan di masukan kedalam tabung reaksi kedua . di homogenkan

lagi. Selanjutnya di pipet kembali sebanyak 1 ml dari tabung reaksi kedua

untuk dimasukan ka dalam tabung reaksi ketiga dan homogenkan. Setelah

itu dari tiap tabung reaksi uji yang di duga mengandung bakteri di pipet 1 ml

dan di masukan ke dalam cawan petri. Dari tabung reaksi pertama dipipet

sebanyak 1 ml dan di masukan kedalam cawan petri pertama lalu beri tanda.

Kemudian dari tabung reaksi kedua dipipet sebanyak 1 ml dan di masukan ke

dalam cawan petri kedua dan beri tanda. Selanjutnya dipipet sebanyak 1 ml

dari tabung reaksi ketiga lalu di asukan ke dalam cawan petri ketiga dan beri

tanda. Semua perlakuan tersebut dilakukakn dekat dengan nyala api. setelah

itu, ke dalam setiap cawan petri di tuangkan media agar lalu homogenkan.

Setelah media tersebut padat cawan petri di balikan tujuannya dan dibungkus

dengan menggunakan koran untuk di inkubasi.

VI. Data Pengamatan

No. Konsentrasi Setelah Inkubasi

1. 1 x 10-1

2. 1 x 10-2

3. 1 x 10-3

VII. Perhitungan

= (780 10) + (576 100) + (318 1000)

3

=7800 + 57600 + 3180000

3

=383400

3= 127800

VIII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pengenceran dan menentukan

konsentrasi dengan metode cawan hitung. Metode hitungan cawan diperlukan

untuk menghitung suatu koloni bakteri, sehingga diketahui jumlah total

bakteri yang terkandung dalam suatu sampel air minum. Jumlah bakteri yang

dapat tumbuh dalam medium ditunjukan dalam bentuk suatu koloni atau CFU

(colony forming unit) dari suatu sel bakteri.

Perhitungan bakteri menggunakan sistem koloni, hal ini disebabkan

koloni merupakan bagian terkecil yang bisa dihitung secara kasat mata dari

bakteri, selain itu koloni adalah representasi dari bakteri yang melakukan

pembelahan dan berkumpul di suatu tempat. Setelah di dapat koloni yang

tumbuh pada media agar, kemudian dapat diketahui jumlah koloni bakteri

setelah proses inkubasi selama 24 jam (pelchzar, 2006).

Pada praktikum kali ini alat alat yang di gunakan harus di sterilisasi

dengan menggunkan autoklaf. Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu

proses untuk mematikan semua organism yang terdapat pada atau didalam

suatu benda. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin diamati dan diisolasi

terbebas dari mikroba lain. Suatu bahan atau alat dikatakan steril bila alat atau

bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk sel vegetative ataupun

spora. Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebbas dari

kontaminasi mikroorganisme lain (dwidjoseputro, 2005).

Alat dan bahan disiapkan, aquadest sebanyak 9 ml di pipet lalu di

masukan ke masing-masing tabung reaksi. Pada ujung pipet volume di

masukan kapas bebas lemak dengan tujuan agar bakteri yang terdapat dalam

sampel tidak terhirup oleh mulut serta bakteri dari mulut juga dapat disaring

oleh kapas.. Apabila ada mikroorganisme yang masuk maka akan terjerap

lebih dulu dengan sumbat kapas.

Setelah ketiga tabung terisi dengan aquades selanjutnya sampel yang

berupa air minum dipipet sebanyak 1 ml dan di masukan ke tabung reaksi

pertama dan akan dilakukan pengenceran bertingkat. Pengenceran digunakan

karena untuk menumbuhkan bakteri pada media yang terbatas tidak mungkin

dilakukan perhitungan bakteri yang berjumlah puluhan ribu. Pengenceran ini

di maksudkan untuk mengurangi kepadatan bakteri pada sampel (pelchzar,

2006)

Metode untuk perhitungan ini menggunakan pengenceran berseri atau

pengenceran serial dari sample yang mengandung mikroorganisme. Koloni

bakteri yang muncul akibat pertumbuhan mikroorganisme, diasumsikan

berasal dari satu sel bakteri. oleh karena itu jumlah bakteri pada sampel asal

dapat ditentukan dengan menghitung jumlah kolonidan memperhitungkan

factor pengenceran. (Hadioetomo,1993)

Setelah sampel dimasukan ke tabung reaksi pertama. Di kocok

terlebih dahulu agar sampel yang mengandung bakteri bercampur dengan

aquadest dan homogen. kemudian diambil dari tabung reaksi tersebut

sebanyak 1 ml dan di masukan ke dalam tabung reaksi kedua. Homogenkan

kembali kemudian dipipet lagi 1 ml dan di masukan kedalam tabung reaksi

ketiga lalu homogenkan. Sama halnya seperti perlakuan yang pertama

perlakuan ini dilakukan dekat dengan nyala api agar terhindar dari

kontaminan.

Langkah selanjutnya yaitu mengambil 1 ml dari tabung reaksi tersebut

untuk di masukan ke dalam cawan petri yang sudah di sterilisasi. Sampel pada

tabung reaksi 1 di masukan ke dalam cawan petri 1 begitu pula selannjutnya

sampai tabung reaksi ketiga. Setelah itu masukan media agar kedalam 3

cawan petri tersebut. Pada saat perlakuan tersebut untuk membuka cawan

petri harus hati hati, tidak boleh terlalu lebar dan harus dekat dengan nyala

api agar terhindar dari kontaminasi mikroorganisme lain.

Pada praktikum ini, media yang di gunakan adalah media padat. Untuk

membuat biakan padat, larutan biakan cair ditambahkan bahan pemadat.

Bahan pemadat yang biasa digunakan dan ideal adalah agar. Agar adalah

polisakarida yang disusun kompleks dan teratur yang berasal dari ganggang

laur. Bila di perlukan media biakan padat tanpa komponen organic, maka di

pakai silikogel sebagai bahan pemadatnya. Cawan yang dipilih untuk

perhitungan koloni adalah rentang 30-300 koloni. Untuk memperoleh rentang

tersebut pada satu cawan yang mengandung koloni, maka harus dilakukan

pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam

sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan

factor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Dwidjoseputro, 2003).

Setelah media agar dituangkan kemudian di homogenkan. Tujuannya

untuk mempermudah dalam penghitungan koloni. Setelah padat cawan petri

dibalikan agar pada saat inkubasi uap yang dihasilkan tidak jatuh ke media

agar yang dapat menyebabkan media mencair sehingga pengamatan

pertumbuhan koloni akan terganggu. Kemudian biakan di inkubasi selama

18-24 jam yang tujuannya untuk melihat pertumbuhan bakteri tersebut.

Setelah 18-24 jam, sampel diambil dari inkubator dan dihitung jumlah

koloni bakteri di dalam masing-masing cawan. Saat akan dilakukan

perhitungan terlihat bahwa bakteri pada cawan 10-1 jauh lebih banyak

daripada bakteri pada kedua cawan lainnya. Untuk memudahkan perhitungan,

apabila penyebaran bakteri merata cawan petri bisa dilukis menjadi empat

kuadran. Jumlah koloni pada cawan 1 sebanyak 780 koloni, cawan 2

sebanyak 576 koloni dan cawan 3 sebanyak 318 koloni.

Faktor yang mempengaruhi hasil penghitungan koloni pada metode

ini adalah tingkat pengenceran yang tinggi sehingga menyebabkan koloni

tidak muncul pada media, tingkat pengenceran terlalu rendah sehingga koloni

yang muncul lebih dari 300 koloni, adanya kontaminasi yang bisa saja

dikarenakan alat yang digunakan; lingkungan dan diri kita, kondisi pH dan

suhu yang tidak sesuai (Fardiaz, 2005).

Pada analisis ini digunakan satuan CFU/ml karena pada percobaan ini

yang dihitung adalah koloni bukan sel. Pada metode ini tidak mungkin

dilakukan untuk menghitung sel karena pada metode ini pengamatan

dilakukan dengan mata telanjang (tanpa bantuan mikroskop) sehingga yang

tampak adalah berupa koloni (Fardiaz, 2005).

Kelemahan metode pengenceran adalah keselektifan hasil

perhitungan yang kadang menjadi bias. Kondisi pertumbuhan kontaminan,

termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu dan pH

sangat menentukan bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada

(Harmita dan Maksum Radji 2008).

IX. Kesimpulan

1. Praktikan dapat melakukan pengenceran bertingkat atau pengenceran

serial pada sampel bakteri serta mengetahui konsentrasi dari sampel

bakteri yang telah diencerkan, yaitu 1 x 10-1, 1 x 10-2, 1 x 10-3.

2. Praktikan dapat melakukan perhitungan koloni bakteri yang telah

diinkubasi selama 18-24 jam, yaitu koloni yang tumbuh sebanyak

127800 CFU.

DAFTAR PUSTAKA

Ashad, dkk. 2006. Degradasi Kekuatan Beton Akibat Intrusi Miktoorganisme.

Tersedia online di: http://www.ftsl.itb.ac.id/wp-

content/uploads/2007/12/Hanafi%20(JTS%20Vol.13%20No.3).pdf

(diakses 4 April 2015)

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan.

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT. Raja

Grafindo Persada

Pastra, dkk. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis dengan Spons Jenis

Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau Tegal

Lampung . Tersedia online di :

http://eprints.unsri.ac.id/1256/1/9.Defin_ari_pastra_77-82.pdf (diakses 4

April 2015)

Hadioetomo RS, 1993. Mikrobiologi dasar dalam Praktek Teknik dan Prosedur

Praktikum. Jakarta : Gramedia Pusaka Utama.

Harmita dan Maksum Radji. 2008. Analisis Hayati. Jakarta : Penerbit Buku

Kedokteran EGC.

Pelczar, M.J. & E.C.S. Chan, 1986, Penterjemah , Ratna Siri Hadioetomo. Dasar-

Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : Universitas Indonesia Press.

Plechzar, M.J. 2006. Dasar dasar Mikrobiologi . Jakarta:UI Pres

Sitorus, 2013. Jurnal Ilmiah Fakultas Teknik Limits. Tersedia online:

http://portal.kopertis3.or.id/bitstream/123456789/1630/1/Microsoft%20W

ord%20-Jurnal%20%20Limit%20volume%209%20no.1.pdf (diakses 4

April 2015)