Kloning Gen

Teknologi DNA rekombinan = Kloning gen, Rekayasa genetika, Kloning molekuler Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah-langkah dalam kloning DNA

Teknologi DNA rekombinanBerkembang pada awal tahun 1980. Berakar dari ilmu biokimia dan genetika.Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia.Diterapkan dalam bidang pertanian, peternakan, kedokteran forensik, penelitian penelitian dasar.

Enzim restriksi endonukleaseTeknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease.RE dapat memotong secara simetris ikatan fosfodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.Contoh: EcoRI GAATTC

CTTAAG

Beberapa contoh enzim restriksiEnd sequences

EnzimSekuens pengenalanJenis ujungEcoRI

BamHI

AluI

PstI5-GAATTC-33-CTTAAG-5

5-GGATCC-33-CCTAGG-5

5-AGCT-33-TCGA-5

5-CTGCAG-33-GACGTC-5Sticky, 5 overhang

Sticky, 5 overhang

Blunt

Sticky, 3overhang5-G AATTC-33-CTTAA G-5

5-G GATCC-33-CCTAG G-5

5-AG CT-33-TC GA-5

5-CTGCA G-33-G ACGTC-5

Enzim restriksi endonuklease

Vektor kloningSuatu wadah yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari, untuk transkripsi, invitro mutagenesis, dan sekuensing DNA insert.Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri), bakteriophage, cosmid, YAC, dll.

Vektor

Plasmid pBR322

Syarat vektor kloningDapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host.Mengandung banyak situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan.Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama, disatukan dalam tube yang sama, ditambahkan enzim T4 DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik.Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu.

PCRMetoda untuk memperbanyak fragmen DNA dari gen tertentu secara in vitro.Terdiri dari 3 siklus: denaturasi, annealing, dan elongasi.Membutuhkan enzim DNA polymerase khusus yang tahan terhadap temperatur tinggi (Taq polymerase).

Polymerase chain reactionPCR

Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan

Terapi Gen

DNA Fingerprint

Menghasilkan Tanaman Unggul

Basic Research