LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Disusun oleh: 1. Nur Fatma Sari 2. Raissa Elvina Nanang 3. Utari Oemardy (1006775110) (1006775136) (1006775142)

DEPARTEMEN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA 2011

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang sangat kecil dan sangat penting dalam memelihara keseimbangan ekologi dan ekosistem di bumi. Beberapa mikroorganisme bersifat menguntungkan dan ada pula yang merugikan, baik terhadap manusia maupun hewan. Mikroorganisme yang merugikan inilah yang disebut sebagai mikroorganisme patogen atau penyebab penyakit. Keberadaan mikroorganisme dapat ditemukan di berbagai benda, sediaan farmasi, makanan, alat-alat kesehatan, dan alat-alat laboratorium. Keberadaan mikroorganisme baik patogen maupun non patogen dapat dikurangi bahkan ditiadakan. Dalam praktikum mikrobiologi ini, setiap praktikan harus memperlakukan semua bakteri sebagai patogen. Oleh karena itu alat-alat laboratorium yang digunakan harus selalu dalam keadaan steril. Sterilisasi alat dapat dilakukan dengan sterilisasi kering dan sterilisasi basah, sterilisasi uap, dan penyaringan. Selain itu, dalam praktikum ini juga dibutuhkan suatu media perbenihan untuk membiakkan bakteri. Alat-alat juga harus digunakan secara aseptis dengan selalu bekerja pada daerah api bunsen. Protoplasma bakteri dapat mengikat zat warna secara kimia dan zat warna yang dipergunakan berbentuk garam. Terdapat berbagai jenis pewarnaan, seperti: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan khusus. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan gram terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Keberadaan bakteri dalam suatu sediaan (makanan, minuman, sediaan farmasi) harus dibatasi, karena jika jumlahnya berlebihan akan menimbulkan penyakit. Penentuan jumlah bakteri dalam makanan atau sediaan farmasi menentukan produk tersebut layak beredar di pasaran atau tidak. Jumlah mikroba ini dapat ditentukan dengan penentuan angka kuman. Jenis bakteri dalam sediaan farmasi atau pun makanan dapat diidentifikasi dengan menginokulasikan suspensi atau pun biakan bakteri dalam MSA, SSA, Centrimide. Setiap bakteri tumbuh dalam jenis agar yang

spesifik. Seperti Staphylococcus aureus yang hanya tumbuh pada MSA karena dapat meragi manitol. Baik produk makanan ataupun sediaan farmasi seringkali tercemar bakteri patogen. Untuk memastikan jenis bakteri pengontaminasi, dapat dilakukan uji konfirmasi patogen yaitu dengan uji gula-gula biokimia dengan menanam suspensi bakteri pada larutan gula-gula (glukosa, sukrosa, maltosa, manitol, laktosa), uji motilitas, dan uji TSIA. Beberapa sediaan obat seperti tetes mata, injeksi, infus, salep mata tablet, implant harus digunakan dalam keadaan steril. Demikian juga dengan alat-alat kesehatan seperti kasa steril, jarum suntik, benang bedah, juga harus digunakan dalam keadaan steril. Untuk memastikan sterilitas produkproduk tersebut dapat dilakukan ui sterilitas sediaan farmasi. Mikroorganisme dapat mencemari makanan, minuman, kosmetik dan sediaan farmasi. Oleh karena itu pengendalian yang tepat perlu dilakukan. Antibiotik dapat dipilih sebagai option untuk pengendalian mikroorganisme. Tingkat keefektifan suatu antibiotik dapat diprediksi dengan uji penentuan potensi antibiotika dan uji penentuan kadar hambat minimun antibiotika. Selain dengan antibiotik, dapat juga dilakukan pengendalian mikroorganisme secara kimia yaitu dengan menggunakan desinfektan. Efektivitas kerja desinfektan dapat dibuktikan dengan penetuan koefisien fenol.

BAB II PRINSIP 2.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat Setiap alat harus disterilkan sebelum dan sesudah praktikum untuk mencegah kontaminasi bakteri terhadap hasil pengamatan ataupun terhadap pengamat (praktikan). Media perbenihan dapat berupa Agar yaitu Nutrien Broth, Nutrien Agar, Sabouraud Dextrose Agar. Alat-alat yang digunakan harus selalu dalam keadaan steril dengan kerja aseptis pada daerah api. 2.2. Pewarnaan Gram Bakteri gram positif bewarna ungu biru, karena bakteri ini memiliki susunan dinding sel yang kompak dan tebal, sehingga permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal iodium tidak dapat keluar. Bakteri gram negatif bewarna ungu merah, karena bakteri ini memiliki susunan dinding sel yang kurang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang tipis, sehingga permeabilitas dinding sel lebih besar, dan memungkinkan terlepasnya kompleks kristal iodium. 2.3. Penentuan Angka Kuman Sediaan yang telah dihomogenkan dan diencerkan dengan pengenceran yang sesuai ditanam pada media agar, setelah diinkubasi pada 37C selama 24-48 jam dapat dihitung jumlah koloni yang tumbuh. 2.4. Identifikasi Cemaran Patogen Staphylococcus aureus dapat meragi manitol dalam media kaldu nutrisi cair yang mengandung brom-kresol berwarna ungu menjadi kuning. Pada media Manitol Salt Agar (MSA) warna media MSA berubah menjadi kuning. 2.5. Uji Konfirmasi Patogen Menginokulasikan suspensi bakteri Staphylococcus aureus pada tabung reaksi yang masing-masing berisi glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang telah diberi indikasi BTB (Brom Timol Biru) dan pada bagian dasar tabung diletakkan tabung durham; uji motilitas, dan uji dengan

media TSIA. Setelah diinkubasi pada 37C selama 24-48 jam diamati perubahan yang terjadi. 2.6. Uji Sterilitas Pertumbuhan suhu yang sesuai. 2.7. Penentuan Potensi Antibiotik Menginterpolasikan derajat hambatan pertumbuhan kuman uji yang diperoleh secara difusi lempeng agar dan dosis sediaan uji terhadap kurva baku dari dosis-dosis sediaan baku. Rancangan penetapan menggunakan rancangan satu tingkat dengan kurva baku menggunakan 3 dosis larutan baku pembanding (S1, S2, S3) dan 3 dosis larutan uji yang memiliki kadar sama dengan dosis baku (U1, U2, U3). 2.8. Kadar Hambat Minimal Kerja dari suatu antibiotika dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme terlihat dari keruh atau jernihnya larutan, yaitu : (+) : keruh, menandakan adanya pertumbuhan kuman (-) : jernih, menandakan tidak adanya pertumbuhan kuman Kadar hambat minimal dapat dilihat dari tabung yang berisi larutan jernih terakhir sebelum larutan tersebut berubah menjadi keruh pada tabung berikutnya. 2.9. Penentuan Koefisien Fenol Pertumbuhan bakteri uji pada media yang sesuai setelah bakteri tersebut kontak dengan desinfektan dalam waktu 5, 10, dan 15 menit. mikroorganisme dapat dilihat dengan cara menginokulasikan bahan uji ke dalam media tertentu dan diinkubasi pada

BAB III TUJUAN 3.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat a. Sterilisasi alat bertujuan supaya alat-alat yang digunakan dalam praktikum selalu steril dan bebas bakteri. b. Media perbenihan digunakan sebagai media tumbuh bakteri 3.2. Pewarnaan Gram Untuk mengidentifikasi bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. 3.3. Penentuan Angka Kuman Untuk memperkirakan jumlah kuman aerob yang terdapat di dalam semua jenis perbekalan farmasi yaitu: bahan baku obat, produk obat, obat tradisional, makanan, minuman, kosmetika dan alat kesehatan. 3.4. Identifikasi Cemaran Patogen Dapat mengidentifikasi bakteri Staphylococcus aureus. 3.5. Uji Konfirmasi Patogen a. Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan lima jenis gula, yaitu glukosa, laktosa, sukrosa, manitol, dan maltosa. b. Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui kemampuan gerak bakteri c. Uji pada media TSIA bertujuan untuk mengetahui suatu patogen dapat mengoksidasi TSIA yang ditandai dengan terbentuknya warna hitam pada media TSIA (ada FeS). 3.6. Uji Sterilitas Menguji sterilitas sediaan obat dan alat kesehatan. 3.7. Penentuan Potensi Antibiotik Untuk mengetahui potensi antibiotik terhadap mikroorganisme menurut Farmakope Indonesia Edisi III. 3.8. Kadar Hambat Minimal Untuk mengetahui kadar minimal dari suatu antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

3.9. Penentuan Koefisien Fenol Untuk mengevaluasi daya anti mikroba suatu desinfektan dengan memperkirakan potensi/kekuatan dan efektifitas desinfektan, antara lain konsentrasi, lama kontak sebagai pembunuh, atau penghambat pertumbuhan dibandingkan dengan fenol standar.

BAB IV ALAT DAN BAHAN 4.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat Alat: 1. Pipet volume berbagai ukuran 2. Cawan petri 3. Tabung reaksi 4. Bunsen 5. Autoklaf 6. Inkubator 7. Kapas lemak 8. Kertas coklat 9. Pemanas 4.2. Pewarnaan Gram Alat 1. Ose 2. Kaca objek 3. Baskom 4. Botol semprot 5. Pinset 6. Spiritus 7. Tissue 8. Pensil warna 4.3. Penentuan Angka Kuman Alat 1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Labu ukur 250 Ml 4. Cawan petri Bahan 1. Sampel: larutan pembersih wajah 2. Larutan buffer fosfat Ph 7,2 3. Nutrien agar Bahan 1. Kuman : Staphylococcus aureus 2. Zat warna : Karbol kristal ungu Cairan lugol Alkohol 96% Air fukhsin 0,5% 3. Mikroskop Bahan 1. Nutrien agar 2. Aquadest

5. Timbangan 6. Mat pipet 1 mL dan 10 mL 7. Balon pengisap 8. Vortex 9. Spiritus 10. Inkubator 4.4. Identifikasi Cemaran Patogen Alat 1. 4 Cawan petri 2. Tabung reaksi 3. Ose ujung bulat 4. Pembakar spiritus Bahan 1. Bakteri Staphylococcus aureus 2. Media MSA (Manitol Salt Agar) 3. Media SSA (Salmonella Shigella Agar) 4. Media EMBA (Eosin Methylen Blue Agar) 5. Centrimide Agar 6. Nutrien Broth 4.5. Uji Konfirmasi Patogen Alat 1. Tabung reaksi 2. Tabung durham 3. Ose berlubang 4. Ose tak berlubang 5. Bunsen 6. Vortex Bahan 1. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus 2. Larutan glukosa 3. Larutan Sukrosa 4. Larutan Laktosa 5. Larutan Maltosa 6. Larutan Manitol 7. Media gerak 8. Media TSIA

4.6. Uji sterilitas Alat 1. 3 tabung reaksi 2. 1 rak tabung 3. Vortex 4. Pinset ujung tajam 4.7. Penentuan Potensi Antibiotik Alat 1. 12 tabung reaksi 2. Rak tabung 3. Spidol permanen 4. Label 5. Pipet volum 6. Pembakar spiritus 7. Vortex 8. Ose 9. Bakteri filter 10. Suntikan 11. Pipet tetes 12. 4 Labu ukur 25 ml 13. 4 Labu ukur 50 ml 14. Inkubator 15. 6 Cawan petri yang sudah dilapisi base layer 16. Pipet mikro 17. Jangka sorong 18. Penggaris 19. Alkohol 70% sebagai antiseptik dan pembersih 20. Cakram kertas 36 buah 6. Karton 7. Bahan Pembantu NaCl 0,9% 29 ml Buffer Fosfat pH 7,2 Bahan 1. Antibiotik standar : amoksisilin trihidrat 5,74 mg 2. Antibiotik uji : amoksisilin trihidrat 5 mg 3. Staphylococcus aureus ATCC 25923 4. Medium cair 5. Medium Padat Base layer (medium 2) 60 ml Seed layer (medium 1) 24 ml Bahan 1. Media cair tioglikolat 2. Obat tetes mata 3. Kapas beralkohol

8. Larutan Mc Farland III 9. Agar miring

4.8. Kadar Hambat Minimal Alat 1. Tabung reaksi besar 2. Tabung reaksi kecil 3. Pipet ukur 4. Filter bakteri 5. Labu ukur 6. Vortex 7. Ose 8. Inkubator Bahan 1. Kuman standar Staphylococcus aureus 2. Nutrien broth 3. Antibiotik uji: Amoxcilin 4. Air suling steril 5. Larutan buffer fosfat pH 6-8 6. Larutan Mc Farland III (BaSO4 dalam NaOH)

4.9. Penentuan Koefisien Fenol Alat 1. Tabung reaksi 2. Ose 3. Pipet 4. Bunsen 5. Pencatat waktu

Bahan 1. Kuman standar Staphylococcus aureus 2. Kaldu nutrisi 3. Aquadest 4. Larutan NaCl 0,9% 5. Fenol standar 6. Desinfektan

BAB V PROSEDUR KERJA 5.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat 1. Sterilisasi Dengan Api a. Sterilisasi dengan api untuk pipet volume, pipet tetes, cawan petri, dapat sekadar dilewatkan di atas api. b. Sterilisasi dengan api untuk ose dapat dilakukan dengan memijar ose kemudian dilewatkan di atas api. Dengan autoklaf a. Untuk tabung reaksi, tutup bagian berongga dengan kapas lemak, kemudian beberapa tabung reaksi disatukan dan dibungkus dengan kertas coklat. Masukkan ke dalam autoklaf. b. Untuk pipet volume, tutp setiap ujung dengan kapas lemak. Bungkus pipet satu per satu dengan kertas coklat. Masukkan ke dalam autoklaf. c. Untuk cawan petri, satukan 3-4 cawan petri, bungkus dengan kertas coklat. Masukkan ke dalam autoklaf. 2. Pembuatan Media a. Timbang Nutrien agar b. Larutkan dalam aquadest c. Panaskan hingga warna berubah menjadi lebih muda 3. Penggunaan Alat a. Dalam bekerja di laboratorium, alat harus selalu dalam keadaan steril b. Setelah selesai digunakan dalam praktikum, alat seperti pipet volum direndam dalam larutan desinfektan yang telah disediakan. 5.2. Pewarnaan Gram 1. Buat sediaan pada gelas objek, dengan mengambil bakteri meggunakan ose, kemudian taruh dan rekatkan pada gelas objek. 2. Tuang larutan karbol kristal ungu pada sediaan dan biarkan selama 5 menit. 3. Cuci dengan air.

4. Tuangkan cairan lugol selama 45-60 detik, kemudian dicuci dengan air. 5. Cuci dengan alkohol dengan cara mencelupkan ke dalam bejana yang berisi alkohol 96% dan goyangkan selama 30 detik, atau sampai zat warna tidak mengalir lagi. 6. Cuci dengan air. 7. Tuangkan air fukhsin, biarkan selama 1-2 menit, cuci dengan air dan keringkan. 8. Tetesi minyak immersi diatas sediaan, periksa dengan mikroskop. 5.3. Penentuan Angka Kuman Metode tuang (Pour plate) 1. Penyiapan Sampel Tutup botol pembersih wajah dibersikan dengan alkohol 70%, lalu dipanaskan diatas api sebentar, dan tutupnya dibuka secara aseptis. 2. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel a. Siapkan 3 buah tabung reaksi, lalu tempelkan label konsentrasi larutan yang akan dibuat, yaitu 10-1, 10-2, 10-3. b. Ketiga tabung reaksi diisi larutan buffer fosfat pH 7,2 masing-masing sebanyak 9 ml. c. Pipet 1 ml pembersih wajah dengan mat pipet, dan masukkan ke tabung 1. d. Homogenkan larutan dalam tabung 1 dengan menggunakan vortex. e. Pipet 1 ml larutan dari tabung 1 ke dalam tabung 2, lalu homogenkan dengan menggunakan vortex. f. Pipet 1 ml larutan dari tabung 2 ke dalam tabung 3, lalu homogenkan dengan menggunakan vortex. Dengan demikian, pengenceran bahan yang diperoleh adalah 1:10, 1:100 dan 1:1000. g. Dari masing-masing pengenceran dipipet 1 ml dan masukkan ke dalam cawan petri (setiap konsentrasi larutan dimasukkan ke dalam 2 cawan petri).

h. Tuangkan Nutrient Agar (NA) yang telah dicairkan (suhu 45-55C) sebanyak 15-20 ml ke dalam tiap cawan petri. Kemudian goyangkan hati-hati ke kanan dan ke kiri sampai homogen. i. Biarkan beberapa saat sampai membeku, dan eramkan pada suhu 37C selama 18-24 jam dalam inkubator. j. Amati hasilnya dan hitung jumlah koloni yang tumbuh. 5.4. Identifikasi Cemaran Patogen 1. Siapkan alat dan bahan. 2. Panaskan ose hingga berpijar,kemudian ambil tabung reaksi yang berisi inokulum bakteri. 3. Ambil 1 ose bakteri secara hati-hati masukkan ke dalam Nutrient Broth, pastikan bakteri telah masuk kedalam NB dengan mengocok ose hingga beberapa kali.Lalu Vortex Nutrient Broth yang telah berisi bakteri hingga homogen. 4. Ambil ose dan pijarkan diatas api,tunggu sebentar hingga agak dingin lalu ambil 1 ose dari Nutrient Broth dan tanamkan ke dalam media agar di dalam cawan petri dengan cara penipisan. Penipisan :

Gambar 1. Cara inokulasi kuman pada lempeng agar (penipisan) 5. Penanaman bakteri dilakukan pada media MSA, SSA, EMB, dan Centrimid Agar. 6. Masukkan dalam incubator pada suhu 37C selama 18-24 jam. 7. Amati perubahan yang terjadi, dan amati bentuk koloni yang terbentuk.

5.5. Uji Konfirmasi Patogen 1. Uji fermentasi karbohidrat a. Satu sengkelit biakan diambil dari suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan diinokulasikan pada tiap tabung yang berisi larutan glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, dan manitol yang telah diberi indikasi BTB (Brom Timol Biru). Homogenkan. b. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam c. Amati perubahan yang terjadi setelah diinkubasi selama 24 jam. Munculnya warna kuning menunjukkan terbentuknya asam yang berarti terjadi proses fermentasi 2. Uji Motilitas a. Satu sengkelit biakan diambil dari suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan diinokulasikan dengan cara ditusukkan ke dalam media motilitas. b. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. c. Amati perubahan yang terjadi setelah diinkubasi selama 24 jam. Adanya pertumbuhan menyebar diamati di sekitar tusukkan . 3. Penanaman pada media triple sugar iron agar (TSIA) a. Satu sengkelit biakan diambil dari suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan diinokulasikan pada media TSIA. b. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. c. Amati peubahan yang terjadi setelah diinkubasi selama 24 jam. Skema:

Ose/ sengkelit suspensi bakteri Staphylococcus aureus

Glukosa

Sukrosa

Laktosa

Manitol

Maltosa

Gerak

TSIA

5.6. Uji Sterilitas 1. Siapkan alat dan bahan 2. Siapkan tiga tabung reaksi yang masing-masing berisi tioglikolat cair. 3. Beri label tabung 1, tabung 2, dan blanko (kontrol media). 4. Buka botol obat tetes mata secara aseptis, yaitu dengan mengelap tutup botolnya terlebih dahulu dengan menggunakan kapas beralkohol kemudian dibuka tutupnya dengan menggunakan pinset. 5. Teteskan cairan obat tetes mata tersebut sebanyak 1 ml (20 tetes ) masing-masing ke dalam tabung reaksi 1 dan tabung reaksi 2. 6. Homogenkan dengan melakukan vortex pada setiap tabung. 7. Inkubasi ketiga tabung reaksi tersebut pada suhu 37C untuk media tioglikolat cair selama 18-24 jam. 8. Amati perubahan yang terjadi 5.7. Penentuan Potensi Antibiotik Pembuatan Inokulum (106 sel staphylococcus aureus/ml) 1. Siapkan tabung berisi bakteri yang akan diuji. 2. 1 tabung berikutnya diambil, kemudian diisi dengan 2 ml NaCl 0.9% 3. Tabung yang berisi 2 ml NaCl 0,9% dimasukkan bakteri Staphylococcus aureus dengan menggunakan ose, sehingga ketika divortex kekeruhannya sama dengan larutan Mc. Farland III (setara dengan 109 sel/ml). Beri label tabung 109. 4. Dari tabung 109 pipet secara aseptis 1 ml. Masukan ke dalam tabung dan tambahkan larutan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml lalu vorteks sehingga diperoleh pengenceran sebesar 108. Label tabung dengan 108. 5. Dari tabung 108 pipet secara aseptis 1 ml. Masukan ke dalam tabung dan tambahkan larutan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml lalu vorteks sehingga diperoleh pengenceran sebesar 107. Label tabung dengan 107. 6. Dari tabung 107 pipet secara aseptis 1 ml. Masukan ke dalam tabung dan tambahkan larutan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml lalu vorteks sehingga diperoleh pengenceran sebesar 106. Label tabung dengan 106.

7. Lakukan cara kerja nomor 6 sebanyak 6 kali karena hasil inokulum akan dibagikan untuk kelompok lain. Pembuatan Base Layer 1. Siapkan 6 cawan petri steril 2. Masing-masing cawan petri diisi dengan nutrien agar 15-20 ml base Layer (lapisan dasar/ medium 2). 3. Lapisan base layer didalam keenam cawan petri dibiarkan membeku. Pembuatan Seed Layer (Lapisan Perbenihan) 1. Dengan menggunakan kertas karton pada keenam cawan petri yang sudah dilapisi base layer diberi tanda masing-masing S1, S2, S3, U1, U2, dan U3 sesuai dengan pola yang sudah digambar.

2. 6 tabung reaksi steril disiapkan. Masing-masing tabung diisi dengan 4 ml lapisan perbenihan cair. 3. 1 ml inokulum (106 sel/ml) diisi setelah suhu perbenihan cair mencapai 450C-600C (diukur dengan punggung tangan, apabila panas sudah tidak menyengat). 4. Tabung dihomogenkan dengan vortex. 5. Kemudian dituang pada cawan petri yang sudah dilapisi base layer yang sudah membeku dan diberi tanda. 6. 1 tabung larutan berisi 4 ml perbenihan cair + 1 ml inokulum 106sel/ml dimasukkan ke tiap cawan petri. 7. Diratakan pada seluruh permukaan lapisan dasar dan dibiarkan hingga membeku.

Pembuatan Larutan Antibiotik Standar 1. 5,7 mg amoksisilin trihidrat yang setara dengan 5 mg amoksisilin dilarutkan dengan sedikit buffer fosfat pH 7,2 di dalam labu ukur. Kemudian dihomogenkan dengan vorteks. 2. Setelah larut, buffer fosfat ditambahkan hingga volume larutan mencapai 50 ml di dalam labu ukur. Kemudian dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik uji 100 g/ml. 3. Setelah dihomogenkan, larutan tersebut diambil dengan suntikan, kemudian larutan tersebut dikeluarkan dengan melewatkannya pada bakteri filter yang sudah terpasang diatas tabung untuk mendapatkan larutan antibiotik standar steril 100 g/ml. 4. 4,5 ml larutan antibiotik standar steril 100 g/ml dipipet ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 7,2 sampai 50 ml. 5. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik standar 9 g/ml (S1). 6. 3 ml larutan antibiotik standar steril 100 g/ml dipipet kedalam labu ukur 25 ml, kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 7,2 sampai 25 ml. 7. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik standar 12 g/ml (S2). 8. 4 ml larutan antibiotik standar steril 100 g/ml dipipet kedalam labu ukur 25 ml lainnya (yang kedua), kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 7,2 sampai 25 ml. 9. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik standar 16 g/ml (S3).

Pembuatan Larutan Antibiotik Uji 1. 5 mg amoksisilin dilarutkan dengan sedikit buffer fosfat pH 8 di dalam labu ukur. Kemudian dihomogenkan dengan vorteks.

2. Setelah larut, buffer fosfat ditambahkan hingga volume larutan mencapai 50 ml di dalam labu ukur. Kemudian dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik uji 100 g/ml. 3. Setelah dihomogenkan, larutan tersebut diambil dengan suntikan, kemudian larutan tersebut dikeluarkan dengan melewatkannya pada bakteri filter yang sudah terpasang diatas tabung untuk mendapatkan larutan antibiotik uji steril 100 g/ml. 4. 4,5 ml larutan antibiotik uji steril 100 g/ml dipipet ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 8 sampai 50 ml. 5. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik uji 9 g/ml (U1). 6. 3 ml larutan antibiotik uji steril 100 g/ml dipipet kedalam labu ukur 25 ml, kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 8 sampai 25 ml. 7. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik uji 12 g/ml (U2). 8. 4 ml larutan antibiotik uji steril 100 g/ml dipipet kedalam labu ukur 25 ml lainnya (yang kedua), kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 8 sampai 25 ml. 9. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga didapat larutan antibiotik uji 16 g/ml (U3).

Penentuan Potensi Antibiotika 1. 20 l dipipet dengan pipet mikro dari setiap pengenceran antibiotik uji (U1, U2 dan U3) dan setiap pengenceran antibiotik standar (S1, S2 dan S3). Kemudian diteteskan pada cakram kertas. Setelah itu, cakram kertas diletakkan pada tempat yang tersedia sesuai tandanya (lihat gambar).

2. Hal yang sama dilakukan pada ke lima cawan petri lainnya 3. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam. Kemudian zona hambat diukur dengan jangka sorong atau penggaris dari setiap konsentrasi antibiotik uji dan antibiotik standar. 5.8. Kadar Hambat Minimal 1. Pembuatan Inokulum Sediakan biakan kuman standar dalam kaldu nutrisi atau biakan agar miring pada 37oC selama 18-24 jam. Buat inokulum dari suspensi kuman standar sesuai dengan Mc Farland III. Siapkan 4 tabung reaksi secara berderet dan diberi nomor 1-4. Masing-masing diisi dengan NaCl fisiologis (air suling steril) sebanyak 4,5 ml. Pada tabung yang pertama diisi 2 ml suspensi kuman sesuai dengan Mc Farland III, lalu kocok sampai homogen. Ambil 1 ml dari tabung pertama masukkan pada tabung yang kedua, kocok sampai homogen. Ambil 1 ml dari tabung kedua, masukkan ke tabung ketiga, kocok sampai homogen. Ambil 1 ml dari tabung ketiga, masukkan ke tabung keempat, kocok sampai homogen. Dengan demikian diperoleh suspensi kuman dengan pengenceran 10x, 100x, 1000x, dan 10.000x (setara dengan 106 kuman/ml). 2. Pembuatan Larutan Stok Antibiotika Timbang 5 mg antibiotika lalu larutkan dalam labu takar 50 ml dengan pelarut yang cocok sehingga diperoleh konsentrasi 100 g/ml, lalu disaring dengan filter bakteri. Buat pengenceran dengan kelipatan dua sehingga diperoleh kadar: 50 g/ml; 25 g/ml; 12,5 g/ml; 6,25 g/ml; 3,12 g/ml; 1,56 g/ml; dan 0,78 g/ml. 3. Penentuan KHM Siapkan 14 tabung reaksi (untuk duplo), beri label 1-7. Siapkan juga 2 tabung yang berlabel KM (Kontrol Media) dan KK (Kontrol Kuman). Pada tabung 1-7 masukkan larutan antibiotika hasil pengenceran

bertingkat yaitu: 50 g/ml; 25 g/ml; 12,5 g/ml; 6,25 g/ml; 3,12 g/ml; 1,56 g/ml; dan 0,78 g/ml masing-masing 0,5 ml. Tambahkan pada setiap tabung sebanyak 0,1 ml inokulum (106 kuman/ml). Tambahkan 0,4 ml larutan kaldu nutrien sehingga volume setiap tabung menjadi 1 ml. Pipet 1 ml kaldu nutrisi ke dalam tabung kontrol media (KM) dan 0,9 ml ke dalam tabung kontrol kuman (KK), dan masukkan ke dalam tabung kontrol kuman (KK) tersebut 0,1 ml inokulum. Ulangi percobaan 2 kali (duplo). Eramkan di inkubator 18-24 jam 37oC. 4. Pembacaan Hasil Konsentrasi hambat minimal adalah konsentrasi obat terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan kuman. Dapat dilihat dari: (+): keruh, menandakan adanya pertumbuhan kuman (-) : jernih, menandakan tidak adanya pertumbuhan kuman

Skema Cara Kerja:1. Pembuatan Inokulum kuman uji

pindahkan biakan kuman dengan ose setarakan kekeruhan

Biakan S. aureus

2 ml larutan NaCl 0,9%

Suspensi kuman uji setara dengan Mc Farland III0.5 ml 0.5 ml

Larutan Mc Farland III (109 kuman/ml)0.5 ml

Suspensi kuman 10 kuman/mL9

4,5 ml NaCl 0,9%

4,5 ml NaCl 0,9%

4,5 ml NaCl 0,9% Setara dengan 106 kuman / mL

2. Pembuatan larutan stok antibiotikaTimbang 5 mg Amoksisilin50 mL buffer fosfat pH 7.2 saring dengan filter bakter

3. Penentuan KHM

a. Beri label pada tabung reaksi pertama dengan label 50 yang berarti tabung tersebut mengalami pengenceran 50 g/ml. Selanjutnya kelipatan setengahnya (tabung kedua : 25, tabung ketiga : 12.5, hingga tabung keenam : 0.781)

KK

KM

50 25

12.5

6.25

3.125

1.56

0.78

b. Masukkan 0,5 ml NB dengan menggunakan pipet 1 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi. Masukkan 0.5 ml antibiotik Amoxicilin ke dalam tabung reaksi pertama. Lalu setelah divortex ambil 0.5 ml dari tabung tersebut ,tuangkan ke dalam tabung reaksi kedua, dan seterusnya. Setelah sampai ke tabung reaksi terakhir ambil 0.5 ml dan buang.0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL

Buang 0.5 mL

100 g/mL 0.78

50

25

12.5

6.25

3.12

1.56

KM1.0 mL NB

KK0.9 mL NB

c. Masukkan 0.1 ml inokulum kuman 106 ke dalam masing-masing tabung sama banyaknya d. Tambahkan 0.4 ml NB ke dalam masing-masing tabung hingga volumenya 1 ml, kemudian vortex hingga homogen. Dibuat duplo kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 5.9. Uji Koefisien Fenol Pembuatan inokulum 1. Siapkan 4 tabung reaksi yang telah diberi label 109, 108, 107, dan 106 masing-masing diisi dengan larutan NaCl 0,9% sebanyak 2 ml pada tabung berlabel 109 dan 4,5 ml pada tabung yang lain. 2. Pindahkan kuman Staphylococcus aureus dari biakkan agar miring yang telah tersedia dengan ose ke tabung berlabel 109. 3. Kocok tabung tersebut dan tabung berisi Mc Farland III, setarakan kekeruhannya. a. Pipet 0,5 ml suspensi kuman 109, masukkan ke tabung dengan label 108, kocok sampai homogen. b. Pipet 0,5 ml suspensi kuman 108, masukkan ke tabung dengan label 107, kocok sampai homogen. c. Pipet 0,5 ml suspensi kuman 107, masukkan ke tabung dengan label 106, kocok sampai homogen. Diperoleh inokulum dengan konsentrasi suspensi kuman 106. Pembuatan larutan baku fenol

1. Timbang 2,5 gram fenol, larutkan dalam 50 ml aquadest steril. Didapatkan konsentrasi 1:20. 2. Dipipet 12,5 ml fenol dari perbandingan 1:20 lalu ditambahkan aquadest steril sampai 50 ml. Didapatkan konsentrasi 1:80. 3. Beri label tabung reaksi dengan F 1:80. 4. Pipet 5 ml larutan baku fenol 1:80, masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah diberi label. Pembuatan larutan desinfektan 1. Siapkan 4 tabung reaksi dan diberi label 1:10, 1:80, 1:100, dan 1:150, masing-masing diisi air suling steril berturut-turut sebanyak 9 ml, 7 ml, 4,5 ml, dan 7 ml. 2. Pipet 1 ml desinfektan, masukkan ke dalam tabung reaksi 1:10, didapat pengenceran 1:10. 3. Pipet 1 ml dari tabung 1:10, masukkan ke dalam tabung 1:80, didapat pengenceran 1:80. 4. Pipet 0,5 ml dari tabung 1:100, masukkan ke dalam tabung 1:100, didapat pengenceran 1:100. 5. Pipet 0,5 ml dari tabung 1:100, masukkan ke dalam tabung 1:150, didapat pengenceran 1:150. 6. Tabung 1:80, 1:100, 1:150 disetarakan volumenya menjadi 5 ml dengan membuang kelebihan dari masing-masing tabung. Pengujian angka fenol 1. Siapkan 12 tabung reaksi beri label masing-masing sesuai dengan uji masing-masing dan lama kontak yang akan diuji. Fenol menit ke 5, 10, dan 15 menit. Uji 1 menit ke 5, 10, dan 15. Uji 2 menit ke 5, 10, dan 15. Uji 3 menit ke 5, 10, dan 15. 2. Isi 12 tabung tersebut dengan Nutrient Broth (NB) yang telah disediakan sebanyak 5 ml. 3. Tambahkan 0,5 ml suspensi Staphlococcus aureus 106 ke dalam tabung F 1:80 yang berisikan fenol.

4. Hitung waktu hingga 5 menit, pada menit ke-5, masukkan ose (yang sebelumnya disterilkan terlebuh dahulu) ke dalam tabung reaksi yang berisi fenol dan inokulum hingga terbentuk selaput pada ose. 5. Masukkan ose ke dalam tabung reaksi Fenol 5 yang berisi NB, dihomogenkan. 6. Lakukan langkah tersebut hingga menit ke-15. 7. Ulangi langkah tersebut pada tabung-tabung Uji 1, Uji 2, dan Uji 3. Skema: 1. Pembuatan inokulum

Pindahkan Staphylococcus aureus dengan ose

setarakan kekeruhan 2 ml NaCl 0,9% Mc Farland III

1090,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

109

2. Pembuatan larutan baku fenol

4,5 ml NaCl 108

4,5 ml NaCl 107

4,5 ml NaCl 106

12,5 ml 2,5 gram fenol 50 ml aquadest 50 ml aquadest

3. Pengenceran desinfektan 1 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml

Desinfektan Karbol (DES) 9 ml Aquadest 7 ml Aquadest Uji 1 Ose 4,5 ml Aquadest Uji 2 7 ml Aquadest Uji 3

Setarakan volume menjadi 5 ml

4. Pengujian angka fenol

0,5 ml

Inokulum 106

Fenol 1:80

5 ml NB 5

Ose

5 ml NB 10

5 ml NB 15

0,5 ml

Inokulum 106

DES 1:80 Uji 1

5 ml NB 5

Ose

5 ml NB 10

5 ml NB 15

0,5 ml

Inokulum 106

DES 1:100 Uji 2

5 ml NB 5

Ose

5 ml NB 10

5 ml NB 15

0,5 ml

Inokulum 106

DES 1:150 Uji 3

5 ml NB 5

5 ml NB 10

5 ml NB 15

BAB VI HASIL PENGAMATAN 6.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat 1. Alat-alat yang telah disterilkan terlihat bersih dan bebas lemak 2. Media perbenihan berupa Nutrien Agar berwarna coklat muda keemasan 6.2. Pewarnaan Gram

Gambar 2. Pewarnaan gram bakteri Staphylococcus aureus jika dilihat melalui mikroskop Tahapan pewarnaan Staphylococcus aureus : 1. Staphylococcus aureus + karbol kristal ungu bakteri menjadi bewarna ungu 2. Bilas dengan air + tuang cairan lugol bakteri tetap bewarna ungu 3. Ditetesi alkohol dan bilas dengan air bakteri tetap bewarna ungu 4. Diwarnai dengan zat warna fuchsin bakteri tetap bewarna ungu 5. Bilas dengan aquadest hasil akhir: bakteri bewarna ungu (bakteri gram positif) Bentuk bakteri Susunan bakteri : Coccus (bulat) : Berkelompok seperti buah anggur

6.3. Penentuan Angka Kuman

Gambar 3. Cawan petri dengan pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 (dibuat duplo) Jumlah koloni bakteri Petri 1 8 2 Petri 2 1 + 1 jamur 1

Pengenceran 10-1 10-2 10-3

Perhitungan hasil : Jumlah Kuman Total pengenceran = Jumlah koloni x kebalikan angka

Catatan :

Pengenceran yang dianggap mewakili perhitungan jumlah

kuman adalah pengenceran yang memberikan jumlah antara 30-300 koloni/cawan petri.

Dari data hasil pengamatan, praktikan tidak dapat menghitung jumlah kuman yang ada dalam cairan pembersih wajah, karena jumlah yang didapat kurang dari 30 koloni/cawan. 6.4. Identifikasi Cemaran Patogen

gambar 4.Media centrimid (-)

Gambar 5. Media SSA (-)

Gambar 6. Media EMB (-)

Gambar 7. Media SSA (+) 6.5. Uji Konfirmasi Patogen Tabel hasil pengamatan Glukosa Warna menjadi lebih muda, tidak terbentuk gas Sukrosa Tidak berubah Laktosa Tidak berubah Manitol Tidak berubah Maltosa Tidak berubah Gerak Tidak berubah TSIA Tidak berubah

Gambar 8. Dari kiri: Glukosa, Laktosa,Manitol, Maltosa, Sukrosa, Gerak, TSIA Adanya perubahan warna pada larutan Glukosa

6.6. Uji Sterilitas Berikut merupakan gambar yang diambil setelah dilakukan inkubasi :

7. 8. 9. 10. G a Gambar 9 . Tabung 1 dengan m blanko b Gambar 10. Tabung 2 dengan blanko

Gambar 11. Kanan ke kiri : Tabung 1 , tabung 2 dan blanko Hasil pengamatan disajikan dalam tabel berikut: Tabung Tabung 1 Tabung 2 Keterangan : + : keruh, terdapat pertumbuhan mikroorganisme - : jernih, tidak ada pertumbuhan mikroorganisme Hasil (-) (-)

6.7. Penentuan Potensi Antibiotik a.Gambar

Gambar 12. sebelum di inkubasi b.Perhitungan N0 1 2 3 4 5 6 S1 (cm) 1,0 1,05 1 1,1 0,95 1,05 1,025 S2 (cm) 1,2 1,15 1,25 1,2 1,1 1,25 1,19 S3 (cm) 1,3 1,25 1,4 1,25 1,175 1,3 1,279

Gambar 13. setelah diinkubasi.

U1 (cm) 0,875 0,875 0,85 0,875 0,8 0,95 0,871

U2 (cm) 1,0 1,0 0,875 1,0 0,95 1,0 0,971

U3 (cm) 1,1 1,15 1,15 1,15 1,1 1,2 1,142

Tabel.1 Perhitungan Diameter Ls1 Lu1 Ls2 Lu2 Ls3 Lu3 = S3 S1 = 0,3 = U3 U1 = 0,225 = S3 S1 = 0,2 = U3 U1 = 0,275 = S3 S1 = 0,4 = U3 U1 = 0,3

Ls4 Lu4 Ls5 Lu5 Ls6 Lu6 d=3 n=2 h=6

= S3 S1 = 0,15 = U3 U1 = 0,275 = S3 S1 = 0,225 = U3 U1 = 0,3 = S3 S1 = 0,25 = U3 U1 = 0,25

Berdasarkan perhitungan tiap data Ls = (Ls1 + Ls2 + Ls3 + Ls4 + Ls5 + Ls6 ) = 0,254 Lu = (Lu1 + Lu2 + Lu3 + Lu4 + Lu5 + Lu 6) = 0,271 Berdasarkan perhitungan rata-rata Ls = S3 - S1 = 0,254 Lu = U3 - U1 = 0,271

Standar (S) (cm) Jumlah zona kadar rendah Jumlah zona kadar tengah Jumlah zona kadar tinggi Jumlah sediaan Kontras linier S1 S2 S3 (S1+S2+S3) S3-S1 = Ls

Uji (U) (cm) U1 U2 U3 (UI+U2+U3) U3 U1 = Lu

Standar (S) (cm)

Uji (U) (cm)

Jumlah zona kadar rendah Jumlah zona kadar tengah Jumlah zona kadar tinggi Jumlah sediaan Kontras linier Interval logaritma konsentrasi I b= b= = log S3 - log S2 Ls + Lu (d 1)i n h = 0,107 0,075 = 0,032

1,025 1,19 1,279 1,165 0,254

0,871 0,971 1,142 0,995 0,271

S nd 1,165 Ys = = 0,194 2x3 Ys = Yu =

0,254 + 0,271 = 0,683 (3 1) x 0,032 x 2 x 6

U nd 0,995 Yu = = 0,166 2x3 Mu =

Yu Ys b 0,166 0,194 Mu = = 0,041 0,683 Ru (Rasio Potensi)

= antilog Mu = antilog -0,041 = 0,9099

Potensi antibiotik = 0,9099 x 100% = 90,99%

Keterangan b = slope regresi zona log konsentrasi semua sediaan d = banyaknya ragam konsentrasi setiap standar sediaan = 3 h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2 n = banyaknya penggandaan tiap perlakuan = 6 I = interval log konsentrasi berdampingan

6.8. Kadar Hambat Minimal

Gambar 14. Tabung reaksi 7,6,5,4, dan 3

Gambar 15. Tabung reaksi 2, 1, KM dan KK

Tabel hasil pengamatan 1. KM KK 50 g/mL 2. 25 g/mL 3. 12,5 g/mL 4. 6,25 g/mL 5. 3,12 g/mL 6. 1,56 g/mL 7. 0,78 g/mL + +

-

+

Keterangan: +: Keruh, ada pertumbuhan kuman - : Jernih, tidak ada pertumbuhan kuman

6.9. Penentuan Koefisien Fenol

Gambar 16. Hasil pengamatan inokulum yang telah diinkubasi dalam larutan fenol standar 1:80

Gambar 17. Hasil pengamatan inokulum yang telah diinkubasi dalam larutan: kiri fenol standar 1:80, kanan larutan desinfektan uji 1:80

Gambar 18. Hasil pengamatan inokulum yang telah diinkubasi dalam larutan: kiri fenol standar 1:80, kanan larutan desinfektan uji 1:100

Gambar 19. Hasil pengamatan inokulum yang telah diinkubasi dalam larutan: kiri fenol standar 1:80, kanan larutan desinfektan uji 1:150

Tabel Hasil Pengamatan Bahan Uji-Konsentrasi Fenol standar 1:80 Disinfektan 1:80 Disinfektan 1:100 Disinfektan 1:150 Keterangan: (+) (-)

5 + + +

10 + + +

15 + + +

: Keruh (ada pertumbuhan kuman) : Jernih (tidak ada pertumbuhan kuman) Dapat dilihat adanya pertumbuhan Staphylococcus aureus pada media

(NB) di tabung reaksi yang berisi larutan desinfektan uji (1:80, 1:100, 1:150) dengan berbagai waktu kontak yaitu, 5 menit, 10 menit, dan 15 menit. Hanya pada tabung berisi larutan fenol standar 1:80 dengan berbagai waktu kontak yaitu 5 menit, 10 menit, dan 15 menit; yang tidak didapatkan pertumbuhan bakteri.

BAB VII PEMBAHASAN 7.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat Sterilisasi merupakan hal penting yang harus dilakukan pada alat-alat praktikum mikrobiologi karena setiap alat dan media yang digunakan pada setiap praktikum tidak boleh mengandung bakteri atau pun kontaminan yang tidak diinginkan. Media perbenihan dalam mikrobiologi digunakan sebagai tempat tumbuh biakan bakteri. Media perbenihan dapat berupa Dextrose Agar, Nutrien Agar, Nutrien Broth, Sabouraud Agar, Eosin Methylen Blue Agar, dan lain-lain. Alat-alat dalam praktikum mikrobiologi harus digunakan secara aseptis. 7.2. Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus pada pewarnaan gram menghasilkan warna ungu, sehingga termasuk dalam bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk coccus (bulat) dan tersusun berkelompok seperti buah anggur. Dinding sel bakteri gram positif terdiri dari lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga menyebabkan permeabilitas dinding sel berkurang. Timbulnya warna ungu pada pewarnaan gram ini disebabkan karena kompleks zat iodin yang terperangkap diantara dinding sel dan membran sitoplasma bakteri. Penambahan alkohol akan menyebabkan dinding sel terdehidrasi dengan pori-pori yang mengkerut, sehingga menyebabkan daya rembes dinding sel dan membran yang menurun, oleh karena itu zat warna fuchsin tidak dapat masuk dan mewarnai bakteri ini. 7.3. Penentuan Angka Kuman Pada praktikum kali ini, praktikan menggunakan sampel larutan pembersih wajah untuk dihitung jumlah bakteri yang terkandung di dalamnya. Bedasarkan hasil pengamatan, hanya ditemukan sejumlah kecil koloni bakteri yang terdapat pada cawan petri yang sebelumnya telah diisi dengan Nutrient Agar serta larutan pembersih wajah dan buffer fosfat. Oleh karena itu, praktikan tidak dapat menentukan jumlah kuman total dengan

rumus hasil kali jumlah koloni dengan kebalikan angka pengenceran. Jumlah koloni bakteri yang sedikit ini disebabkan karena larutan pembersih wajah tersebut mengandung alkohol, yang berfungsi sebagai desinfektan sehingga dapat membunuh bakteri. Selain itu, pada cawan petri juga ditemukan jamur. Timbulnya jamur dapat disebabkan karena kerja praktikan yang kurang steril. 7.4. Identifikasai Cemaran Patogen Dari hasil pengamatan menunjukkan tidak adanya perubahan pada media Centrimide, SSA (Salmonella Shigella Agar), dan EMB (Eosim Methylen Blue Agar) sehingga dinyatakan negatif. Sedangkan pada media MSA (Manitol Salt Agar).Terlihat perbentukan koloni dari Staphylococcus aureus yang berbentuk bulat bergerombol seperti buah anggur dan juga terjadi perubahan warna pada media MSA tersebut dari berwarna merah muda menjadi kuning dikarenakan terjadinya perubahan pH akibat pertumbuhan bakteri. 7.5. Uji Cemaran Patogen Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram negatif yang dapat meragi Manitol. Staphylococcus aureus tidak memiliki alat gerak /flagel sehingga tidak memperlihakan perubahan pada media motilitas. Namun, pada percobaan uji konfirmasi patogen kali ini, perubahan warna justru terjadi pada larutan glukosa yang telah diinokulasikan satu sengkelit dari suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan telah diinkubasi selama 24 jam. Namun pada tabung lainnya yaitu, tabung yang berisi larutan laktosa, sukrosa, manitol, dan manosa serta tabung yang berisi media gerak dan TSIA tidak terjadi perubahan. Kesalahan ini dapat terjadi karena: - Ketidaktelitian praktikan dalam menginokulasikan suspensi bakteri pada media perbenihan. - Tabung terlalu sering dipanaskan - Ose yang digunakan terlalu panas sehingga bakteri mati sebelum diinokulasikan

7.6. Uji Sterilitas Dari hasil pengamatan semua tabung baik pada tabung blanko, tabung 1 dan tabung 2 terlihat jernih. Hal ini menandakan bahwa pada ketiga tabung yang telah diinkubasi idak terdapat pertumbuhan mikroorganisme. Tidak adanya pertumbuhan mikroorganisme pada tabung-tabung tersebut membuktikan bahwa sediaan obat tetes mata ini steril. 7.7 Penentuan Potensi Antibiotik Dari pengamatan yang telah dilakukan praktikan dapat mengetahui adanya hubungan kadar suatu antibiotik terhadap zona hambat pertumbuhan mikroorganisme. Hal ini terlihat pada peningktan dosis antibiotik standar dari S 1 ke S3( 1,025 cm ; 1,19 cm ;1,279 cm) menyebabkan semakin besar juga zona hambatnya.Zona hambat terbesar adalah pada S3. Begitu juga antibiotik uji, Zona hambat yang terbesar ada pada U3 (1,142 cm). Angka potensi antibiotik ini menunjukkan kemampuan sebuah antibiotik dalam menghambat pertumbuhan bakteru, semakin besar angka potensi antibiotik semakin besar pula kemampuan antibiotik tersebut untuk menghambat pertumbuhan bakteri.Potensi antibiotik yang didapat setelah perhitungan praktikan adalah 90,99%. 7.8. Kadar Hambat Minimal Berdasarkan percobaan, diperoleh bahwa konsentrasi antibiotik Amoxicilin pada tabung 1: 50 g/mL, tabung 2: 25 g/mL, tabung 3: 12,5 g/mL, tabung 4: 6,25 g/mL, tabung 5: 3,12 g/mL, dan tabung 6: 1,56 g/mL larutan bewarna jernih, sedangkan pada tabung 7: 0,78 g/mL larutan berwarna keruh. Hal ini berarti terjadi pertumbuhan kuman Staphylococcus aureus pada konsentrasi 0,78 g/mL. Konsentrasi Hambat Minimal dapat diperoleh dari tabung yang berisi larutan jernih terakhir sebelum larutan tersebut berubah menjadi keruh pada tabung berikutnya. Oleh karena itu, diperoleh bahwa KHM Amoxicilin yaitu sebesar 1,56 g/mL (tabung 6), karena tabung 6 ini merupakan tabung terakhir dengan larutan bewarna jernih. pada

7.9. Penentuan Koefisien Fenol Pada percobaan ini, hasil yang kami peroleh seharusnya pada waktu kontak 10 dan 15 menit dengan desinfektan 1:80 didapati tidak ada pertumbuhan. Selain itu, pada salah satu atau larutan desinfektan uji (1:80, 1:100, 1:150) pada waktu kontak 10 menit dan 15 menit tidak didapati adanya pertumbuhan mikroorganisme sehingga dapat dihitung koefisien fenolnya. Namun, hasil percobaan yang kami peroleh tidak sesuai dengan apa yang diharapkan, hal ini dapat terjadi karena beberapa kesalahan. Kesalahan tersebut kemungkinan disebabkan karena beberapa faktor, diantaranya: Terlalu banyak berbicara Ose, pipet, dan peralatan lain yang digunakan tidak steril Kuman mati atau kuman tidak terbawa pada ose saat pemindahan ke media NB (pada percobaan dengan waktu kontak 5 dan 15 menit dengan fenol 1:80) Koefisien fenol tidak dapat dihitung oleh karena kesalahan ini. Adapun rumus perhitungan untuk koefisien fenol adalah:Pengenceran teringgi larutan bahan uji yang mematikan bakteri dalam waktu 10 menit, tetapi tidak mematikan dalam 5 menit Pengenceran teringgi larutan fenol yang mematikan bakteri dalam waktu 10 menit, tetapi tidak mematikan dalam 5 menit

Koefisien fenol =

BAB VIII KESIMPULAN 8.1. Sterilisasi, Pembuatan Media, dan Penggunaan alat - Sterilisasi alat dapat dilakukan sterilisasi kering (dengan api dan oven), sterilisasi basah, sterilisasi uap dan filter bakteri. - Media perbenihan dibuat sebagai media untuk pertumbuhan biakan bakteri. - Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi harus selalu dalam keadaan steril 8.2. Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena menghasilkan warna ungu. Bentuk bakteri ini adalah coccus (bulat) dan tersusun berkelompok seperti buah anggur. 8.3. Penentuan Angka Kuman Larutan pembersih wajah layak digunakan, karena hanya mengandung sejumlah kecil koloni bakteri. 8.4. Identifikasi Cemaran Patogen Sesuai dengan ciri-ciri yang terdapat pada literatur, dapat disimpulkan bahwa bakteri patogen yang teridentifikasi yaitu bakteri Staphylococcus aureus. 8.5. Uji Konfirmasi Patogen Hasil praktikum uji konfirmasi patogen kali ini tidak menunjukkan kesamaan dengan literatur bahwa Staphylococcus aureus dapat meragi manitol. 8.6. Uji Sterilitas Obat tetes mata dinyatakan steril karena menunjukkan hasil negatif untuk pertumbuhan bakterinya. 8.7. Penentuan Potensi Antibiotik Dari pengamatan dan perhitungan yang telah dilakukan praktikan mendapatkan angka potensi antibioti yang cukup besar yaitu 90,99% hal ini menyatakan bahwa antibiotik memiliki zona hambat yang baik terhadap pertumbuhan bakteri.

Semakin besar kadar antibiotik yang digunakan semakin besar juga zona hambat pertumbuhan bakterinya. 8.8. Kadar Hambat Minimal KHM antibiotika Amoxicilin yang sebenarnya adalah 12,5 g/mL (tabung reaksi 3). Oleh karena itu, seharusnya pada tabung reaksi nomor satu (1) sampai dengan tiga (3) larutan terlihat jernih. Akan tetapi, hasil yang diperoleh praktikan yaitu 1.56 g/mL (tabung reaksi 6). Oleh karena itu praktikan menyimpulkan bahwa pada percobaan kali ini terdapat kesalahan. Hal ini disebabkan karena bakteri Staphylococcus aureus telah mati akibat pemflamberan NB yang terlalu lama, sehingga tidak terjadi pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus pada konsentrasi antibiotik Amoxicilin yang rendah, seperti pada tabung empat (4) sampai dengan enam (6). Pada tabung kontrol kuman larutan bewarna keruh, maka kesalahan tidak terjadi pada pembuatan inokulum. 8.9. Penentuan Koefisien Fenol Dari hasil praktikum penentuan koefisien fenol kali ini, koefisien fenol tidak dapat ditentukan karena data hasil pengamatan tidak memenuhi syarat (pengenceran larutan uji yang mematikan dalam waktu 10 menit tetapi tidak mematikan dalam waktu 5 menit/ pengenceran larutan fenol standar yang mematikan dalam waktu 10 menit tetapi tidak mematikan dalam waktu 5 menit) untuk perhitungan koefisien fenol.

DAFTAR PUSTAKA Radji, Maksum. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran. Jakarta: EGC. Radji, Maksum. 2006. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Cipta Kreasi Bersama. http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/107/jtptunimus-gdl-amirchaeru-5304-3bab3.pdf 2 Desember 2011 pukul 17.00 WIB