kata pengantar · web viewpenetapan kadar kolesterol total 12 iv. penetapan kadar karbohidrat total...

Praktikum Analisis Klinik 2011

KATA PENGANTAR

Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas tersusunnya Petunjuk Praktikum Analisis Klinik yang ditujukan untuk membantu mahasiswa semester IV Program

Studi Farmasi Klinik dan Komunitas, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Mata praktikum Analisis Klinik B ini bertujuan untuk mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana

memilih dan menggunakan/menerapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-

seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu).

Petunjuk ini hanya memuat cara singkat bagaimana melakukan analisis beberapa parameter

klinik, sedangkan untuk melengkapi pemahaman metode analisis tersebut mahasiswa diwajibkan

membaca literatur aslinya yang tertera pada daftar pustaka buku ini. Aplikasi secara klinik dapat

diperkaya melalui referensi lain yang terkait.

Buku petunjuk ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran demi

menyempurnakan buku ini di masa mendatang sangat diharapkan. Semoga buku petunjuk yang

sangat sederhana ini dapat berguna bagi yang memerlukannya.

Yogyakarta, 2011

Pengampu Praktikum Analisis Klinik :Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. (koordinator)Prof. Dr. Sudibyo Martono, MS., AptDr. Ediati, SE, Apt.Dr. Arif Nurrochmad, M.Sc., Apt Dr. Tatang Irianti, M.Sc., AptArief Rahman Hakim, M.Si., Apt.Muthi' Ikawati, MSc., Apt.Adam Hermawan, M.Sc., Apt

DAFTAR ISI

Laboratorium Analisis Klinik 1


Hlmn

KATA PENGANTAR ………………………………………………………………………………... 1

DAFTAR ISI …………………………………………………………………………………………. 2

PENDAHULUAN ……………………………………………………………………………………. 3

I.

II.

PREPARASI SAMPEL DAN PENGAMATAN SEL DARAH ……………………………..

PENETAPAN KADAR KREATININ ……………………………………............................

5

10

III. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL …………………………………………… 12

IV. PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL ........................................................… 15

V. PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN .......................................................……….. 18

VI. PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL………………………………………………...... 23

DAFTAR PUSTAKA

PENDAHULUAN



A. DESKRIPSI DAN TUJUANP raktikum Analisis Klinik mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana

memilih dan menggunakan/merapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-

seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu).

Praktikum ini bertujuan memperkenalkan berbagai metode penetapan kadar senyawa endogen

dalam tubuh dengan metode enzimatik dan kimiawi untuk penetapan karbohidrat, lipid, protein,

urea dan kreatinin. Setelah mengikuti praktikum Analisis Klinik diharapkan mahasiswa dapat

memahami dan mempraktikkan cara-cara penetapan senyawa-senyawa endogen dan mampu

mengkaitkan arti senyawa-senyawa tersebut dengan berbagai penyakit. Adapun tujuan

pembelajaran khusus setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan mampu :

1. menjelaskan cara-cara menetapkankadar senyawa endogen dalam tubuh

2. menjelaskan reaksi-reaksi kimia yang terjadi selama praktikum mata acara yang bersangkutan

3. memilih metode yang tepat untuk meneapkan senyawa endogen tertentu

4. menjelaskan arti pentingnya praktikum Analisis Klinik

5. membekali diri untuk pada waktunya bekerja di laboratorium klinik.

B. PELAKSANAAN PEMBELAJARAN

1. Jadwal Kegiatan Dua Mingguan (praktikum 2 minggu sekali)

Prakt. ke-

Topik Prakt. Substansisenyawa

dalam

Metodepenetapan

Fasilitas

I Preparasi sampel Penetapan kadar kreatinin

Plasma darahUrin

Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka

II Penetapan kadar karbohidrat Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka

III Penetapan kadar kolesterol Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka

IV Penetapan kadar urea nitrogen

Urinserum

Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka

V Penetapan kadar protein Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka

VI Responsi Semua materi praktikum

Ujian tertulis Soal-soal ujian praktikum

2. Metode Pembelajaran dan Bentuk Kegiatan

Kegiatan setiap acara praktikum di laboratorium dimulai dengan

test singkat materi yang akan dipraktikkan (pretest), kemudian mahasiswa melaksanakan acara

praktikum dengan dibimbing asisten dan dosen. Setelah selesai melaksanakan praktikum,

mahasiswa diwajibkan membuat laporan praktikum (laporan sementara perkelompok) yang



memuat data-data praktikum dan perhitungan kadar. Setelah didiskusikan dalam satu golongan,

laporan akhir pergolongan dikumpulkan pada akhir praktikum dalam bentuk softcopy. Diskusi lebih lanjut dilakukan secara on-line melalui situs

http://analisisklinikfarmasiugm.wordpress.com/ dan terbuka untuk mahasiswa golongan yang

bersangkutan dalam rentang waktu 2 x 24 jam setelah praktikum. Mahasiswa diwajibkan aktif

dalam forum diskusi tersebut yang akan selalu dipantau dan dibimbing oleh asisten dan dosen

pengampu.

Catatan : selama pelaksanaan praktikum, mahasiswa wajib mentaati segala peraturan

dan menjaga ketertiban. Mahasiswa yang terlambat > 15 menit dan atau pretest telah selesai

dilaksanakan tidak diperkenankan mengikuti praktikum dan wajib melapor pada koordinator

praktikum.

C. EVALUASI PEMBELAJARANAspek penilaian meliputi :

1. Tes pendahuluan 15%

2. Kinerja praktikum 50%(termasuk kinerja di laboratorium (15),

laporan (10), serta keaktifan diskusi di laboratorium maupun on-line (25))3. Responsi 35%

Nilai akhir ditentukan sebagai berikut:

A jika nilai 75

60 ≤ B < 75

50 ≤ C < 60

40 ≤ D < 50

E ≤ 40

PREPARASI SAMPELDAN PENGAMATAN SEL DARAH

(Sampel darah)



Preparasi sampel merupakan hal paling penting dalam suatu analisis klinik karena membutuhkan

waktu paling lama diantara langkah yang lain. Lebih jauh lagi tidak jarang banyak kesalahan terjadi

dalam proses preparasi sampel. Preparasi sampel yang salah dapat menyebabkan kesalahan

dalam interpretasi data klinik yang diperoleh. Maka dari itu setiap langkah dalam preparasi urin

harus benar-benar diperhatikan.

Sampel yang digunakan dalam analisis klinik dapat berasal dari darah maupun urin. Untuk darah

dapat dipilih whole blood, serum, ataupun plasma, tergantung dari data yang diinginkan. Secara

umum langkah-langkah dalam preparasi sampel terdiri dari :

A. PREPARASI PASIEN DAN KOLEKSI SAMPEL (PHLEBOTOMY) Sebelum dilakukan koleksi sampel tentunya dilakukan identifikasi pasien. Dalam

proses identifikasi ini pasien dicatat nama lengkap, tanggal pengambilan sampel, serta volume

sampel yang diperoleh. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kesalahan pelabelan

yang dapat berakibat pada kesalahan data. Kemudian data ini ditempelkan pada tabung (tube)

untuk koleksi sampel. Setelah itu pasien diberitahukan tentang prosedur pengambilan sampel

dan sebaiknya pasien berada dalam keadaan yang nyaman, terutama untuk koleksi sampel

darah.

Koleksi sampel darah dapat berasal dari kapiler maupun vena. Untuk koleksi darah

arteri sangat jarang digunakan kecuali pada kasus khusus seperti pada analisis gas yang

terkandung dalam darah. Darah kapiler biasanya diperoleh dari ujung jari dan volumenya

sangat kecil sehingga jarang digunakan untuk analisis rutin. Sebelum dilakukan pengambilan

ujung jari dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan air hangat. Kemudian oleskan krim

hidrofobik untuk menjaga sterilitas daerah yang akan diambil darahnya. Ambil darah dengan

menggunakan lancet. Darah akan keluar dengan spontan, kumpulkan dalam tube dan tutup

tempat keluarnya darah dengan plester steril.

Koleksi sampel darah vena tidak jauh berbeda dengan koleksi darah kapiler. Darah

vena biasanya diambil dari lengan karena vena di sini mudah untuk dideteksi. Dalam koleksi

sampel darah dari vena, biasanya digunakan tube tertentu tergantung dari kebutuhan analisis.

Urin merupakan sampel yang paling mudah didapatkan dalam proses klinik. Sampel

urin dapat digunakan untuk mengetahui status fungsi ginjal, kelainan pada saluran kemih, dan

kemungkinan dapat memberikan petanda adanya keabnormalan sistemik. Urin dikoleksi dalam

wadah bersih bebas bahan kimia, tidak steril, dan segera dibawa ke laboratorium dalam waktu

tak kurang dari 30 menit. Bila tidak segera dianalisis, dapat disimpan dalam refregerator, dan

dianalisis dalam waktu tidak lebih 8 jam kemudian. Biasanya sampel urin perlu diberi

preservasi untuk menjaga integritas kandungan analit.

Dalam proses koleksi sampel ini biasanya terdapat kesalahan – kesalahan seperti :



• Pelabelan salah atau tidak lengkap

• Jumlah tidak mencukupi untuk analisis

• Kesalahan dalam memilih tabung

• Instruksi pada pasien tidak tepat atau kurang lenkap

• Tutup tidak rapat sehingga menyebabkan tumpah atau terkontaminasi

• Gagal dalam memisahkan serum dari sel darah merah dalam waktu 60 menit

• Penjendalan darah tidak berhasil dengan baik

• Terjadi hemolisis

• Terjadi lipemia : kekeruhan pada serum yang disebabkan oleh diet.

B. PEMROSESAN SAMPEL Setelah dilakukan pengumpulan sampel maka sampel dapat diproses lebih lanjut.

Sampel darah biasanya digunakan serum atau plasma, meskipun sebenarnya tidak ada

perbedaan yang signifikan pada interpretasi data klinik dalam penggunaan serum maupun

plasma. Serum sering digunakan dalam analisis kimia, sedangkan plasma biasa

digunakan untuk analisis amonia, studi koagulasi, dan analisis beberapa trace elements.

Sampel plasma sering digunakan sebagai ganti serum bila proses penjendalan dirasa

lama, namun penggunaan sampel plasma memiliki kelemahan yaitu bila terjadi interaksi

antara antikoagulan dengan analit yang akan diperiksa atau reagen pada proses analisis.

1. Preparasi Plasma dari Whole Blood Langkah – langkah yang dilakukan adalah :

a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol,

tutup dengan plester.

b. Koleksi darah ke dalam tabung (tube) yang mengandung antikoagulan (EDTA,

heparin) sebanyak 3 ml.

c. Tube dibolak-balik 3-5 kali

d. Ambil 1 ml darah pindahkan ke Eppendorf e. Sentrifuge pada suhu 25o C pada 1300 rpm selama 3 menit

f. Ambil supernatan 250 μl

g. Simpan pada suhu -800 C sampai akan digunakan.

2. Preparasi Serum dari Whole Blood Langkah – langkah yang dilakukan adalah :

a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol,

tutup dengan plester.

b. Koleksi darah dalam tabung yang tidak mengandung antikoagulan sebanyak 3 ml



c. Disarankan dalam koleksi darah menggunakan tabung serum separator

d. Tabung digoyang – balik 5 kali

e. Diamkan selama 30-60 menit sampai terjadi penjendalan di bagian atas atau

dibiarkan semalaman pada suhu 4o C

f. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit

g. Serum ditempatkan dalam wadah plastik bebas antikoagulan maupun preservatif.

Sampel yang diperoleh dapat segera dianalisis untuk berbagai keperluan klinik.

C. PENGAMATAN SEL DARAHPengamatan sel darah dilakukan dengan menggunakan alat hemocytometer (bilik

hitung). Skema hemocytometer :

T/E T T/E

T T

T/E

T T

T/E T/E

Keterangan : Leu = Leukosit; T = Trombosit; E = Eritrosit

1. Perhitungan Leukosita. 20 μL sampel darah tambahkan pereaksi Turk 0,5 mL

b. Tunggu 15-20 menit

c. Hitung jumlah leukosit menggunakan hemositometer di mikroskop

Cara menghitung leukosit1) Pakailah lensa objektif kecil (pembesaran 10x). turunkan lensa kondensor atau

kecilkan diafragma mikroskop. meja mikroskop harus datar,

2) Kamar hitung dengan bidang bergaris diletakkan di bawah objektif dan fokus

mikroskop diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Dengan sendirinya leukosit-

leukosit akan jelas terlihat.



3) Hitunglah semua leukosit yang terdapat dalam keempat "bidang besar" pada

sudut-sudut "seluruh permukaan yang dibagi".

4) Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke

bawah dan dari kanan ke kiri dan seterusnya. Kadang ada sel yang

menyinggung garis suatu bidang, sel-sel yang menyinggung garis batas sebelah

kiri atau garis atas haruslah di hitung. Sebaliknya sel-sel yang menyinggung

garis sebelah kanan dan bawah tidak boleh dihitung.

Jumlah leukosit = 1 x faktor pengenceran x jumlah sel

terhitung

Vol.kotak

2. Perhitungan Eritrosita. 20 μL sampel darah tambahkan pereaksi Hayem 4 ml

b. Tunggu 2-3 menit

c. Hitung jumlah eritrosit menggunakan hemositometer di mikroskop

Cara menghitung eritrosit1) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus

dalam posisi rata air.

2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian

lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi

dalam bidang besar tengah jelas terlihat.

3) Hitung semua eritrosit yang terdapat dalam 5 bidang yang tersusun dari 16

bidang kecil (misalnya: pada keempat sudut bidang besar di tambah dengan satu

bidang di bagian tengah). Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara

menghitung leukosit.

Jumlah eritrosit = 1 x faktor pengenceran x

jumlah sel terhitung

Vol.kotak

3. Perhitungan Trombosita. 20 μL sampel darah tambahkan Amonium Oksalat 1% 2 ml

b. Tunggu 3-5 menit

c. Hitung jumlah trombosit menggunakan hemositometer di mikroskop

Cara menghitung trombosit



1) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus

dalam posisi rata air.

2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian

lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi

dalam bidang besar tengah jelas terlihat.

3) Hitung semua trombosit yang terdapat dalam 10 bidang yang tersusun dari 16

bidang kecil (sesuai dengan skema hemositometer untuk menghitung trombosit).

Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara menghitung leukosit.

Jumlah trombosit = 1 x faktor pengenceran x

jumlah sel terhitung

Vol.kotak

Daftar Pustaka Rai et al., 2005, Plasma Preparation From Whole Blood, Proteomics, 5:3262-3277.

Richterich, R and Colombo, J. P., 1981, Clinical Chemistry, John Wiley & Sons, USA.

PENETAPAN KADAR KREATININ(Sampel: plasma dan urin)

(Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi)

Prinsip:Metode ini sederhana, untuk penentuan kreatinin dengan bantuan larutan pikrat-basa, tanpa

deproteinisasi.

Pereaksi:

a. Larutan bufer = 6,26 g NaOH dan 0,89 g dalam akuades ad 1000.0 mL.

b. Asam pikrat = 2,0 g dalam akuades ad 1000,0 mL.



c. Larutan kreatinin baku = 1 mg dalam akuades ad 100,0 mL

d. Asam klorida = 0,83 mL HCL pekat dalam akuades ad 1000,0 mL. (HCl pekat : 36,5 %; bj

= 1,18)

Kondisi pengukuranLarutan bufer dan asam pikrat direaksikan pada suhu 20-37 ºC (bufer dan larutan asam pikrat

sebelumnya dibiarkan hingga mencapai suhu kamar).

Suhu analisis untuk sampel dan baku harus mirip.

Panjang gelombang (λ) = 492 nm, tebal kurvet 1 cm.

Konsentrasi dalam campuran reaksi akhir adalah sebagai berikut :

Larutan bufer = 125,2 mmol/L dan = 5 mmol/L; As. Pikrat = 3,5 mmol/L

Prosedur :

Sampel (μL) Baku/Blanko (μL)

Plasma atau

Urin (diencerkan 1 : 50)

50 -

Baku/Blanko - 50

Larutan buffer 1000 1000

Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar

Asam pikrat 250 250

Campurkan dan ukur absorban pertama (tidak lebih dari 1 menit) pada λ = 492 nm, tebal

kurvet 1 cm . Selanjutnya, ukur kembali absorban larutan tersebut 2 menit sesudah

pengukuran pertama ( ). Pada suhu > 30ºC, harus diukur tidak lebih dari 30 detik.

Metode tersebut menunjukkan linieritas hingga konsentrasi : 5 mg/100mL(422 mol/L)

Untuk konsentrasi > 5 mg/100 mL, plasma dan urin yang telah diencerkan tadi, harus

diencerkan dalam 1 : 6 larutan NaCl, dan sesudah pengulangan penentuan, hasil dikalikan

dengan 6.

Perhitungan :



Soal Latihan:1. Apakah kepentingan penetapan kadar kreatinin dalam analisis klinik ?

2. Bagaimanakah metobolisme kreatinin, dan dimana terdapat ?

3. Tuliskan pembentukan kreatinin pikrat ?

4. Gangguan apa saja yang dapat timbul pada penetapan kadar kreatini dalam plasma

dengan metode pikrat-alkali ?

5. Apakah kelebihan metode Jaffe yang dimodifikasi tersebut ?

6. Bagaimana cara mengatasi problema yang ada pada nomer 4 tersebut ?

7. Pelajarilah metode – metode lain untuk penetapan kadar kreatinin !

PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL(Sampel: plasma)

A. METODE : LIEBERMANN – BURCHARDPrinsip :

Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam

lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan

polimer hidrokarbon tan jenuh.

Pereaksi :a. Pereaksi kolesterol.

Mula-mula pereaksi cair didinginkan hingga 4ºC, kemudian ditambahkan

dalam wadah ( yang didinginkan dalam ice-bath) sambil diaduk (magnetik) dengan

urutan penambahan sebagai berikut :



Asam asetat glasial (30mL), asam asetat anhidrid (60 mL), dan terakhir asam sulfat

pekat (10 mL).

Ke dalam campuran tersebut, tambahkan natrium sulfat anhidrat (2 g) dan asam 2,5-

dimetilbenzensulfonat.

(Catatan : Larutan tersebut dalam botol gelap pada 4ºC stabil hingga 2 bulan.

Perubahan warna menjadi sedikit kuning tidak mengganggu reaksi).

b. Baku kolesterol.Timbang 250 mg kolesterol, masukkan ke dalam labu takar 100 mL. Larutkan

dengan asam asetat glasial (10 mL), selanjutnya tambahkan asam asetat glasial hingga

100 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.

Prosedur :

Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml :

Water-bath 37 ºC Sampel (ml) Blanko pereaksi (ml) Baku (ml)

Plasma atau serum 0,04 - -

Air demineral - 0,04 -

Larutan baku - - 0,04

Pereaksi kolesterol 2,0 2,0 2,0

Campurkan segera dan biarkan dalam water-bath pada 37ºC selama tepat 10 menit.

Kemudian campurkan dan baca absorban pada λ = 570 nm terhadap blangko pereaksi dalam

waktu tidak lebih dari 5 menit.

Perhitungan :

Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali.

B. METODE ENZIMATIKPrinsip :

Sampel direaksikan dengan reagen/KIT kemudian diinkubasi dalam water-bath pada 37 o C

dan dibaca absorbansinya pada λ 560 nm

Reaksi :Kolesterol ester + H2O kolesterol esterase kolesterol + as.lemak

Kolesterol + O2 kolesterol oksidase kolesterol-3-one + H2O2



2H2O2+4-aminoantipyrine+phenol peroxidase quinoneimine + 4H2O

Prosedur :

Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml :

Sampel (µl) Blanko pereaksi (µl) Baku (µl)

Plasma atau serum 10 - -

Air demineral - 10 -

Larutan baku - - 10

Pereaksi kolesterol 1000 1000 1000

Campurkan segera sampel/blanko/baku dengan reagen dan biarkan dalam water-bath pada

suhu 37ºC selama tepat 10 menit. Kemudian baca absorban pada λ = 560 nm terhadap

blangko pereaksi pada menit ke 0

Perhitungan :

kadar baku

Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali.

LDL kolesterol (mg/dl) = kolesterol total – HDL kolesterol – (Trigliserida / 5)

Soal Latihan:1. Apakah kepentingan penetapan kadar kolesterol pada analisis klinik ?

2. Bagaimana struktur kolesterol ? Apa yang dimaksud dengan kolesterol total?

3. Apa kelebihan metode Liebermann-Burchard pada penetapan kolesterol ?

4. Tuliskan reaksi yang terjadi pada nomer 3 !

5. Mengapa absorban dibaca pada λ 560 nm ?

6. Apa fungsi masing-masing pereaksi pada metode Liebermann-Burchard ?

7. Apa kelemahan metode Liebermann-Burchard?

8. Jelaskan prinsip metode enzimatik!

9. Sebutkan kelebihan dan kekurangan metode enzimatik!

10. Apakah yang dimaksud dengan HDL, LDL dan TG? Berapa range normalnya?



PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL(Sampel: plasma)

A. METODE ANILINPrinsip:

Bila aldose dan ketose dipanaskan dengan anilin dalam asam asetat glasial, akan terjadi

reaksi dan menghasilkan senyawa berwarna dengan panjang gelombang maks. 340 nm.

Pereaksi:a. Pereaksi asam triklorasetat (10%).

Larutan 10 g asam triklorasetat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini

stabil pada suhu kamar.

b. Pereaksi anilin

Larutan 6,0 g anilin (pro analisis) dalam asam asetat glasial hingga 100,0 mL. Larutan

ini stabil untuk beberapa bulan. Perubahan menjadi sedikit kuning tidak menimbulkan

gangguan.

c. Baku glukose

Larutan 110 mg glukose monohidrat dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam

air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.



Prosedur :

Kerjakan dalam tabung reaksi 10 mL:

Water-bath 37ºC Sampel (mL) Blangko pereaksi(mL) Baku (mL)

Asam triklor asetat 1,0 1,0 1,0

Darah, plasma, serum 0,1 - -

Air demineral - 0,1 -

Baku glucose - - 0,1

Biarkan beberapa saat, kemudian lakukan sentrifugasi dengan kuat. Pisahkan supernatant

Pereaksi aniline 5,0 5,0 5,0

Supernatan 0,5 0,5 0,5

Panaskan masing-masing tabung reaksi tepat 10 menit dalam water-bath mendidih. Angkat

tabung reaksi, dinginkan dengan air mengalir (air kran) dan baca absorban pada panjang

gelombang 340 - 440 nm, dengan blangko air demineral. Warna tersebut stabil selama 3 jam.

Perhitungan :

Kadar glukose normal dalam plasma = 80 – 120 mg/100 mL.

B. METODE ENZIMATIKPrinsip:

Prinsip dari metode enzimatik ini adalah enzim GOD akan mengoksidasi glukosa yang

nantinya akan menghasilkan asam glukonat dan H2O2. H2O2 yang dihasilkan setara dengan

glukosa yang bereaksi. H2O2 yang terbentuk akan direaksikan oleh peroksidase dan o-

dianisidin dan kemudian dihasilkan senyawa kunonimin (reaksi Trinder) yang berwarna merah,

yang bisa dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500nm.

Reaksi:Glukosa + O2 GOD asam glukonat + H2O2

O-dianisidin H2O2, peroksidase ion semiquinon + 4H2O

Prosedur :

A. Penetapan Kadar Karbohidrat Total



Sampel (µl) Blanko pereaksi (µl) Baku (µl)

Plasma atau serum 10 - -

Air demineral - 10 -

Larutan baku - - 10

Pereaksi kolesterol 1000 1000 1000

Inkubasi selama 10 menit di waterbath pada suhu 37°C kemudian baca absorbansi pada λ= 500

nm dalam rentang waktu 1 jam.

B. Penetapan Kadar GPTAmbil plasma sebanyak 100 µl lalu tambahkan dengan reagen I sebanyak 1 ml setelah itu inkubasi

di waterbath selama 5 menit pada suhu 37°C. Tambahkan reagen II sebanyak 250 µl kemudian

segera baca absorbansi pada menit ke 0, 1, 2, dan 3 dengan λ=340 nm. Lakukan replikasi 2 kali.

Perhitungan :

Kadar glukose normal dalam plasma = 80 – 120 mg/100 mL.

Soal Latihan :1. Apakah kepentingan penetapan kadar karbohidrat total pada analisis klinik?

2. Jelaskan metabolisme karbohidrat/glukose dan penyakit yang terkait ?

3. Apakah dasar penetapan kadar karbohidrat total dengan metade Anilin? Tuliskan

reaksinya !

4. Apakah guna asam triklorasetat tersebut ? Tuliskan reaksinya ! Bahan lain apakah yang

dapat menggantikan fungsi asam triklorasetat tersebut ?

5. Apakah kerugian/ kelemahan metode Anilin untuk penetapan kadar karbohidrat total ?

6. Sebut dan jelaskan metode lain untuk penetapan karbohidrat total !

7. Apakah makna hasil penetapan kadar karbohidrat total, terkait dengan

penyakit/kepentingan diagnose ?



PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN(Sampel: urin dan serum)

Urea merupakan senyawa hasil metabolisme nitrogen. Pengukuran kadar urea nitrogen dapat

dilakukan di dalam cairan tubuh, yaitu serum/plasma dan urin, dimana prinsip pengukurannya

didasarkan pada salah satu dari metode-metode berikut :

1. Reaksi urea dengan α-diketon dan senyawa -oksimMetode ini dapat menggunakan reagen diacetil, diasetil monoksim, diasetil dioksim,

fenilpropanadion, fenilpropanadion monoksim, α-isonitrosopropiofenon, heptoksim, nioksim,

dan diasetil monoksim glukuronolakton. Akan tetapi metode ini kurang spesifik karena

digunakan juga dalam penetapan kadar sitrulin, alantoin, kreatinin, arginin, protein, dan lain-

lain. Kelemahan lain yang dimiliki metode ini adalah produk warna yang dihasilkan kurang

stabil, tidak memenuhi hukum Lambert-Beer, serta memerlukan deproteinasi dan pemanasan

sampai 100o C.

2. Pengukuran kadar amonia yang dihasilkan dari reaksi urea dengan ureasePada metode ini, urea dipecah dengan enzim urease enghasilkan CO2 dan amonia.

Selanjutnya amonia yang dibebaskan ditetapkan kadarnya dengan reagen Berthelot. Belum

diketahui adanya senyawa lain dalam tubuh yang mengalami pemecahan yang sama dengan

urea, oleh karena itu metode ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap urea.

3. Pengukuran dengan elektroda ion selektifMetode ini memanfaatkan urease yang dilekatkan pada membran dan pengukuran

amonia yang dihasilkan dengan elektrode ion spesifik, tetapi metode ini masih dalam tahap

pengembangan.

4. Pengukuran urea dengan optical test, menggunakan urease dan glutamat dehidrogenase



Metode ini paling memuaskan karena penggunaan urease dikombinasikan dengan

glutamat dehidrogenase.

Metode fotometri lain, yaitu menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid atau xantidrol, akan tetapi

tidak spesifik dan belum banyak diketahui. Selain metode tersebut, urea dapat diukur dengan

mikrodifusi, gasometri atau metode elektrokimia, tetapi sulit diterapkan untuk pekerjaan rutin

Diantara metode tersebut, metode pemecahan dengan urease dilanjutkan dengan pengukuran

amonia dengan metode Berthelot paling sering digunakan

A. METODE BERTHELOTPrinsip:

Urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida dengan pemberian urease. Amonia yang

dibebaskan ditentukan dengan metode Bethelot.

Prinsip dari metode ini sebagai berikut :

NH2

C O + H2O 2

NH3 + CO2

NH2

Amonia yang dihasilkan ditetapkan kadarnya dengan metode Berthelot. Reaksi yang

terjadi sebagai berikut :

I. NH3 + HOCl H2NCl + H2O (pH > 7,5)

As. hipoklorit Kloramin

[Fe(CN)5NO]2- + 2 OH- [Fe(CN)5NO2]4- + H2O [Fe(CN)5H2O]3- +

NO2-

Nitroprusid nitritopentasianoferat

aquapentasianoferat

II. [Fe(CN)5H2O]3- + H2NCl kompleks + fenol

(dalam

medium basa)


urease


*pembentukan monokloramin berlangsung paling cepat pada pH 10.5, sedangkan pada pH > 11.5

berjalan sangat lambat dan pada pH < 10.5 produk monokloramin yang terbentuk cepat

terdekomposisi. Oleh karena itureaksi hendaknya dilakukan pada pH 10.5 – 11.5

*sensitifitas reaksi dapat ditingkatkan mensubstitusi posisi 2 dari cincin fenol dengan donor

elektron. Senyawa yang direkomendasikan adalah 2-klorofenol. Untuk tujuan klinik, salisilat terbukti

cukup sensitif.

Pengukuran kadar amonia dengan metode Berthelot sangat sensitif dan mempunyai

koefisien ekstingsi molar (ε) sebesar 20000. Selain itu metode ini memiliki spesifisitas yang tinggi

terhadap ion amonium. Reaksi berjalan lambat tapi dapat ditingkatkan dengan penambahan agen

pengkopling, seperti Na-nitroprusid.

Pereaksi :a. Larutan nitroprusid-salisilat.

Larutan 3 g natrium salisilat dan 60 mg natrium nitroprusid dalam air demineral hingga

100,0 mL. (Larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4 ºC dalam ruang gelap

atau 1 bulan pada suhu kamar).

b. Larutan stok hipoklorit (NaOCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Larutan tersebut dapat

disimpan selama 1 bulan pada suhu kamar.

c. Larutan natrium hidroksida (12,5 mol/L).

Larutan 50 g NaOH dalam akuades hingga 100,0 mL.

d. Larutan NaOH-hipoklorit (NaOC1 550 mmol/L; NaOH 6,25 mol/L).

Campurkan dengan jumlah yang sama larutan stok hipoklorit (1,1 mol/L) dengan larutan

NaOH (12,5 mol/L). (larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4ºC dalam ruang

gelap atau 1 bulan pada suhu kamar).

e. Larutan urea-nitrogen baku (20 mg/100 mL atau 7,13 mmol/L).

Larutan 42,8 mg urea dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral

dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan asam benzoat yang sama. Larutan ini

stabil dalam jangka waktu tak terbatas.

f. Bufer EDTA (27 mmol/L, pH 6,5).

Larutan 1 g .2H20 dalam 99 mL air demineral, atur pH larutan

hingga tepat 6,5 menggunakan larutan NaOH, encerkan dengan air demineral hingga

100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.

g. Larutan 25 mg urease dalam buffer EDTA dan encerkan hingga 50,0 mL denngan buffer

tersebut. Larutan stabil selama beberapa minggu pada 4 ºC



Prosedur :

Sampel(mL)

Blangko sample(mL)

Baku(mL)

Blangko baku(mL)

Larutan urease 0,1 - 0,1 -

Serum, plasma 0,02 0,02 - -

Larutan baku - - 0,02 0,02

Inkubasi pada 37ºC selama 20 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit

Larutan salisilas 2,5 2,5 2,5 2,5

Larutan urease - 0,1 - 0,1

Larutan hipoklorit 2,5 2,5 2,5 2,5

Biarkan masing-masing larutan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian baca absorban

terhadap blangko air demineral pada λ = 546 nm ( 540 – 590 nm).

Perhitungan :

Kondisi normal : Dewasa, n =

347

Urea nitrogen = 7,8 – 21,4 mg/100 mL.

Urea = 16,7 – 45,9 mg/100 mL.

B. METODE ENZIMATIKPrinsip:

Prinsip dari metode enzimatik ini adalah urea dalam sampel serum atau urin dengan bantuan

enzyme urease akan menghasilkan amoniak dan CO2. Kemudian amoniak bersama dengan

-ketoglutarat, NADH dan dibantu oleh enzyme GLDH akan menghasilkan L-glutamat, NAD

dan H2O. Penurunan absorbansi pada panjang gelombang 340 nm menunjukkan adanya

peningkatan NADH yang digunakan atau peningkatan kadar urea dalam sampel.

Reaksi:Urea + H2O urease amoniak + CO2

amoniak + -ketoglutarat + NADH + H+ GLDH L-glutamat + NAD + H2O

Prosedur :



Baku (μL) Sampel (μL)

Baku 10

Serum atau

Urin (pengenceran 101x)

- 10

Reagen 1 10 10

Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu 370 C

Reagen 2 250 250

Campurkan dan inkubasi selama 30-40 detik pada suhu 370 C

ukur absorban pertama (menit ke 0) pada λ = 365 nm, tebal kurvet 1 cm . Kemudian, ukur

kembali absorban larutan tersebut 1 menit sesudah pengukuran pertama ( ).

Perhitungan :Absorbansi sampel atau baku = [(A1 + A2)sampel/baku ] – [(A1 + A2) blanko]

2 2

Kadar urea = Absorbansi sampel x Konsentrasi Baku x faktor pengenceran (untuk urin)

Absorbansi baku

Soal Latihan :1. Apakah kepentingan penetapan kadar urea-nitrogen dalam analisis klinik ?

2. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar urea-nitrogen dengan metode

Betherlot !

3. Apakah kelebihan metode Berthelot pada penetapan kadar urea-nitrogen?

4. Mengapa digunakan air demineral ? Bagaimana cara membuat air demineral?

5. Apakah fungsi EDTA pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut ?

6. Apakah manfaat pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut, terkait dengan

kepentingan diagnose ?

7. Pelajarilah metode lain untuk penetapan kadar urea-nitrogen !

8. Jelaskan prinsip metode enzimatik!

9. Sebutkan keuntungan dan kelebihan metode enzymatik !

10. Jelaskan fungsi masing-masing reagen yang digunakan dalam metode enzymatik !



PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL(Sampel: urin)

A. METODE SPEKTROFOTOMETRI Prinsip :

Warburg dan Cristian adalah orang yang pertama kali memperkenalkan bahwa dengan

menggunakan persamaan sederhana atau nomogram, dapat dievaluasi konsentrasi protein

dan asam nukleat dari absorban larutan sample pada λ = 280 dan 260 nm. Penentuan

tersebut menggunakan prinsip pengukuran absolut.

Pereaksi :Larutan natrium klorida 0,9 %.

Larutan 0,9 g NaCl dalam akuades hingga 100,0 mL.

Prosedur :

Blanko (μL) Urin (μL)

Sampel 20 20

NaCl 1000 1000

Absorban larutan sampel yang ditentukan konsentrasi proteinnya diukur pada λ 260 dan 280

nm terhadap blangko larutan NaCl. Replikasi 2x

Perhitungan :

Konsentrasi protein = [1,55 x Abs. pada 280 nm] – [0,76 x Abs.pada 260 nm] mg/mL.

Selanjutnya hasil tersebut dibaca pada Nomogram.

Soal Latihan :1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik ?

2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri UV ?

3. Apakah syarat metode tersebut dapat digunakan ?



4. Gangguan apakah yang ada pada metode spektrofotometri UV tersebut ?

5. Pakah kelemahan spektrofotometri UV penetapan kadar protein ?

6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein !

Calculation

According to Layne.

Concentration = [ 1.55 E(280)] – [0.76E(260)] mg

Reading the result straight from the monogram (Fig.105).



B. METODE BIURETPrinsip :

Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam kupri dalam

suasana basa akan membentuk warna violet.

Pereaksi :a. Pereaksi basa.

Larutan 36 g urea dalam larutan NaOH ( 20 g/250mL akuades) dan encerkan hingga

100,0 mL dengan larutan NaOH yang sama.



b. Pereaksi Biuret.

Larutkan 4,25 g dalam lebih kurang 25 mL air demineral.

Larutkan 1,8 g KI dalam lebih kurang 25 mL air demineral.

Larutkan 43,5 g natrium sitrat dan 25 g dalam lebih kurang 250 mL air

demineral. Sambil diaduk/digoyang, tambahkan larutan tersebut di atas, dan

terakhir tambahkan larutan KI.

Masukkan 180 g urea ke dalam larutan terakhir tersebut dengan pengadukan tetap,

selanjutnya encerkan dengan air demineral hingga 500,0 mL.

c. Larutan Biuret.

Untuk penggunaan dalam analisis, campurkan sama banyak volume (1 bagian pereaksi

basa dan 1 bagian pereaksi Biuret).

d. Larutan albumin baku (tahan selama beberapa bulan pada suhu 4ºC).

Larutkan 7 g albumin baku dalam larutan KCl (373 mg/250 mL dalam akuades) yang

telah diatur pHnya hingga 6,5 – 6,8 menggunakan larutan natrium karbonat, selanjutnya

encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan KCl tersebut.

Prosedur :

Baku (μL) Urin (μL)

Sampel 20 20

Pereaksi Biuret 1000 1000

Pereaksi Basa 1000 1000

Baca absorban terhadap blanko aquadest antara menit ke 30 dan 40 sesudah pencampuran

pada λ 546 nm.

C. METODE FOTOMETRI DENGAN BROMOKRESOL-GREENPrinsip :

Dengan adanya bromokresol hijau dalam suasana asam, albumin yang berwarna kuning hijau

akan diubah menjadi hijau biru dan akan dibaca serapannya pada λ 546 nm.

Prosedur :



Baku Albumin (μL) Urin (μL)

Sampel 10 10

Reagen 1000 1000

Campurkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 370 C

Baca absorban terhadap blanko aquadest dalam rentang waktu 60 menit sesudah pencampuran

pada λ 546 nm. Replikasi 2 kali.

Soal Latihan ;1. Apakah kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri

UV ?

2. Apakah dasar penetapan kadar protein cara Biuret ?

3. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara Biuret ? Jelaskan

mengapa terbentuk warna?

4. Apakah kelebihan penggunaan albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ?

5. Apakah gangguan yang ada pada penetapan kadar protein cara Biuret ?

6. Apakah senyawa pengganti albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ?

7. Jelaskan prinsip penetapan kadar protein dengan metode fotometri dengan bromokresol

green !

8. Sebut dan jelaskan komponen dan fungsi reagen pada metode no. 7 !

DAFTAR PUSTAKA

Christian, G.D., 1994, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Lewandrowski, K., (Editor) 2002, Clinical Chemistry, Laboratory management and clinical correlations, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, A Wolters Kluwer Company, Philadelphia.

Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice, and Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester.

Smith, R.V. and Stewart, J.T., 1981, Textbook of Biopharmaceutic Analysis, A description of methods for the determination of drug in biological fluids, Lea & Febiger, Philadelphia.

Stryer, L., 1995, Biochemistry, Fourth Edition, W.H. Freeman and Company, New York.


kata pengantar · web viewpenetapan kadar kolesterol total 12 iv. penetapan kadar karbohidrat total...

Documents