PSI

50 Jakarta

LAPORAN AKHIR

·peNGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1

DENGAN PENDEKA TAN AGENT

KETUA PELAKSANA :

Dr. dr. Budiman Bela, SpMK

Tahun 2012

PUSA T BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHA TAN BADAN LITBANG KESEHATAN

DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSA T PENELITIAN DAN LA YANAN KESEHA TAN VIROLOGI DAN

KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA

2012

- ·

1 . � . '1 ''u' 'l� ... ,.,, .. : t: "'"'- � J ·�n .. ' �· ... ... l '4t .. -i • � .d, . ! l

/f}- �::_-�(J.___ ' 1 i

LAPORAN AKHIR

PENGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1

DENGAN PENDEKA TAN AGENT

KETUA PELAKSANA :

Dr. dr. Budiman Bela, SpMK

Tahun 2012

PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHA TAN SADAN LITBANG KESEHA TAN

DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSA T PENELITIAN DAN LA YANAN KESEHA TAN VI RO LOG I DAN

KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA

2012

.JUDUL PENELITIAN

Pmgembangan Prototipe Vaksin H5Nl dengan Pendekatan Agent

D. LATAR BELAK.ANG

Virus Influenza A galur baru penyebab pandemi dapat muncul sewaktu-waktu secara

terduga karena struktur antigen virus ini dapat berubah melalui proses mutasi genetik

_ '2rlg berlangsung cepat dan sering disebut sebagai antigenic shift maupun melalui proses

perubahan secara lambat yang disebut antigenic drift. Adanya reservoir pada hewan, yaitu

pada unggas air liar maupun terdomestikasi, yang tidak memperlihatkan gejala jelas atau

tidak menyebabkan kematian pada saat terinfeksi virus ini mengakibatkan virus ini terus

menerus bersirkulasi di alam dan menghasilkan varian-varian virus baru tanpa terdeteksi.

Interaksi unggas air secara langsung dengan manusia maupun melalui unggas maupun hewan

peliharaa:r:i lainnya berpotensi . menimbulkan virus influenza A galur baru yang dapat

berkembang menjadi virus penyebab pandemi.

Sebagian besar infeksi virus influenza A pada manusia tidak menimbulkan penyakit

dengan gejala yang berat, tetapi angka kematian yang terjadi pada pandemi tidak dapat

diabaikan, bahkan pada beberapa kejadian pandemi angka kematian yang ditimbulkan sangat

tinggi (1). Hal ini menyebabkan Badan Kesehatan Dunia (World Health Organization/WHO)

menghimbau negara-negara di dunia 1:1ntuk mengerobangkan dan mengimplementasikan

rencana persiapan pandemi untuk mitigasi dampak kesehatan dan sosial pandemi (2).

Virus Influenza A merupakan salah satu tipe virus influenza yang terdiri atas virus

influenza A, B dan C. Virus influenza A terdiri atas beberapa subtipe yang ditentukan

berdasarkan tipe antigen hemagglutinin (H) dan neuraminidasa (N), dimana terdapat 16 jenis

antigen H dan 9 jenis antigen N (3,4). Subtipe virus Influenza A yang lazim ditemukan

bersirkulasi pada manusia saat ini adalah HI NJ dan H3N2 (5). Selain kedua subtipe

tersebut, beberapa subtipe virus Influenza A ditemukan pada rnanusia temyata berasal dari

hewan. Virus lnfluenza A berasal dari hewan yang meJewati "batas lintas spesies" sehingga

menginfeksi manusia antara lain disebabkan subtipe HlNl, H7N7, H9N2, H7N3, H5Nl dan

H10N7 (1,6) Virus influenza unggas H5Nl (Al H5N1) dipandang berpotensi sebagai

agensia penyebab pandemi influenza global sejak virus ini ditemukan melewati "batas lintas

spesies" dan ditemukan menginfeksi manusia pada tahun 1997 (1, 7,8).

lnfeksi influenza A H5Nl pada manusia ditemukan pertama kali pada tahun 2005 dan

sampai dengan 6 Mei 2010, jumlah kasus infeksi influenza A H5Nl terkonfinnasi mencapai

165 kasus dengan jumlah kematian sebanyak 136 orang (82,4%) (9,10). Sejak tahun 2007

sampai saat ini jumlah kasus infeksi influenza A H5N1 terlihat menurun (10), namun

kemungkinan munculnya virus influenza A H5Nl galur baru penyebab pandemi perlu untuk

diwaspadai. Peningkatan migrasi penduduk secara global, posisi geografis Indonesia yang

terletak pada jalur migrasi unggas liar, serta fakta bahwa unggas liar merupakan "reservoir"

virus influenza A menjadi alasan penting yang menjadi landasan untuk senantiasa

memperhitungkan influenza A, khususnya influenza A H5Nl sebagai potensi ancaman bagj

kehidupan masyarakat Indonesia.

Kewaspadaan terhadap munculnya virus influenza A H5N1 galur baru akibat

fenomena antigenic drift maupun antigenic shift yang berpotensi sebagai penyebab pandemi

perlu untuk dipertahankan mengingat berdasarkan peristiwa pandemi sebelumnya, virus

influenza A penyebab pandemi merupakan virus influenza A unggas dengan kemampuan

transmisi dari orang ke orang. Penting untuk diperhatikan pula bahwa vims influenza A

H5Nl yang semula · hanya ditemukan di unggas dan tidak menginfeksi manusia kemudian

menunjukkan kemampuan melintasi batas antara spesies sehingga ditemukan di manusia dan

kemudian bahkan ditemukan mampu melakukan infeksi dari orang ke orang walaupun masih

secara terbatas dalam kelompok tertentu yang mungkin hampir seluruhnya memiliki

hubungan kekeluargaan.

Salah satu upaya persiapan pandemi Influenza A yang direkomendasikan oleh WHO

pada tahun 2005 ialah pengembangan vaksin yang efektif, khususnya yang memiliki

spektrum proteksi yang luas (11). Vaksinasi merupakan strategi intervensi yang bersifat

.. cost-effective" karena respon irnun terhadap vaksin influenza A bersifat protektif sehingga

mampu mencegah terjadinya infeksi yang berpotensi menyerap pendanaan dalam jumlah

besar untuk biaya diagnosis, perawatan dan pengobatan. Strategi vaksinasi merupakan salah

satu strategi yang dapat diharapkan mencegah angka morbiditas dan mortalitas tinggi pada

saat munculnya galur virus influenza A baru dengan struktur antigen yang belum dikenali

oleh imunitas populasi manusia, namun terdapat permasalahan yang perlu untuk dipecahkan

agar strategi ini dapat diterapkan secara berhasil. Walaupun vaksinasi Influenza A

merupakan strategi pengendalian infeksi yang dapat dianggap murah dan efektit:

pengembangan vaksin Influenza A berdasarkan teknologi yang dipakai saat ini yaitu

menggunakan telur ayam berembrio memiliki kendala tersendiri. Kendala utama dalam

jpiDduksi vaksin Influenza A pada telur ayam berembrio ialah pada potensi teknologi ini

.=enghasilkan jumlah vaksin yang mencukupi dalam waktu yang relatif cepat, dimana hal ini

smgat penting agar pemberian vaksin dapat dilakukan sebelum terjadinya infeksi pada

.sebagian besar populasi penduduk suatu negara (12,13). Di sisi lain, vaksinasi seluruh

populasi negara bukanlah hal yang mudah untuk dilakukan, karena tidak hanya memerlukan

ketersediaan vaksin spesifik yang mampu memberikan perlindungan terhadap galur virus

baru, tetapi juga memiliki tantangan tersendiri dalam distribusi vaksin, khususnya di wilayah

lndonesia yang sulit untuk dijangkau dalam waktu cepat.

Vaksin DNA menarik untuk dikernbangkan dalam rangka persiapan menghadapi

pandemi influenza A. Waktu yang dibutuhkan untuk melakukan konstruksi "bibit vaksin"

serta memperoleh vaksin dalam skala besar yang mencukupi untuk vaksinasi seluruh populasi

penduduk suatu negara dengan jum lab populasi yang besar seperti Indonesia dapat dilakukan

dalam kurun waktu 11 minggu, sehingga vaksinasi seluruh populasi secara teoritis dapat

dilakukan dalam kurun waktu kurang dari 16 minggu sejak susunan nukleotida virus

penyebab pandemi diperoleh. Sifat DNA yang relatif jauh lebih-stabil dibandingkan protein

memungkinkan vaksin DNA untuk disebarluaskan ke seluruh pelosok negara, khususnya

negara kepulauan seperti Indonesia, dengan cara yang lebih mudah karena tidak tergantung

kepada sistem pendingin untuk mempertahankan stabilitas dan efektivitas vaksin.

Vaksin DNA telah terbukti dapat menimbulkan proteksi silang antar subtipe influenza A

yang berbeda, bila gen yang disisipkan pada vektor vaksin DNA merupakan gen

pengekspresi protein bersusunan asam amino terkonservasi pada berbagai subtipe virus

influenza A, misalnya gen pengekspresi protein matriks dan nukleoprotein. Ditinjau dar.i segi

keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon imun seluler, maka dapat diperkirakan

bahwa vaksin DNA pengekspresi protein H dan N dari subtipe tertentu berpotensi lebih besar

untuk menghasilkan proteksi silang terhadap varian-varian galur tersebut karena respon imun

seluler memiliki kemampuan pengenalan epitop yang lebih beragam dibandingkan respon

imun humoral (14). Selain itu, tidak tertutup kemungkinan bahwa vaksin DNA berdasarkan

suatu subtipe virus influenza A dapat memberikan proteksi terhadap infeksi oleh virus

influen:za A subtipe lainnya. Kemungkinan ini menjadi terbuka berdasarkan fakta yang

ditemukan bahwa infeksi sebelumnya oleh suatu subtipe influenza A dapat memberikan

proteksi terhadap infeksi oleh virus influenza A subtipe lain yang terjadi kemudian (15, 16).

�ieSpOU ilnun yang diinduksi oleh vaksin DNA meliputi respon imun sel T CD8, sel T

,.,..-_ re.spcm imun humoral dan juga respon imun nonspesifik (inate immunity) melalui

-.--. .... - Toll like receptor (TLR). Respon imun humoral berperan dalam netralisasi virus

� tidak dapat melakukan penempelan pada reseptor sel targetnya, disamping itu

c::�Nli yang berikatan dengan partikel virus juga mengakibatkan penempelan antibodi pada

se.I urinfeksi yang mengekspresikan partikel virus sehingga sel-sel NK (natural killer) tertarik

:-.. melepaskan substansi-substansi yang bersifat toksik terhadap sel terinfeksi tersebut.

� sel T CD8 berperan dalam penghancuran sel-sel terinfeksi yang mengekspresikan

virus di dalam molekul MHC kelas I akibat interaksi spesifik antara reseptor sel T

c..ecgan antigen virus. Perangsangan sel T CD4 (sel T helper) meningkatkan efektivitas

sisrem imun spesifik yang ditimbulkan oleh vaksin dalam rnelakukan eliminasi infeksi virus

i!:Jaik melalui jalur respon imun humoral maupun respon imun seluler.

Vaksin DNA jauh lebih stabil dibandingkan dengan vaksin berbentuk antigen protein

serta dapat dengan mudah disediakan dalam bentuk preparat kering tanpa mengurangi

stabilitas dan kemampuannya menginduksi respon lmun. Hal mi merupakan saJah satu

keunggulan yang mempermudah distribusi vaksin DNA ke seiuruh pelosok Indonesia tanpa

kendala ketergantungan pada "rantai dingin" yang memerlukan fasilitas pendingin khusus

untuk penyimpanan vaksin. Keunggulan vaksin DNA yang lain ialah pada teknik amplifikasi

"seed vaccine" yang relatif lebih murah dan berpotensi untuk dilakukan dengan

memanfaatkan bahan-bahan baku yang diproduksi sendiri di Indonesia.

Modifikasi vaksin DNA untuk meningkatkan imunogenitas vaksin telah dilaporkan dalam

beberapa penelitian. Penambahan gen Interleukin-2 (IL2) telah diketahui dapat meningkatkan

efikasi vaksin DNA (J 7 ). Modifikasi lain adalah modifikasi antigen sehingga menjadi

antigen yang dapat disekresikan (18). Dalam penelitian ini akan dilakukan modifikasi pada

vaksin DNA sehingga antigen virus yang djhasilkan akan membentuk viral like parlicle

(VLP). Selain itu akan dilakukan fusi antara gen penyandi antigen virus dengan susunan

nukleotida penyandi peptida atau protein yang diharapkan dapat meningkatkan respon

antibodi (sel B), respon sel T-CD4 dan respon sel T-CD8. Untuk meningkatkan respon

antibodi dilakukan fusi antigen virus dengan komplemen C3d yang diharapkan akan

meningkatkan stimulasi sel B yang dipicu oleh interaksi C3d-CD21 sedangkan fusi antigen

dengan CD40L dilakukan untuk aktivasi sinyal kedua melalui interaksi CD40-CD40L untuk

stjmulasi Janjut pada set B. Komponen lain yang juga menarik untuk disertakan ialah

komponen interaksi CD28-B7. Fusi antigen deogan komponen C3b diharapkan akan

C!D.ingkatkan fagositosis �ntigen oleh makrofag yang akan berubah menjadi "Antigen

P:?:senting Cells" untuk stimulasi sel T-CD4 spesifik. Stimulasi sel T-CD8 oleh vaksin DNA

c..ipat dikatakan merupakan sifat alamiah vaksin DNA, karena antigen yang dihasilkan oleh

:!ksin DNA diproduksi oleh sel resipien vaksin sehingga bersifat antigen endogen yang

.;enlapat dalam sitosol.

Vaksin jenis lainnya yang juga menarik untuk dikembangkan adalah vaksin subunit

rekombinan, khususnya yang diekspresikan pada sistem ekspresi prokariota, misalnya

Escherichia coli. Vaksin rekombinan yang diekspresikan pada E.coli memiliki keunggulan

dari segi biaya produksi karena medium yang digunakan relatif jauh lebih murah

dibanding.kan medium kultur sel, selain itu tingkat produksi antigen rekombinan juga relatif

cinggi. Sistem purifikasi antigen rekombinan juga telah dikembangkan sehingga

memungkinkan produksi dalam jumlah besar. Untuk mengatasi pennasalahan kesulitan

antigen eksogen menstimulasi respon sel T-CD8, akan dilakukan fusi antara protein

rekombinan dengan protein listeriolysin dan susunan asam amino yang mampu meni�gkatkan

ubikuitinasi. Protein· listeriolisin diharapkan- akan meningkatkan lokalisasi protein yang

difagositosis oleh makrofag ke dalam sitosol sedangkan susunan asam amino yang

meningkatkan ubikuitinasi diharapkan akan meningkatkan proteolisis antigen di proteasom

sebingga epitop antigen eksogen yang diinjeksikan pada resipien vaksin akan terekspresi

pada molekul MHC kelas I untuk stimulasi sel T-CD8 spesifik. Alternatif lain yang dapat

dilakukan ialah melakukan fusi dengan protein voyager virus herpes simpleks meningkatkan

meningkatkan penetrasi antigen ke dalam set non fagosit.

Telah diketahui bahwa stimulasi respon antibodi oleh antigen berstruktur repetitif lcbih

kuat dibandingkan stimulasi oleh antigen berepitop tunggal. lnteraksi epitop repetitif pada

antigen berstruktur repetitif dengan reseptor spesifik pada sel B (antibodi pada permukaan sel

B) akan mengakibatkan sambung silang (cross-linking) reseptor spesifik pada permukaan sel

B dan menimbulkan stimulasi kuat pada sel B. Partikel virus pada dasarnya merupakan

komponen repetitif yang terbeotuk oleh perakitan mandiri (selfassembly) komponen protein

pembentuk partikel virus, sehingga secara alamiah partikel virus merupakan stimulator kuat

respon sel B karena interaksi reseptor spesifik pada sel B dengao epitop repetitif pada

permukaan partikel virus memungkinkan terjadinya fenomena sambung silang pada

pennukaan sel B.

?embentukan partikel virus tanpa kandungan materi genetik dapat terjadi secara alamiah

a::.?::!pUll secara artifisial. Struktur partikel virus tanpa kandungan materi genetik disebut juga

�oai Viral Like Particle (VLP). Imunisasi binatang percobaan dengan VLP influenza A

tclah terbukti dapat menghasilkan respon imun protektif pada uji tantang binatang yang telah

&i:munisasi dengan partikel virus influenza A infeksius homologus (19). Pembentukan YLP

influenza A telah dicoba pada sistem ekspresi mamalia (sel mamalia) dan sistem ekspresi

baculovirus (sel serangga) (19,20).

Penelitian ini secara umum bertujuan untuk menghasilkan berbagai prototipe vaksin

\-aksi:n influenza A serta melakukan penilaian efektivitas vaksin maupun aspek ekonomi

Derbagai prototipe vaksin tersebut. Vaksin yang dikembangkan berupa vaksin DNA, vaksin

'LP dan vaksin protein subunit rekombinan. Setiap jenis prototipe vaksin influenza A yang

embangkan dalam penelitian ini akan diteliti potensinya sebagai kandidat vaksin persiapan

?Jldemi melalui uji respon imun humoral, uji respon irnun selular dan uji tantang terhadap

�rbagai jenis galur virus influenza A H5Nl yang berkembang di Indonesia, rnaupun

�adap virus influenza A subtipe lainnya.

Institusi pelaksana penelitian, telah berpengalaman dalam pengembangan prototipe

Vclksin DNA, maupun prototipe vaksin protein subunit rekombinan. Berbeda dengan

prototipe vaksin DNA influenza A H5Nl yang akan dikembangkan dalam penelitian ini,

pototipe vaksin influenza A H5N 1 yang dikembangkan sebelumnya di institusi pelaksana

�elitian tidak difusikan dengan susunan nukleotida yang bersifat ajuvan.

PERMASALAHAN

Galur virus influenza A H5N1 penyebab pandemi sulit untuk diprediksi karakteristik

�iknya karena informasi yang dimiliki mengenai pola replikasi virus serta faktor-faktor

c::clekular yang mendasari tahapan inteksi virus pada berbagai spesies belum mencukupi

1- dipakai dalam penentuan arah evolusi virus influenza A H5Nl yang berpotensi sebagai

� influenza A penyebab pandemi. Walaupun demikian, dapat diperkirakan bahwa

tlrur antigen yang dimiliki oleh virus influenza A H5Nl galur baru akan memiliki

pt:ESamaan epitop dengan virus influenza A yang beredar saat ini sehingga respon imun yang

Chduksi oleh antigen virus influenza A H5Nl berbasis susunan asam amino galur tahun ini

bapotensi memiliki daya proteksi silang dengan galur baru virus influenza A H5Nl yang

- bu] di kemudian hari sebagai penyebab pandemi. Potensi persamaan epitop ini khususnya

Lehih tinggi pada epitop yang dikenali oleh sel T, baik sel T CD4 maupun sel T CD8.

Untuk menghadapi kemungkinan timbulnya virus influenza A non H5Nl sebagai

j)eflyebab pandemi influenza A, perlu diteliti potensi protein virus influenza A dengan

susunan asam amino terkonservasi pada semua subtipe influenza A untuk dikembangkan

sebagai vaksin persiapan pandemi influenza A baru. Protein matriks dan nukleoprotein

berpotensi sebagai kandidat vaksin yang memenuhi persyaratan ini. Di sisi lain, perlu

dipikirkan penghambatan replikasi virus oleh respon antibodi netralisasi yang sebagian besar

bekerja berdasarkan interaksi dengan protein permukaan Hemaglutinin. Untuk ini dapat

dipertimbangkan perancangan susunan asam nukleat penyandi antigen Hemaglutinin

beberapa subtipe influenza A yang berpotensi penyebab pandemi, dengan susunan asam

amino konsensus pada setiap subtipe tersebut. Antigen permukaan yang mungkin dapat

dianggap mendesak untuk dikembangkan ialah antigen hemaglutinin HS, H9, dan H l (2009),

neuraminidasa NI dan N2.

Keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon sel T-CD8 spesifik secara

efisien pada pernberian vaksin untuk "priming" dapat berpotensi merugikan dalam pemakaian

vaksin DNA sebagai "booster". Respon sel T-CD8 yang dihasilkan melalui vaksinasi

sebelumnya dapat mengakibatkan destruksi sel yang mengekspresikan antigen vaksin DNA,

sehingga stimulasi respon imun oleh vaksinasi booster kurang efektif akibat penurunan

jumlah dan masa pemaparan antigen dengan sistem imun. Untuk mengatasi permasalahan ini

diperlukan vaksinasi menggunakan antigen eksogen yang tidak hanya mampu menginduksi

respon antibodi dan respon sel T-CD4 secara efisien, tetapi juga mampu menginduksi respon

sel T-CD8 yang diperlukan untuk eliminasi sel terinfeksi virus.

Antigen eksogen yang dipakai untuk imunisasi booster pasca imunisasi awal dengan

'":1'3.ksin DNA dapat berupa virus hidup dilemahkan, partikel vims terinaktivasi, Viral Like

Particle maupun protein subunit. Jenis antigen yang paling mudah dan relatif paling murah

JDtuk dikembangkan ialah vaksin protein subunit, khususnya yang diekspresikan pada sistem

ekspresi prokariota. Telah diketahui bahwa protein hemaglutinin virus influenza A dapal

diekspresikan secara efisien pada sistem ekspresi prokariota dengan melakukan optimasi pada

susunan kodon serta menggunakan galur sel Escherichia coli (E. coli) tertentu yang dapat

i:nengatasi permasalahan toksisitas protein rekombinan sel E. coli. Produksi protein

rekombinan menggunakan sistem ekspresi E. coli relatif jauh lebih murah dibandingkan

�·--.u· antigen virus menggunakan kultur sel mamalia ataupun menggunakan telur ayam

�rio. Antigen eksogen lainnya yang dapat dipakai untuk imunisasi booster ialah

� eksogen berbentuk VLP. Antigen jenis ini dapat menginduksi respon sel B yang kuat

tQCaJ3 mampu rnelakukan cross-linking reseptor sel B spesifik oleh epitop repetitif pada

ukaan VLP. Antigen VLP dapat diproduksi pada sistem ekspresi mamalia, sistem

c...spresi baculovirus, dan sistem ekspresi tumbuh-turnbuhan.

Proses produksi maupun antigen yang dihasilkan dari tumbuh-tumbuhan, sistem

-d:spresi prokariota tidak mengandung komponen binatang, seperti halnya antigen virus yang

Cproduksi menggunakan kultur sel MOCK (berasal dari anjing), sehingga permasalahan

��g terkait produk binatang seperti kandungan patogen hewani dan permasalahan halal

:::m.upun haram dapat terhindarkan. Vaksin protein subunit rekombinan berpotensi untuk

digunakan dalam vaksinasi "booster" pasca imunisasi dengan vaksin DNA. Pemberian

Tak.sin ini dengan jalur administrasi ataupun pencampuran dengan ajuvan yang sesuai juga

dapat diarahkan untuk merangsang respon lgA spesifik maupun respon sel T-CD8.

Beberapa pertanyaan yang perlu dijawab dafam pengembangan vaksin influenza A·

berbasis DNA, antigen rekombinan prokariota dan VLP ialah:

I. Bagaimana pengaruh fusi antigen vaksin influenza A dengan masing-masing komponen

C3d, CD40L, CD28, listeriolysin, Vif HIV-I dan protein voyager Herpes Simpleks

terhadap respon imun humeral dan selular?

2. Apakah vaksinasi dengan antigen NJ konsensus dapat menimbulkan respon. sel T

sitotoksik terhadap sel pengekspresi antigen neuraminidasa HlNl dan H5Nl?

3. Bagaimana respon antibodi netralisasi yang ditimbulkan oleh imunisasi antigen H5 dan

HI bersusunan asam amino konsensus terhadap infeksi beberapa galur H5 dan HJ?

-t Bagaimana kombinasi pemberian vaksin untuk "priming" dan "booster" yang dapat

secara efisien merangsang respon imun humoral, sel T CD4 dan sel T CD8?

5. Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A HINI dan H5Nl bervirulensi

tinggi dapat pasca "priming" menggunakan vaksin DNA influenza A?

6. Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A H1Nl dan H5N1 dapat

diperoleh dalam tempo kurang dari I minggu pasca vaksinasi menggunakan kombinasi

vaksin yang akan diteliti?

7. Apakah respon protektif masih dapat diinduksi oleh vaksinasi pada individu yang berada

pada fase dini infeksi influenza A?

:IL MANFAAT PENELlTIAi�

_ Infonnasi yang diperoleh dari penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh peneliti lain untuk

pengembangan vaksin influenza A berdaya proteksi tinggi maupun vaksin virus

berenvelop lainnya

Prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini berpotensi untuk dipatenkan

sebagai "seed vaccine" nasional yang merupakan hak milik bangsa Indonesia

"' .knis vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai model

notuk penelitian respon imun humeral, respon imun set T CD4 maupun sel T CD8

terhadap berbagai jenis antigen lainnya

-r... Berbagai jenis "platform'' prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini akan

memberikan alternatif yang lebih luas untuk mendapatkan prototipe vaksin influenza A

yang efektif, aman dan stabil, serta dapat diproduksi secara cepat dan mudah dengan

biaya produksi yang relatif lebih ekonornis.

5. Infonnasi yang diperoleh melalui eksperimen imunisasi dengan berbagai komposisi

vaksin pada vaksinasi "priming" dan "booster'' bermanfaat untuk menentukan komposisi

vaksin pada "priming" dan "booster" yang mampu merangsang respon imun secara lebih

dini dan eftsien

Pengalarnan yang diperoleh dari penelitian ini meningkatkan kemampuan peneliti untuk

merancang strategi pengembangan vaksin . .

7. Pengalaman yang diperoleh dalam melakukan pengembangan vaksin DNA dan vaksin

rekombinan yang diproduksi dalam berbagai sistem ekspresi dapat dibagikan kepada

kelompok penelitian Indonesia lainnya untuk meningkatkan kemandirian bangsa

Indonesia dalam teknologi pengembangan vaksin

8. Keterlibatan peneliti-peneliti muda dalam penelitian ini akan menghasilkan generasi peneliti

baru yang memiliki wawasan luas ser:ta keterampilan menyusun strategi penelitian dan

keterampilan teknis yang lebih tinggi dalam pengembangan dan penelitian vaksin

JC. TUJUAN PENELITIAN

T � uan Umum:

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan beberapa kandidat vaksin

influenza A H5Nl dalam bentuk vaksin DNA, antigen rekombinan prokariota dan

antigen VLP dalam bentuk protein fusi maupun non fusi dengan komponen C3d,

CD40L, CD28 dan listeriolisin Listeria monocytogenes serta mendapatkan informasi

mengenai respon imun humoral dan selular yang ditimbulkan oleh kombinasi vaksin

yang diberi.kan sebagai "priming" dan "booster" sebagai landasan untuk menetapkan

komposisi serta cara pemberian vaksin yang memberikan respon irnun protektif yang

lebih dini dan lebih efisien.

jaan Khusus

Tujuan khusus penelitian ini ialah:

1. Mendapatkan konstruksi vektor vaksin DNA fusi dan non-fusi pengekspresi

antigen H5, NI, MA dan NP.

2. Mendapatkan kandidat vaksin VLP mengandung komponen HA+NA+MA

(dengan atau tanpa NP) untuk influenza A subtipe H5Nl

3. Mendapatkan kandidat vaksin influenza A H5, HI, MA dan NP berupa protein

rekombinan prokariota

4. Mendapatkan informasi mengenai pengaruh penambahan C3d, CD40L dan CD28

pada antigen prokariota terhadap respon sel T CD4 dan respon antibodi

5. Mendapatkan infonnasi mengenai pengaruh fusi antigen influenza A dengan

listeriolisin, Vif HIV-I dan protein Vp22 Herpes Simpleks terhadap pembentukan

respon sel T CD8 spesifik epitop antigen virus influenza

6. Mendapatkan informasi mengenai potensi vaksin DNA influenza A untuk

menimbulkan respon imun protektif pasca pemberian vaksin untuk "priming"

7. Mendapatkan komposisi vaksin "priming" dan "booster" yang dapat

menimbulkan respon protektif lebih dini secara lebih _efisien

8. Mendapatkan infonnasi m engenai . pemakaian vaksin influenza A untuk

mendapatkan efek kuratif pada individu (hewan coba) yang telah terinfeksi

9. Mendapatkan informasi mengenai jangka waktu timbulnya respon protektif pada

komposisi vaksin yang dinilai memiliki respon imun seluler dan humoral yang

terbaik serta memiliki potensi paling tinggi pada uji tantang hewan coba dengan

infeksi virus influenza A H5NI atau HIN I

" :\fETODE PENELITIAN

_ !Keraogka Konsep Penelitian

Komponen anngen

Subtipe Virus Influenza virus:

A - Hemaglutrnrn (HA)

I -H5N1 - Neuramin ldase (NA)

-HlN'I -Malrrks (MA1)

- H9N2 • Nukleoprotern (NP)

I I .i.

Efektivitas i

I -Vaksin sebagai

Daya Proteksi I � vaksin Pre-.S1lan1J � pandemidan ·� - Pandemi --- I Strmu lasi I I Dosis Vaksin I f -..

I Pen rn gkatan Peningkatan P-en in gkaran II titer anhbodi JUmlahSelT JU'mlah SelT spesifik CD8 spesrfik CD4spesrftk

1 I �;E::�1 I I :r;:�is I V'l•ulUtd'!:>I SelTCD4

Stimulas1 I � ..... 01'> •':1 L - ,,,. TLR / - -� .. -·""'

I I y hayau pada

Peptida aJ Lrvan

·

Komposls1 d1m cara Ben1ukvaksrr1 proses produ",;'

-C3d pemberian vaksin ••'"'IC:1i'\ - DNA -CD40L • Komblnasi]enis - protein rekombrnan E. l\ecepatan

I - CD28 vaksin -coli - produksiveksm

- Listenolysm - Cara pemberian . VLP (baculovirus) ' Peptida VP22 vaksrn Stabrhtas vaksrn I

-

Variabel yang berada di Juar kotak tidak tennasuk dalam variabel yang ak:an diteliti dalam penelitian yang diusulkan

··i Tempat Penelitian

- Laboratorium dengan fasiJitas Biologi Molekular, Rekayasa DNA dan Rekayasa Protein

- Laboratorium dengan fasilitas BSL-2 dan BSL-3 - laboratorium dengan fasilitas BSL-3 hewan

1 Waktu Penelitian

Lama Penelitian: 3 tahun 2012 - 2014

A. Jenis Penelitian

Penelitian intervensi

..5.. Disain Penelitian

Disain penelitian ini ialah eksperimen

Populasi dan Sampel

ft>pulasi penelitian ialah hewan coba berupa mencit (Mus musculus) galur Balb/c atau .:!rlY. Akan dilakukan beberapa eksperimen menggunakan hewan coba untuk meniJaj -;:engaruh fusi peptida ajuvan, dosis dan kombinasi pemakaian prototipe vaksin dalam ZKSinasi "priming" dan "booster", maupun pengaruh pencampuran prototipe vaksin

C:tlam satu sediaan terhadap respon imun spesifik (antibodi, sel T CD4, sel T CD8), daya teksi silang, proteksi dini dan efek kuratif vaksinasi.

Perhitungan sampel dilakukan berdasarkan rumus Federer: t-1) (n-1) 2:_ 15, dimana

= jum lah kelompok perlakuan - = jumlah individu dalam setiap kelompok perlakuan

- Variabel

1

�.:i:c:I;ksi" Struktur Sekunder dan Tersier Protein Fusi

_ :::!>el independen:

Smunan Asam Amino H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell pene�ating peptide CPP) · Listeriolysin dan VP22, situs insersi peptida ajuvan pada susunan asam amino protein virus, posisi relatif dan susunan peptida protein virus (pada Scrambled Antigen 'accine)

?:rt::bel terkendali: Piranti lunak untuk prediksi struktur sekunder serta piranti lunak untuk prediksi struktur :essier protein

::r.iabel dependen: f.ksposisi peptida ajuvan pada ·perm ukaan molekul protein virus, prediksi struktur sekunder peptida ajuvan, prediksi struktur tersier peptlda ajuvan

truksi dan ekspresi Vaksin DNA i::!Jel independen:

Su:sunan nukleotida H5, Nl, MA 1, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide CPP) Listeriolysin dan VP22

-;,:be/ terkendali: ·ektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli

E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, ::xtoda sekuensing, kondisi kultur sel mamalia, metoda transfeksi, metoda deteksi ckspresi antigen

_ ::3el dependen: Smtman nukleotida vaksin DNA, ekspresi antigen virus pada sel mamalia

Kr;:ms:tnitl!� i vektor dan ekspresi antigen rekombinan virus pada sistem ekspresi

_......,, . ..... Ota

Susunan nukleotida H5, Nl, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22

'c:riahe/ terkenda/i.·

Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli (E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, galur Escherichia coli (E. coli) untuk ekspresi protein rekom binan, kondisi kultur E. coli, metoda deteksi ekspresi antigen

't.iabel dependen:

Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada kultur sel SF9

� -mtruksi vektor dan ekspresi VLP pada sistem ekspresi bacu lovi rus

.::nabel independen:

Susunan nukleotida H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22

".::riabel terkenda/i.·

Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli

(E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, Jenis sel serangga (SF9) kondisi kultur set SF9, metoda transfeksi, metoda deteksi ekspresi antigen

'ariabel dependen: Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada ku.ltur sel SF9

.o..u.A.U.3. is respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CDS mencit diimunisasi Vaksin DNA t::riabel independen:

Vaksinasi dengan vaksin DNA mengandung gen H5, Nl, MA 1 dan NP, dengan dan ranpa fusi C3d, CD40L, CD28; cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22, \'ak.sinasi dengan antigen non fusi

"'cTiohel terkenda/i_· dosis vaksin, volume injeksi vaksin, species dan galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba (betina), usia hewan coba (6-8 minggu), tenggang \'aktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah dan splenosit)

::rtobel dependen: Titer antibodi hemaglutinin; titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; titer IL­� titer interferon gamma, jumlah sel T-CD4 produsen sitokin per I 06 splenosit pasca papa.ran dengan antigen dalam kondisi kultur sel; jum lah sel T-CD8 produsen sitokin per Cl° splenosit pasca paparan dengan sel pengekspresi

I 2

.,.........._.. ..... · respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CD8 mencit diimunisasi Vaksin VLP dan

:;::xm·:u. reko m bin an

..::J!"J::l:i:ll�· independen: Dosi.s vaksinasi dengan antigen VLP baculovirus (H5Nl, HlNl, H9N2); vaksinasi oc::.gan antigen rekombinan prokariota H5, Hl , H9, Nl dan Nl dengan dan tanpa fusi

dengan C3d, CD40L, CD28, Listeriolysin dan VP22; komposisi vaksin "priming" dan

""'booster''; dosis imunisasi priming vaksin DNA (pada uji coba analisis respon imun

protektif vaksin DNA) ':riabel terkendali:

dosis vaksin antigen rekombinan prokariota, volume injeksi vaksin, usia hewan coba (6-8

minggu), galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba

1>etina), tenggang waktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah

clan splenosit); tenggang waktu antara "priming" vaksin DNA dan pencabaran dengan irus influenza A

=-:abel dependen : Titer antibodi hemaglutinin; titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; jumlah

sel T-CD4 produsen sitokin per l 06 splenosit pasca paparan dengan antigen dalam

ondisi kultur sel; jumlah sel T-CD8 produsen sitokin per 106 splenosit; respon protektif

terhadap variabel independen dosis vaksin DNA pada imunisasi "priming") dan waktu

timbulnya respon protektif

a.;tilD 3

;tiohel independen: Komposisi vaksin dengan respon imun seluler dan hu.moral terbaik berdasarkan hasil

penelitian tahun 1 dan 2, dosis vaksinasi "priming" dan "booster"; jenis antigen (HA,

�A, MAI atau NP) i::nabel terkendali:

dosis vaksin, volume injeksi vaksin, usia hewan coba (6-8 minggu), galur hewan coba

(mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba (betina), tenggang waktu

antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah .dan splenosit), tenggang

waktu antara "priming" komposisi vaksin terbaik dan pencabaran dengan virus influenza

A �el dependen:

Efek kuratif; waktu timbulnya respon protektif; Efek proteksi silang; titer antibodi

hemaglutinin;titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; jumlah sel T-CD4

produsen sitokin per 106 splenosit pasca paparan dengan antigen dalam kondisi kultur

sel; jumlah sel T-CD8 produsen sitokin per 10° splenosit; perubahan berat badan,

perubahan konsumsi makanan, hitung sel darah tepi, rasio albumin/globulin, berat organ,

abnormalitas histopatologi (otak, ginjal, hati, lokasi vaksinasi)

Ba ban dao cara Kcrja

l:

lhrartuan susunan asam amino konsensus HA, NA, Ml, NP

�..:::;:::::;:m asam amino protein virus influenza A yang akan dianalisis untuk perancangan

asam amino antigen vaksin diunduh dari situs "influenza A resources" NCBI,

?:t:JiIDk. Karena susunan asam amino hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA), matriks

dan nukleoprotein (NP) HINJ telah diperoJeh dari penelitian sebelumnya, maka

..-...-..... asam amino yang akan dianalisis untuk perancangan vaksin adalah susunan asam

:\... _ A, Ml dan NP virus influenza A subtipe H5Nl. Analisis sekuen konsensus masing­

g susunan asam amino dilakukan menggunakan perangkat lunak Bioedit 7.0. dengan

;:Olli dahulu melakukan penyejajaran sekuen (alignment). Sekuen konsensus yang

_...,_,.,,.an akan dianaJisis posisinya terhadap susunan asam amino berbagai virus yang

an dengan menggunakan perangkat lunak MEGA 4.1. Posisi sekuen konsensus

Z3J>kan berada tepat di pertengahan pada kJadogram yang diperoleh.

�gan susunan asam amino protein HA, NA, Ml, NP mengandung peptida ajuvan

CD28, CD40L, CPP Listeriolisin, CPP VP22

�:i::l:!lll asam amino peptida ajuvan C3d, CD28, CD40L, CPP Listeriolisin dan CPP VP22

.:.:S!SUa.iikan dengan susunan asam amino yang berdasarkan publikasi dapat melakukan fungsi

=::::&SJ. dengan ligannya (C3d, CD28, CD40L). atau fungsi "cell penetrating peptide"

�--·�lisin dan VP22) dan diposisikan sedemikian rupa terhadap susunan asam amino

---.... virus (HA, NA, Ml dan NP) agar susunan asam amino peptida ajuvan dapat

Pemilihan posisi peletakan peptida ajuvan dilakukan berdasarkan hasil analisis

--=:�si- struktur sekunder menggunakan piranti lunak online pada situs "predictprotein.org"

.......... -=---- memilih posisi peletakan yang menghasilkan struktur s�kunder peptida ajuvan yang

· dengan struktur aslinya. Se\ain itu pemilihan posisi peletakan juga dilakukan

� prediksi struktur tersier menggunakan piranti lunak online EsyPred3D dan

ii:..=Jisasi dengan piranti lunak RasMol 2.7.5 dengan memilih posisi peletakan yang

-�·2<:"1·lkan struktur tersier protein virus dengan peptida ajuvan terekspos di pennukaan

=:::�:!I protein fusi. Perancangan posisi peletakan susunan asam amino peptida ajuvan juga

�tb:::!tan dengan mempertahankan susunan peptida yang telah diketahui atau diperkirakan

�r:=!::icc;tuk epitop netralisasi (dikenali oleh antibodi) maupun epitop yang dapat berinteraksi

lHC kelas I atau MHC kelas II (prediksi interaksi dilakukan dengan menggunakan

- hmak pada situs online.

__,_ ....... �- DNA penyandi susunan asam amino konsensus HA, NA, Ml, NP, C3d, CD28,

__.__.,,,=-.... CPP Listeriolisin, CPP VP22

en-fragmen DNA gen-gen penyandi protein HA, NA, M l dan NP akan dipesan pada

:ir:::.sahaan yang mampu melakukan sintesis fragmen DNA berdasarkan infonnasi susunan

tida yang telah dioptimasi untuk ckspresi pada sistem ekspresi mamalia dan

�chia coli. Gen ajuvan CD40L, C3d dan CD28 diperoleh dengan memesan pada

�aan penyedia jasa sintesis nukleotida atau dengan cara amplifikasi materi genetik

:::gan PCR. Penyisipan gen ditengah open reading frame gen penyandi protein virus

.:.......*ukan dengan teknik Overlap &tention PCR.

J-erlap extention PCR

.=t.esis DNA dengan teknik Overlap extention PCR dilakukan dengan terlebih dahulu

�dakukan sintesis DNA serat ganda yang akan berfungsi scbagai DNA pola cetak dalam

--upanjangan serat ganda tersebut. Mula-mula digunakan sepasang oligonukleotida dengan

.:gian 3' yang saling komplementer satu terhadap yang lain. Pada polimerasa berantai,

111.Zdua oligonukleotida tersebut akan membentuk DNA serat ganda yang selanjutnya akan

gunakan sebagai DNA pola cetak dalam reaksi polimerasa berantai berikutnya dimana

"danjutnya akan digunakan pasangan oligonukJeotida dengan bagian 3' yang berlekatan

....mgan daerah target pada ujung 3' DNA serat ganda yang komplementer dengan

·gonukleotida mengandung tambahan susunan nukleotida pada ujung 5' yang berfungsi

ruk perpanjang DNA serat ganda. Langkah ini diulang dengan pasangan-pasangan

�onukleotida berikutnya sehingga diperoleh DNA serat ganda lengkap mengandung gen

�gan susunan sesuai dengan susunan nukleotida penyandi sekuen asam amino konsensus.

?engklonaan ke dalam plasmid ekspresi sistem mamatia

:>�A serat ganda yang diperoJeh secara sintetik diklona ke dalam vektor pengekspresi sistem

mamalia di bawah kendali promoter CMV atau SV40. Akan dilakukan pengklonaan ke

.:ialam vektor ekspresi mamalia yang tersedia secara komersial, melalui proses ligasi, ligasi

...an skrining E.coli transforman dengan analisis rcstriksi enzimatik .

• 'onfirmasi DNA pengekspresi protein virus dengan sekuensing

·nruk memastikan kebenaran susunan nukleotida DNA pengekspresi protein virus yang

.erklona dalam plasmid ekspresi sistem mamalia, dilakukan analisis sekuensing

:nenggunakan reagensi dye terminator dan analisis sekuen dengan piranti lunak sescape.

Transfeksi ke dalam sel mamalia

Sebelum sistem penembak DNA diperoleh, prototipe vaksin DNA akan diekspresikan

!erlebih dahulu dalam sel fibroblas mamalia (galur sel Hela, MDCK atau 293) menggunakan

lipofeksi. Bila alat penembak sudah dikonstruksi, akan dilakukan transfeksi

�nakan alat penembak yang dirancang melalui penelitian ini.

� ekspresi protein

::5.sis ekspresi protein pada sel transfektan akan dilakukan dengan menggunakan metoda

tluoresens, western blot dan mikroskopi elektron.

:::::::nisasi mencit BABVc

..mcit BALB/c (Mus musculus strain BALB/c atau ddY) berusia 6 sampai 8 m inggu

;:makan sebagai hewan coba untuk menilai respon imun humoral dan selular terhadap

:.;;erapa formulasi vaksin DNA yang diprediksi membentuk struktur vaksin subunit dan

� like particle (VLP) bila diekspresikan dalam sel mamalia. Sejumlah 100 ug DNA

�in DNA) diinjeksikan secara intramuskuler ke dalam paha kanan mencit. Untuk

ghindari rasa tidak nyaman yang mungkin ditimbulkan pada injeksi vaksin hewan coba

cmebih dahulu dianestesi. Pemeliharaan binatang dilakukan dalam fasilitas kamar binatang

c..mgan suhu udara dan kelembapan diatur oleh penyejuk .ruangan selama 24 jam �isertai -

.&em aliran udara untuk pengeluaran ke luar kamar hewan dan pemasokan udara segar ke

..:.:dam kamar hewan. Jumlah binatang percobaan yang akan digunakan dihitung

CQCOggunakan rumus Federer (t-1 ) (n-1) � 1 5 untuk mendapatkan tingkat kepercayaan yang

pada analisis statistik. Serum mencit dikumpulkan sebelum imunisasi, 3 hari setelah

unisasi pertama (priming), 1 minggu setelah imunisasi dan setiap minggu selama 8

::inggu. Pada minggu ke dua dan minggu ke tiga pasca priming dilakukan injeksi vaksin

� sejumlah 100 ug pada setiap kali pemberian sebagai booster, dimana sampel darah

Lrrlebih dahulu diambil sebelum injeksi booster dilakukan. Untuk analisis respon imun

.:dular diperlukan pengambilan organ limpa mencit, sehingga setiap kali pengam bilan sampel

..:;ewan coba akan dikorbankan dengan terlebih dahulu dimatikan dengan teknik dis1okasi

servikal.

?engukuran respon antibodi

: espon antibodi dinilai dengan menggunakan uji EUSA, dengan mengamati nilai absorbans

_:-ang diperoleh pada setiap serum. Setiap serum diuji secara duplo untuk mendapatkan ni1ai

-era.ta absorbans.

?engukuran respon imun selular

an respon imun selular dilakukan dengan menggunakan uji ELJSPOT sel T-CD4

sel T-CD8, menggunakan susunan peptida yang diprediksi secara in silico dapat

:::::::::::aaksi dengan MHC-I dan MHC-Il mencit BALB/c atau ddY. Respon imun selular

stimulasi ekspresi sitokin oleh sel T diukur dengan menghitung jumlah bintik yang

ruk menggunakan ELISPOT reader.

· Analisis Data

l:

=sis sekuen nukleotida:

-----'"�-� sekuen nukleotida dilakukan dengan menggunakan piranti lunak Bioedit dan

� untuk melihat tingkat homologi sekuen nukleotida in silico dengan susunan

.__.�,u-da yang diperoleh melalui proses sekuensing terhadap gen virus influenza A H5Nl

_ terklona pada plasmid sistem ekspresi mamalia. Tingkat kesamaan homologi harus

dengan semua komponen sistem ekspresi maupun kodon penyandi asam amino sesuai

� ekspresi protein dalam bentuk yang sesuai bentuk asli.

::US ekspresi protein: ·

· protein dinilai berdasarkan adanya fluoresensi sel ditransfeksi pada uji

!luoresens dengan analisis mikroskopi konfokal serta adanya pita reaktif spesifik pada

iieStem blot dan peningkatan sinyal di atas nilai ambang pada uji ELISA.

--�- respon antibodi pada hewan coba

I .'maan perbedaan respon antibo�i antar kelompok hewan coba dilakukan dengan

__.....,.........,u.i uji statistik pada nilai rerata absorbans yang diperoleh pada uji ELISA serum

coba, dengan membandingkan pengaruh variabel independen terhadap variabel

=-?t:C:Oilell menggunakan piranti lunak SPSS.

__..._ ... - respon sel T pada hewan coba

�::z!t!l32LD perbedaan respon sel T CD4 dan CD8 antar kelompok hewan coba dilakukan

_..,........._ melak.'llkan uji statistik pada nilai rerata "hitung titik" (spot counts) yang diperoleh

,,1 ELISPOT PBMC hewan coba, dengan membandingkan pengaruh variabel

�t:;;ll:mlien terhadap variabel dependen menggunakan piranti lunak SPSS.

?ERTIMBANGAN ETIK PENELITIAN

?errirnbangan etik penelitian untuk penggunaan hewan coba diajukan kepada Komite

2ik Litbangkes Kementerian Kesehatan clan Komite Etik Fakultas Kedokteran

l.mversitas Indonesia

HASTL PENELITIAN

Pembuatan sikuen konsensus dan DNA sintetik Hemaglutinin dan neuraminidase

virus HSNl

Konsensus gen Hemaglutinin dan Neuraminidase dibuat berdasarkan sikeun

asam amino yang diunduh dari genbank. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat

dari manusi� lokasi asal sample adalah seluruh dunia, dengan tahun pengumpulan

sampel 2005-2012. Setelah di lakukan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan

sikuen konsensus mengguankan fasilitas yang disediakan oleh genbank. Sekucn

ronsensus yang dihasilkan selanjutnya di sejajarkan dengan - asam amino isolat

A/Indonesia/5/2005 dan asam amino gen HA asal manusia yang· terklona dalam

pcDNA3. l (plasmid merupakan hasil peneitian konsorsium vaksin influenza), untuk

:::nengetahui adanya keragaman hemaglutinin antar isolat. Terdapat beberapa perbedaan

:'!.SaID amino antara hemaglutinin isolat Nlndonesia/5/2005, yang merupakan salah satu

mlat yang direkomendasikan WHO untuk seed vaccine, dengan protein hemaglutinin

konsensus antara lain T86A, S94N, L l lOH, Ll 38Q, S1 40R, P14JS, S l 55N, K1 62R,

COOV, M282I, S325R, I482V, N488D, M533V.

.- r -i:::::::c5..:..u: 8 5

:;=z: :SC 2005 �_::ecs_2012

=- T � :..u 1!5

-== "3/2005 __ 2005_2012

� :"1 �-ll.l: 115

=3/2005 _2005_2012

:ii-:. ,., ::::aa ll.I 85

..::..= :S/2005 ::::..sES -2005 -2 012

:-� u.: 85

-llC.:<�/2005 2005 2012

.:c:::m:::::c =' -s:::•aL:u.t 8 s

...:m::'S/2005 �-�005_2012

� :-, -:i::::&3-llI B 5

�:'5/2005 �_2005_2012

= 117

�.!A! BS -:x.e 312005

::=:::a_.2005_2012

Mulai penomoran asam amino HA (posisi nomor 1)

10 20 30 10 50 60 70 80 · · · · I · · · · I · · · · I · r. · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · . J . . . . I . . . . I

MEKIVLLLAIVSLVRSOQICIG�STEQVDTIWERNVTVTHAQDILERTIJNGKLCDLDGVKPLILRDCGVAGWLLGN . . . . . . , . , . . . . . • G . . • . . . . . . . . . • • . . . • • . . . • . . . . . . . . . • , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . , . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . s . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . s . . . . . . . .

90 JOO l.10 l.20 130 140 150 160 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · l · · · · I · · · · I · · · · I · , · · I · · · · I

l?NCDE?INVPEWSYIVEKANt'TNDLCYPGSl'NDYEELJIEI.LSRDILFEIUQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFF .T . . . . . . XX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . . . T . . . . . . Y . . . . . . XX . . . A . . . . . . , . . . .

. • . . • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • . • • • . • . • • • • • • • • • . • • H . • • • • • • • • • . . . • • . • • . • • • • • . • . . • . • • • •

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A • . . . . . . N • • • • • . . • . • • . . . . H • . . . • • • • • . • • • • • • • • • • • • . . . . . Q.RS . . .

170 180 130 200 no 220 230 240 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · l · · · · I · · · · I · · · - I · · · · I

RNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIBBPNDAAEQTRLYQNPTl'YISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSG • • • . • • T • . . • . • • I . • • N • • . . • . • • • • • • • • • • . • • • ll! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . , . . . . . . . .

. . . . . • . • • • N . . • • . • R • • • • • • • • . • • • . • • • • • • • . . • • . • . . • • • • • • • • • V . . • • . . • . • . • . • . . . . . • • • • . •

250 260 :no 2/JO 230 300 no 320 · · · · I . . · · I · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · I · · · · I · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · . . · I · · · · I

RUE?f'lllA.ILJtPNDAINl'ESNGNFIAPEYAJnUVIOtGilSAD(KSEI.EYGNCN'l'ltCQTPMGAINSSUP!'HNIHPLTIGECPK . I • • S . T • • • . • • • • • • • . • • • • • • • • • • • . . . • • • • , • . . • . . . • . • • . . • . • • • • • • • • • . • . . • • • . • . . • • • • • • .

• • • • . . T • • • • • • • • • . . . • • • • • • • . . • • . . • • • • • • • . . • . . • . . • • . • • • • • • • . . • . . • . . • • • • . , . • , • • • . . .

. . . . . . T . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . • • . . . • • . . . . . • . • • • . . . • . . . • • • . . I . . . . . • . . . • • . . . . . . . . . . .

330 340 350 360 370 380 390 400 · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l . . · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · · · · l · . . · l · · · · I · · · · I

YVKSNRLVLATGLRNSPQRES�GL?GAIAG?IEGGWQGNVDGi'lYGYBllSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS

• • . . • • • • • • • • • • • . . . . . R • • . • • • • . • . . • • • • • . • . . • . . . . . . • • • . • . • . . . . . . . . • . . • • • • . • . . • • . • . .

410 420.

�.30 440 460 460 470 480 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · .

-. · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · .·. · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

IIDIINNTQ?EAVGRE?NNLERRIE:NLNKRWEDG?'LDVW'l'YNAELLVLUENER'l'LDFHDSNVIOILY'C>KVRLQLRDNAK£LG

490 500 510 520 530 540 5SO 560 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

NGC?E?YHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEAP.LKREEISGVRLESIGTYQILSIYSTVASSLALADUAGLSLWMCSNG . • . . . . • • • • • .G. • • . . . . • • • . • • • . . . • • • • • • • . • . • . • . • • . . . . . • . . . . . . . . • • • • • • • . . . . • . . . • • • . .

. . . . . . . • . . . . . • . . . • • • • • • . • . • • · • . . . • . . . • • • · • · • · · · • • · . . • • • . . . • . . • . . . • . . N • . . • • • • . . · •

. . . . . . . . . . . . . . . . . v . . . . . c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v . . . . . . . . . . .

570 580 S!)O 600 610 620 630 640 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I ·

.· · · I · · · I

SLQCR.ICI•LEASQLGSPYSX--------------------�--------------------------------------

• . . . . . . . . RX---------------------------------------------------------------------­. . . . . . . . K

1 . Hasil pensejajaran asam amino hemaglutinin isolat Nlndonesia/5/2005, Human

07 (isolat asal manusia tahun 2007), pcDNA3.1 AI_H 5 mengandung insert

Hemaglutinin asal ayam, ConsH_2005_200 1 2 merupakan sikeun gen hemaglutinin

!soalt H5Nl dari tahun 2005 sampai dengan 2012 .

..-_.,.,��ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi gen

dengan menggunakan piranti lunak DNA2.0. Optimasi ditujukan untuk

� kegagalan transkripsi dan translasi akibat perbedaan /bias kodon antar spesies.

ini adalah has.ii optimasi DNA penyandi protein hemaglutinin konsensus. Sikeun

::mi.no Hemaglutinin dan sikuen DNA konsensus berpotensi diajukan paten.

�GATCGTGCTGCTGCTGGCCATCGTGTCCCTGGTGAAGTCCGACCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACTC

.?.i!X:GAGCAGGTGGACACCATCATGG.AAAAGAACGTGACCGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAGACCCACAACGGCA

;-:'GTGCGACCTGGACGGCGTGAAGCCCCTGATCCTGAGGGACTGCTCCGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGCAACCCCATGTGC

�TTCATCAACGTGCCCGAGTGGAGCTACATCGTGGAGAAGGCCAACCCCGCCAACGACCTGTGCTACCCCGGCAACTT

::LCGACTACGAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCAGGATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGAGCAGCTGGA

CACGAGGCCAGCAGCGGCGTGAGCAGCGCCTGCCCCTACCAGGGCAGGAGCAGCTTCTTCAGGAACGTGGTGTGGCTG

��AAGAACAACACCTACCCCACCATCAAGAGGAGCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGGTGCTGTGGGGCAT

�CCCCAACGACGCCGCCGAGCAGACCAGGCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCAGCGTGGGCACCAGCACCCTGA

�GGCTGGTGCCCAAGATCGCCACCAGGAGCAAGGTGAACGGCCAGAGCGGCAGGATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTG

AACGACGCCATCAACTTCGAGAGCAACGGCAACTTCATCGCCCCCGAGTACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGA

-.:GCCATCATGAAGAGCGAGCTGGAGTACGGCAACTGCAACACCAAGTGCCAGACCCCCATCGGCGCCATCAACAGCAGCA

:a:TTCCACAACATCCACCCCCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCAACAGGCTGGTGCTGGCCACCGGC

�CAGCCCCCAGAGGGAGAGGAGGAGGAAGAAGAGGGGCCTGTTCGGCGCCATCGCCGGCTTCATCGAGGGCGGCTG

�ATGGTGGACGGCTGGTACGGCTACCACCACAGCAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACAAGGAGAGCACCC

!f:GGCCATCGACGGCGTGACCAACAAGGTGAACAGCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCAGGGAG

�CCTGGAGAGGAGGATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGCTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCCGA

::::r:s:::tGGTGCTGATGGAGAACGAGAGGACCCTGGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTGAGGCTGC

Gi'.GGGAC�-ACGCCAAGGAGCTGGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAGAGCGTG

�ACCTACGACTACCCCCAGTACAGCGAGGAGGCCAGGCTGAAGAGGGAGGAGATCAGCGGCGTGAAGCTGGAGAG

::::r;t:CACCTACCAGATCCTGAGCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCCTGGCCCTGGCCATCATGGTGGCCGGCCTGAGCC

TGTGCAGCAACGGCAGCCTGCAGTGCAGGATCTGCATCAAG

Konsensus asam amino Neuraminidase virus H5Nl dibuat berdasarkan sikuen asam

:> yang diunduh dari genbank dan pembuatan sikuen asam amino konsensus dilakukan

menggunakan piranti lunak dari Genbank. Berikut ini adalah hasil pensejajaran asam

Neuraminidase konsensus dengan asam amino neuraminidase H5Nl

esia/5/2005. Terdapat perbedaan beberapa asam amino antara konsensus dengan

esia/5/2005, pada posisi I35S, S48P, P54F, H80Y, N85S, E l 8 1G,D202N,M317V dan

-;-c.::r:;imbaban asam amino pada posisi 437 sampai dengan 450 yaitu WPDGAELPFTIDKY.

amino 437 sampai dengan 450 belum ada pada isolat A/indonesia/5/2005 kemungkinan

sikeunsing yang dilakukan saat itu belurn sampai ke asam amino N terminal.

".:ndo/5/2005 � B5N12005 2012

Indo/5/2005 ....=�Sl B5N12005 2012 - -

-:../Indo/5/2005 =sS'l E5N12005 2012 - -

Ulndo/5/2005 .,.=s'll B5N12005 2012

';./Indo/5/2005 -

-s� B5N12005 2012

Indo/5/2005 . � B5N12005 2012 - -

Indo/5/2005 --=s'fl B5N12005 2012

;./Indo/5/2005 � B5N12005 2012 - -

;./Indo/5/2005 � B5N12005 2012

10 20 30 4 0 50 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVIBSIQTGNQBQAESIS . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . . . . . . . P . .

60 70 80 90 100 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

NTNPLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSRDNNIRlGSKGDVFVIREP • • • F • • • • • • • . • • • • . • . • • . • • • . . • • Y . . . . S • • . . • • • . . • • • . . .

110 120 130 140 150 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I FISCSBLECRTFFLTQGALLND:KBSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPY

160 170 180 190 200 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

NSRFEsVAWSASACBDGTSWLTIGISGPDNEAVAVLKYNGIITDTIKSWR . . • . . • . . • . • . • • • • • . . • . . . • • . . . • • G • . . • . . • . . . . . . . . . . . •

210 220 230 240 250 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

NDILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFKME.KGKVVKSVELD .N . . . . . . . . . . . • . • . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

260 270 280 290 300 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · .

-. I

APNYBYEECSCYPDAGEITCVCRDNWBGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSG

310 320 330 340 350 · · · · I · . · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

VFGDNPRPNDGTGSCGPMSPNGAYGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSG . . . . . . . . . . . . . . . . . v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

360 370 380 390 400 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I . . . . I

FEMIWOPNGWTGTOSSFSVKQDIVAITOWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRP • • • • • • • ' • 9 • • • • • • • I . 0 I I 9 . • ' 0 0 o . • 0 ' ' o o • o o o o o • o 0 o o 0 0 o

410 420 430 440 450 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I C.FWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVSWS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . WPDGAELPFTIDKY

� 2. Hasil pensejajaran asam amino neuraminidase isolat A/Tndonesia/5/2005 dengan

amino Neuraminidase konsnsus yang dibuat berdasarkan isolat manusia tahun 2005

:=pai dengan 2012. Terdapat perbedaan beberapa asam amino antara konsensus dengan

=-:donesia/5/2005, pada posisi 1358, S48P, P54F, H80Y, N85S, E 18 1G,D202N,M3l7V dan

bahan asam amino pada posisi 437 sampai dengan 450 yaitu WPDGAELPFTIDKY.

amino 437 sampai dengan 450 belum ada pada isolat A/indonesia/5/2005 kemungkinan

sikeunsing yang dilakukan saat itu belum sampai ke asam amino N terminal.

�ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi gen

_._ .. Iran dengan menggunakan piranti lunak DNA2.0. Optimasi ditujukan untuk

.:::ghlndari kegagalan transk.ripsi dan translasi akibat perbedaan /bias kodon antar

�rutama sistem ekspresi marnalia, prokariota dan Baculovirus. Berikut ini adalah

optimasi DNA penyandi protein konsensus Neuraminidase. Sikeun Asam amino

�inidase dan sikuen DNA konsensus berpotensi diajukan paten.

::o::isensus HSNl - -

�CCA.�CCAGAAGATCATCACCATCGGCAGCATCTGCATGGTGATCGGCATCGTGAGCCTGATGCTGCAGATCGGCAA

�GCATCTGGGTGAGCCACAGCATCCAGACCGGCAACCAGCACCAGGCCGAGCCCATCAGCAACACCA.�CTTCCTGA

�-?lGGCCGTGGCCAGCGTGACCCTGGCCGGCAACAGCAGCCTGTGCCCCATCAGGGGCTGGGCCGTGTACAGCAAGGAC

�TCAGGATCGGCAGCAAGGGCGACGTGTTCGTGATCAGGGAGCCCTTCATCAGCTGCAGCCACCTGGAGTGCAGGAC

_CC:GACCCAGGGCGCCCTGCTGAACGACAAGCACAGCAACGGCACCGTGAAGGACAGGAGCCCCCACAGGACCCTGA

�CCGTGGGCGAGGCCCCCAGCCCCTACAACAGCAGGTTCGAGAGCGTGGCCTGGAGCGCCAGCGCCTGCCACGAC

�.GCTGGCTGACCATCGGCATCAGCGGCCCCGACAACGGCGCCGTGGCTGTGCTGAAATACAACGGCATCATCACCGA

�AGAGCTGGAGGAACAACATCCTGAGGACCCAGGAGAGCGAGTGCGCTTGCGTGAACGGCAGCTGCTTCACCGTGA

�.cGGCCCCAGCAACGGCCAGGCCAGCTACAAGATCTTCAAGATGGAGAAGGGCAAGGTGGTGAAGAGCGTGGAGCTG

,:;;xccCAACTACCACTACGAGGAGTGCAGCTGCTACCCCGACGCCGGCGAGATCACCTGCGTGTGCAGGGACAACTGGCA

�.ACAGGCCCTGGGTGAGCTTCAACCAGAACCTGGAGT]\.CCAGATCGGCTACATCTGCAGC.GGCGTGTTCGGCGACA

;;:;GCCCAACGACGGCACCGGCAGCTGCGGCCCCGTGAGCCCCAACGGCGCCTACGGCGTGAAGGGCTTCAGCTTCA.�G

-,_;cGGCGTGTGGATCGGCAGGACCAAGTCCACCAACTCCAGGAGCGGCTTCGAGATGATCTGGGACCCCAACGGCTG

� &4;.cCGACAGCAGCTTCAGCGTGAAGCAGGACATCGTGGCCATCACCGACTGGAGCGGCTACAGCGGCAGCTTCGTGC

:::=:r:ccx;AGCTGACCGGCCTGGACTGCATCAGGCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCAGGGGCAGGCCCAAGGAGAGCACC

�AGCGGCAGCAGCATCAGCTTCTGCGGCGTGAACAGCGACACCGTGAGCTGGAGCTGGCCCGACGGCGCCGAGCT

�....CCATCGACAAGTA

...:.. .Panboatan sikuen konsensus dan DNA sintetik Hemaglutinin dan neuraminidasc

HU 1 pdm

Konsensus gen Hemaglutinin dan Neuraminidase dibuat berdasarkan sikeun asam

::;a:ng diunduh dari genbank. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat dari manusia,

- asa1 sample adalah seluruh dunia, dengan tahun pengumpulan sampel 20 1 1 -2012.

di lakukan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan sikuen konsensus

:::::::;;=;?=!aK':an fasilitas yang disediakan oleh genbank. Sekuen konsensus yang dihasilkan

�� ....... di sejajarkan dengan asam amino konsensus protein hcmaglutinin yang dibuat

:=:::::S�� isolat tahun 2009 yang kami peroleh dari penelitian didanai oleh kemenristek

20 l 0. HAsil pensejajaran menunjukkan perubahan asam amino yang pada posisi

nsensus asam amino H l 2010-2012 tidak memiliki asam amino pada posisi

559Y /G, 562L. Perubahan ini terutama terjadi pada bagian cytoplasmic tail.

::::...i:. .lUNlpan 2010 2012 �-2009 Asian isolated

:2009:11.nycountry

lllNlpan 2010 2012 -2009 �Ian isolate�

�:2009:anycountry

� 31.Nlpan 2010 2012 --2009 .uian isolated -:2009:anycountry

. Z:. aim.pan 2010 2012 -2009 Asian isolated

.......... :2009:1U1ycountry

El.Rlpan 2010 2012 -2009 >...Ian isolated

:200s:anycountry

iE!Hlpan 2010 2012 -=:!09 .uian isolated

:�s_:::anycountry

::::.sipan 2010 2012 -:i.'liOS .>Jia.n isolated

:2ll07.::::a.nycountry

lO 20 30 40 50 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · . . - 1

MKAJ:LVl/LLYTFA'l'ANADTLCIG'lliANNSTOTVDTVLEKNVTVTHSVMLL

ISO 70 80 90 100 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · . - - I

EDKHNGKLCRI.RGVAPLRLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETS

110 120 130 140 150 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · ! · · · · I · · - - I

SSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPK'l'SSWPNRDSNXGVT

160 l 70 180 190 200 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · I · · · · I · · · · I · · . . 1 . . . . 1 . . . - I

AACPHAG.ARSF'll<NLIWLVKKGNSYPK!.SKSYINDKGKEVLVI.WGIBBPS

210 220 230 240 250 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · - I · · · · I · · . . 1

TSADQQSLYQNADAYVFVGTSl\YSKKFKPEIAIJU>KVRDQEGRMNYYWTL

2&0 270 280 290 300 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

VEPGDKITFE.ATGNLVVPRYAFAMEIUIAGSGIIlSDTPVEDCNTTCQTPK

.'10 320 330 340 350 • · ; . J . · · · I · · · · I · : . · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · .-1 . · · · I · . . · I

GAINTSLP5'0NIHPITIGRCPRYVRSTKLIU.A.TGLRNVPSIQSRGI.FGAI

.!ISO 370 380 390 400 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

AGFlEGGWTGMVDGWYGYEBQN'.tQGSGYAADLKSTQNAIDKlTNKVNSVl'.

. • • . . . • . . • • • . . . . . . . . • • . • . . . . . . • • . . . • . . . . E • . . • • . . • .

. • • . . . . . . • . • . . • . . . . • • • . • . . . . . . • • . • • • . . • • E • . . • • . • . .

410 420 130 440 450 . . . . 1 . . . . 1 . . . . 1 . . · · I · . . . 1 . . . . 1 . . . . 1 . · . . 1 . . . . 1 . . . . 1

E.KMNTQFTAVGKEFNBLElCRIENLNXKVDDGFLOIWTYNAELLVLI.ENER

flSO '70 180 f90 500 I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

TI.DYBDSNVKNLYEKVRSQLXNNAKEIGNGCFEFYRKCDN'ICMESVKNGT

510 520 530 540 550 · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · ; . . . · I · · · · I

YDYPKYSE.EAKI.NREEIDGVKLl:STRIYQILAIYSTVASSLVl.VVSLGAI

560 570 , . . . . , . . . . , . . . . ,

Snll-ICS--NGS-LQCRICI . • . . . . NY- . . L . . . . • . . I . • . . . . GG • . . L . . • . . • .

3.. Hasil pensejajaran asam amino konsensus Hl konsensus tahun 2010-201 2 dan

--- tahun 2009 asal isolat Asia dan negara-negara lain. Perubahan asam amino

� posisi K392E, konsensus asam amino Hl 2010-20 1 2 tidak memiliki asam

_posisi 558N/G, 559Y/G, 562L.

----.. ,�ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi

dengan menggunakan piranti lunak DNA2.0. Optimasi ditujukan untuk

��==:z=- tegagalan transkripsi dan translasi akibat perbedaan /bias kodon antar spesies.

= c5optimasi dalarn penelitian ini ditujukan untuk meminimalkan bias kodon pada

"-··--- �Ota dan baculovirus. Berikut ini adalah hasil optimasi DNA penyandi protein

""-----·�-- konsensus. Sikeun Asam amino Hemaglutinin dan sikuen DNA konsensus

filajukan paten.

�_,,._.......,.::'CCTGGTGGTGCTGCTGTACACCTTCGCCACCGCCP..ACGCCGACACCCTGTGCATCGGCTACCACGCCA_TJ.,.CAJ>.

�--����..r:cGTGGACACCGTGCTGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAACG

__;:.::::���.,AGCTGAGGGGCGTGGCCCCCCTGCACCTGGGCAAGTGCAACATCGCCGGCTGGATCCTGGGCAACCCCGAG

�CCGCCAGCAGCTGGAGCTACATCGTGGAGACCAGCAGCAGCGACAACGGCACCTGCTACCCCGGCGA

c:7\CGAGGAGCTGAGGGAGCAGCTGAGCAGCGTGAGCAGCTTCGAGAGGTTCGAGATCTTCCCCAAGACCAGCA

���CGACAGCAACAAGGGCGTGACCGCCGCCTGCCCCCACGCCGGCGCCAAGAGCTTCTACAAGAACCTGATC

" ':bf-�_TJ.,.GGGCAACAGCTACCCCAAGCTGAGCAAGAGCTACAT�CGACAAGGGCAAGGAGGTGCTGGTGCTGTG

�CCCCAGCAGCAGCGCCGACCAGCAGAGCCTGTACCAGAACGCCGACGCCTACGTGTTCGTGGGCACCAGCA

�.GTTCAAGCCCGAGATCGCCATCAGGCCCAAGGTGAGGGACCAGGAGGGCAGGATGAACTACTACTGGACC

�GGCGACAAGATCACCTTCGAGGCCACCGGCAACCTGGTGGTGCCCAGGTACGCCTTCGCCATGGAGAGGAA

�-'6CGGCATCATCATCAGCGACACCCCCGTGCACGACTGCAACACCACCTGCCAGACCCCCAAGGGCGCCATCAACA

�CCAGAACATCCACCCCATCACCATCGGCAAGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCACCAAGCTGAGGCTGGCC

_:;z;:;;c_lil"-GG.n.ACGTGCCCAGCATCCAGAGCAGGGGCCTGTTCGGCGCCATCGCCGGCTTCATCGAGGGCGGCTGGACCGG

�GGTACGGCTACCACCACCAGAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACCTGAAGAGCACCCAGAACG

�GATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTCACCGCCGTGGGCAAGGAGTTCAAC

�GGATCGAGAACCTGAACAAGAl\GGTGGACGACGGCTTCGTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAGCTGCT

--..-...-......... �_GGAGAACGAGAGGACCCTGGACTACCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGGAGCCAGCTGA

-�CAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTG�.AGAAC

r.;LG.�CTACCCCAAGTACTCCGAGGAGGCCAAGCTGA.TJ.,.CAGGGAGGAGATCGACGGCGTGAAGCTGGAGAGCACCAG

�TCCTGGCCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCCTGGTGCTGGTGGTGAGCCTGGGCGCCATCAGCTTCTGGA

�CGGCAGCCTGCAGTGCAGGATCTGCAT

konsensus Neuraminidase HIN I pdm dibuat seperti dijelaskan untuk pem buatan

konsensus Hemaglutinin H I N ! pdm. Asam amino konsensus yang dihasilkan

-'-"""'-uUJya di sejajarkan dengan asam amino konsensus protein Neuraminidase yang dibuat

t:::::nsarkan isolat tahun 2009 yang kami peroleh dari penelitian yang didanai oleh

�ek periode tahun 2009-2010. Hasil pensejajaran menunjukkan tidak ada perubahan

amino, namun di lakukan perubahan pada susunan asam nukleat penyandi kodon. dalam

litian ini asam nukleat penyandi kodon dioptimasi supaya daat diekspresikan dalam

mamalia, prokariota dan baculovirus.

10 20 30 40 50 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · . J . · · . J . · · · I · · . - I · . . · I . . . · l

..::=s SA BlNl 2009 MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISBSIQLGNQNQIETCN :.=A_B1Nlpan_2010_2012 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.-::.s: NA BlNl 2009 �_B1Nlpan_2010_2012

� N1\ BlNl 2009 • -�5il._H1Nlpan_2010_2012

i::�. NA BlNl 2009 ....._s'i:i!._BlNlpan_2010_2012

� NA BlNl 2009 -�s'R�B1Nlpan_2010_2012

:r,:a,s Nl\ BlNl 2009 =::a.siA_BlNlpan_2010_2012

E:=s � HlNi 2-009 �_B1Nlpan_2010_2012

� NA HlNl 2009 �_H1Nlpan_2010_2012

=m.s NA BlNl 2009 �_B1Nlpan_2010_2012

;�s NJ< HlNl 2009

�'U!._BlNlpan_2010_2012

" � � " 1� · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · . · I · . . . I · . . · I

QSVIT�QTYVNISNTNFAAGQSVVSVlCLAGNSSLCPVSGWAIY

llO 120 130 l40 150 · · · · I · · · · I · · · · J . · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I - . . · I · . . · I SRDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDICHSNGT!K

160 l 70 180 190 200 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · J . · · · I · · · · l · · . . J

DRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDG!NWLTIGISGPDN

210 220 230 240 250 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · - 1 - · · · I · . . · I · . . - I

GAVAVLKYNGIITDT!KSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVl-lTDGPSDGQ

260 270 280 290 300 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · - 1 - · · · I · · . · I

ASYK!FRIEKGK!VKSVENNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWBGSN

310 320 . 330 340 350 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · l · · · · I · · · - 1 · · · · I · · · · J . · · · I · · · ·· I

.RPWVSFNQNLEY�IGYI.CSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFS

360 370 380 390 400 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I - · · · I · · · · I · · · · I

FKYGNGVWIGRTKS!SSRNGFElilWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWS

410 420 430 440 450 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · J . · · . J . · . - I

GYSGSFVQHPELTGLDCJ:RPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNS

460 470 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

DTVGWSWPDGAELPFTIDK-

....::mbar 4. Hasil pensejajaran asam amino konsensus neuroaminidase tahun 2009 dengan

amino konsensus tahun 2010-2012, tidak ditemukan adanya perbedaan asam amino.

� penyandi asam amino konsensus neuraminidase tahun 2010-2012 dibuat dengan

ggunakan program DNA2.0. Sikuen asam amino konsensus neuraminidase dan DNA

yandi asam amino neuraminidase konsensus berpotensi untuk paten. Berikut ini sikuen

neuraminidase konsensus.

_:.2ConsOPT

CAACCAGAAGATCATC..�CCATCGGCAGCGTGTGCATGACCATCGGCATGGCCAACCTGATCCTGCAGATCGGCA.�

�CATCTGGATCAGCCACAGCATCCAGCTGGGCAACCAGAACCAGATCGAGACCTGCAACCAGAGCGTGATCACCT

�CACCTGGGTGAACCAGACCTACGTGAACATCAGCAACACCAACTTCGCCGCCGGCCAGAGCGTGGTGAGCGTG

::::GGCCGGCAACAGCAGCCTGTGCCCCGTGAGCGGCTGGGCCATCTACAGCAAGGACAACAGCATCAGGATCGGCAGCAA

......;::�::GTGTTCGTGATCAGGGAGCCCTTCATCAGCTGCAGCCCCCTGGAGTGCAGGACCTTCTTCCTGACCCAGGGCGCCC

....,..._�CGACAAGCACAGCAACGGCACCATCAAGGACAGGAGCCCCTACAGGACCCTGATGAGCTGCCCCATCGGCGAGGTG

CTACAACAGCAGGTTCGAGTCCGTGGCCTGGAGCGCCAGCGCCTGCCACGACGGCATCAACTGGCTGACCATCGG

:;ry;;;cr,c;ccccGACAACGGCGCCGTGGCCGTGCTGAAGTACAACGGCATCATCACCGACACCATCAAGAGCTGGAGGAACA

.:::!XTGAGGACCCAGGAGAGCGAGTGCGCCTGCGTGAACGGCAGCTGCTTCACCG'I'GATGACCGACGGCCCCAGCGACGGC

�TACAAGATCTTCAGGATCGAGAAGGGCAAGATCGTGAAGAGCGTGGAGATGAACGCCCCCAACTACCACTACGA

�CTGCTACCCCGACAGCAGCGAGATCACCTGCGTGTGCAGGGACAACTGGCACGGCAGCAACAGGCCCTGGGTGA

CAGAACCTGGAGTACCAGATCGGCTACA'I'CTGCAGCGGCATC'I'TCGGCGACAACCCCAGGCCCAACGACAAGACC

�GGCCCCGTGAGCAGCAACGGCGCCAACGGCGTGAAGGGCTTCAGCTTCAAGTACGGCAACGGCGTGTGGATCGG

�GAGCATCAGCAGCAGGAACGGCTTCGAGATGATCTGGGACCCCAACGGCTGGACCGGCACCGACAACA.�CTTCA

�-:.GCAGGACATCGTGGGCATCAACGAGTGGAGCGGCTACAGCGGCAGCTTCGTGCAGCACCCCGAGCTGACCGGCCTG

"'1'CAGGCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCAGGGGCAGGCCCAAGGAGAACACCATCTGGACCAGCGGCAGCAGCAT

�-----GCGGCGTGAACAGCGACACCGTGGGCTGGAGCTGGCCCGACGGCGCCGAGCTGCCCTTCACCATCGACAAG

:..!.. Pembuatan sikuen konsensus dan siotetik Nucleoprotein

"---....,us gen Nucleoprotein dibuat berdasarkan sikeun asam amino yang diunduh dari

:::i::::::ank·. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat dari manusia, lokasi asal sample adalah

c-·-· dunia, dengan tahun pengumpulan sampel 2005-20 1 2 danjenis virus H5Nl. Setelah

kan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan sikuen konsensus menggunakan

·ras yang disediakan oleh genbank. Sekuen konsensus yang dihasilkan selanjutnya di

an dengan asam amino konsensus nucleoprotein asal virus H l N l pdm tahun 20 1 1

i 2012 untuk mengetahui perbedaan asam amino antar isolat. Basil pensejajaran

�uk.kan perbedaan asam amino antara H5N 1 dan H I N I pdm yaitu N26D, V391, S40G,

• R83K,RJ06l, Y1 1 I M, Il 25Y,Ll421, M l 951, V I 96A, T223V, Y295H, R3 1 J K, F31 9V,

:.:.1 f, D56K, R357K, V359I, Q360K, M377V A379T, R406K, 1431 V, T436S, T439N,

- .', R458K, V462L, N488S, N504S, dan R505Q

• OPT Orde.r �-BS 200S 2012

�:B1Nlpan::::2009_2012

OPT Order .s;,.!fP-BS 200S 2012 �:BlNlpan::::2009_2012

!Cl' O?T Order �-BS 200S 2012 �=BlNlpan::::2009_2012

· Oi'T Order �-BS 200S 2012 �=BlNlpan::::2o09_2012

O?r Order �-RS 200S 2012 O:::z:.s:SIP:BlNlpan::::2009_2012

· on Order �-BS 200S 2012 1:.:=.slfi':BlNlpan::::2009_2012

D OPT Order �-RS 200S 2012 ::.::sliP::::a1ii1pa.n::::2009_2012

IE<' OPT Order �-BS 200S 2012 ::::a.s.liP::::BlNlpan::::2009_2012

O?T Order �bl>-BS 2005 2012 �::::a1iilpan::::2009_2012

......,, OPT Order -=isSP-BS 2005 2012 ::::asSP::::a1N1pan::::2009_2012

II:? O?T Order -..:;.s:p-as 2005 2012 :::::::ts.SP::::a1Nl.pan::::2009_2012

10 20 30 40 50

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I MSDU:.IUQSQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASV'GRMVSGIGRFYIQMC

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . IG . . . . . . . . . .

60 70 80 90 100

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I TELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRY!.E.EBPSAGKDPKKTGG

. . . . . . . . D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . .

110 !20 130 140 150 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I PIYRRRDGRWV'REI.ILYDKE.EI.RRIWRQANNGEDATAGLTBLMIWBSNLN

. . . . . I . . . . M . . . . . . . . . . . . . V . . . . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . .

160 170 180 190 200

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I DAT'lQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTI.PRRSGAAGAAVKGVGTMVMELI

. . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . IA . . . .

210 220 230 240 250 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

RMIKRGINDRNFWRGENGRRTRllYERMCNILKGKFQ'lAAQRAMMDQVRE

· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · .v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

260 270 280 290 300

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · . J . · · · I · · · · I SRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFERE

: . • • . • • • . . . . . . . . . . • . • . . . . . . . . . . . . . . . • . . . • . . . B . . . . .

310 320 330 340 350

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I GYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVS

. . • . . . . . . . K . . • . . • . V • • M . . • • . • . • . . . . . . • • • • • . . • . • . . . .

360 370 380 3!10 400 · · · · I · · · · I · . . . , . · · · I · · . . 1 . . · · I · · · · I · · · · I - - · · I · · . . 1 SFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYW.!RTR.SGG

. • . . . KK.I • • • K • . • • • • • • . • • • • V . T • . • . . . . • . • • • • • . • • • . . .

410 420 439 440 450

· · · · I · · · · I · · · · I · · , , I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I NTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATIMAA.FTGNTEGRTSDMRTEI

• . . . . K . . . • . . • . . . . . . • . . . . . . . • . . V . . . . S . . N . . . . . . . . . . V

460 4 70 480 4!10 500

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

IRMl-!ESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAE

• . . . . . . K . . . L . . . . . • • • . . . . . . . • . • . . . . . • . S . . . . . • . . . • . •

. . . . j EYDNR

. . . SQ

G:!mbar 5. Hasil pensejajaran asam amino gen Nucleoprotein yang akan digunakan dalam litian ini dengan asam amino konsensus NP H5Nl dan asam amino konsensus NP H l N l

::.!D. Perbedaan asam amino antara NP HSNI dan NP HINI pdm antara lain N26D, V39T, '-00, E59D, R83K,Rl061, Vl I IM, 1 1 25V,Ll421, M J 95T, V 1 96A, 1223V, Y295H, R31 IK, """:i9V, I322M, T356K, R357K, V359l, Q360K, M377V A379T, R406K, 1431V, T436S, --39N, 1450V, R458K, V462L, N488S, N504S, dan R505Q

DNA penyandi asam amino konsensus NP dibuat dengan menggunakan program DNA2.0.

Sikuen asam amino konsensus neuraminidase dan DNA penyandi asam amino neuraminidase

r.-onsensus berpotensi untuk paten. Berikut ini sik:uen DNA NP k:onsensus.

> NPcons OPT

ATGAGCGACATCGAGGCTATGGCCTCCCAAGGCACCAAACGCTCCTACGAGCAGATGGAGACCGGCGG

CGAAAGGCAAAACGCTACAGAAAT TAGGGCTAGC GTGGGCCGCATGGTGAGCGGCATCGGCCGCTTC T

ATATCCAGATGTGCACCGAACTGAAGCTGAGCGACTACGAAGGCCGCCTGAT CCAAAACAGCATCACA

ATTGAAAGGATGGTCCTGTCCGCTTT CGATGAACGCCGCAACCGCTACCTGGAGGAACATCCTAGCGC

�GGCAAGGACCCCAAGAAGACC GGCGGCCCCATCTATAGGAGGAGGGACGGCAAGTGGGT GCGCGAGC

�GATCCTGTACGACAAGGAAGAAATCAGGAGGATCTGGAGGCAGGCCAACAACGGCGAGGACGCCACC

GCTGGCCT GACCCACCT GATGATCT GGCACAGCAACCTGAACGACGCTACATATCAGAGGACCAGGGC

�CTGGTGAGGACCGGCATGGATCCTAGGATGTGTAGCCTCATGCAAGGCAGCACCCTGCCCAGGAGGT

CCGGCGCTGCTGGCGCTGCTGTCAAAGGCGT GGGCACAATGGT GATGGAGCTGATCCGCATGAT CAAG

AGGGGCATCAACGACAGGAACTTCTGGAGGGGCGAGAACGGCAGGAGGACAAGGATTGCTTATGAAAG

GATGTGTAATATCCTGAAGGGCAAGTTCCAGACCGCTGCTCAAAGGGCTATGATGGACCAAGTCAGGG

AAAGCAGGAACCCTGGCAACGCTGAAATTGAGGACCT.GATCTTCCTGGCTAGGAGCGCTCTGATTCTG

AGGGGCTCCGTGGCTCACAAGAGCTGTCTGCCTGCTTGCGTGTACGGCCTGGCTGTCGCTAGCGGCTA

CGATTTTGAAAGGGA.AGGCTACAGCC TGGTGGGCAT CGATCCT TTCAGGCTGCTGCAAAACAGCCAAG

�GTTCAGCCTGATCAGGCCTAACGAAAATCCTGCTCACAAAAGCCAACTCGTGTGGATGGCTTGCCAT

AGCGCTGCTTT TGAAGATCTCAGGGTGAGCAGCTTCATCAGGGGCACAAGGGTGGTGCCTAGGGGCCA

ACTGAGCACACGCGGCGTGCAGATCGCCAGCAACGAGAACATGGAGGCCATGGACAGCAACACCCTGG

AGCTGAGGAGCCGCTACTGGGCTATCAGGACCAGGAGCGGCGGCAACACCAACCAGCAGAGGGCTAGC

GCTGGCCAGATCAGCGTGCAAC CTACATTTAGCGTGCAAAGGAAC CTGCCTTT CGAAC GCGCTACAAT

CATGGCTGCTTTCACAGGCAACACAGAAGGCAGGACATCCGATATGAGGACAGAAATTATTAGGATGA

7GGAAAGC GCTAGGCCTGAAGACGTGTCCTT CCAGGGCC GCGGCGTGTTCGAGCTGAGCGACGAGAAG

GCTACAAACCCTATTGTCCCTTCCTTTGACATGAACAACGAAGGCAGCTACTTCTTCGGCGACAACGC

7GAAGAATATGATAACAGG

V.4. Pembuatan DNA sintetik Lysteriolisin

Hasil pensejajaran asam amino listeriolisin tidak menunjukkan ada perbedaan asam amino

!isteriol.isin yang diunduh dari genbank dengan asam amino hasil translasi gen listeriolisin

yang telah dioptimasi kodon untuk sistem mamalia.

�7steriolisin M24199 M29030 -TsteriolisinORD

-

�7steriolisin_M24199_M2 9030 _7steriolisinORD

:.ysteriolisin M2 4199 M29030 :ysteriolisinORD

-

�ysteriolisin M24199 M29030 lysteriolisinORD

-

:.ysteriolisin_M241 99_M29030 :ysteriolisinORO

:.ysteriolisin �124199 M29030 lysteriolisinORD

-

Lysteriolisin M24199 M29030 lysteriolisinORD

-

Lysteriolisin M24199 M29030 lysteriolisinORD

-

Lysteriolisin M24199 M29030 lysteriolisinORD

-

Lysteriolisin M24199 M29030

lysteriolisinORD

Lysteriolisin_M24199_M29030 lysteriolisinORD

1 0 20 30 40 50 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · . . . I · . . . I

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSl-!APPASPPASPK

60 70 80 90 100 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · - I · · · - 1 · · · · I

TPIEKKBADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYBGOAVTNVPPRRGYRDGNEYIV

110 120 130 140 150 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · - I . . . . I . . . . I

VEKKKKSINQNN.ADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRD

160 l 70 180 190 200 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · . . I . . . . I . . . . I SLTLSIDLPGMTNQDNKIVVI<NATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNV

210 220 230 240 250 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · - · I

SAKIDYODEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVIS

260 270 280 290 300 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

FKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGR

- 310 320 . 330 340 "350

· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I Qvn.KLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGOVELTNIIKNSSFKAVIYGG

360 :no 380 390 400 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

SAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVI

410 420 430 440 450 . . . · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · . . I

KNNSEYIETTSKAYTDGKINIDBSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQH

. . . . . . . • .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . " . . . . . . . . . . � . . . . . . . . .

460 470 480 490 SOD · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I

KNWSENNKSKI.AHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEt��TVIDDRN

510 520 · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · ·

LPLVRNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE

Gambar 5. Hasil pensejajaran asam amino lysteriolysin yang diunduh dari genbank dengan

asam amino hasil traslasi gen sintetik ayng telah dioptimasi untuk sistem mamalia

menunjukkan tidak ditemukan adanya perbedaan asam amino antara lysteriolisin yang

diunduh dari genbank dengan hasil translasi gen lysteriolisin sintetilk.

_.elanjutnya asam amino listeriolisin dibuat sikuen DNAnya dengan bantuan piranti lunak

..... NA.2.0 dan dioptimasi untuk sistem mamali, berikut ini adalah sikuen DNA penyandi

.JSteriolisin. Sikuen asam amino dan DNA yang dihasilkan dalam penelitian ini berpotensi

--::uen.

>lysteriolisinORD

ATGAAGAAGAT CATGCTGGTGTTCATCACCCTGATCCTGGTGAGCCTGCCCATCGCC

CAGCAGACCGAGGCCAAGGACGCCAGCGCCTTCAACAAGGAGAACAGCATCAGCAGC

ATGGCCCCCCCCGCCAGCCCCCCCGCCAGCCCCAAGACCCCCATCGAGAAGAAGCAC

GCCGACGAGATCGACAAGTACATCCAGGGCCTGGACTACAACAAGAACAACGTGCTG

GTGTACCACGGCGACGCCGTGACCAACGTGCCCCCTAGGAAGGGCTACAAGGACGGC

AACGAGTACATCGTGGTGGAGAAGAAGAAGAAGAGCATCAACCAGAACAACGCCGAC

ATCCAGGTGGTGAACGCCATCAGCAGCCTGACCTACCCCGGCGCCCTGGTGAAGGCC

AACAGCGAGCTGGTGGAGAACCAGCCCGACGTGCTGCCCGTGAAGAGGGACAGCCTG

ACCCTGAGCATCGACCTGCCCGGCATGACCAACCAGGACAACAAGATCGTGGTGAAG

AACGCCACCAAGAGCAACGTGAACAACGCCGTGAACACCCTGGTGGAGAGGTGGAAC

GAGAAGTACGCCCAGGCCTACCCCAACGTGAGCGCCAAGATCGACTACGACGACGAG

ATGGCCTACAGCGAGAGCCAGCTGATCGCCAAGTTCGGCACCGCCTTCAAGGCCGTG

AACAACAGCCTGAACGTGAACTTCGGCGCCATCAGCGAGGGCAAGATGCAGGAGGAG

GTGATCAGCTTCAAGCAGATCTACTACAACGTGAACGTGAAC GAGCCCACCAGGCCC

AGCAGGTTCTTCGGCAAGGCCGTGACCAAGGAGCAGCTGCAGGCCCTGGGCGTGAAC

GCCGAGAACCCCCCCGCCTACATCAGCAGCGTGGCCTACGGCAGGCAGG TGTACCTG

AAGCTGAGCA�CAACAGCCACAGCACCAAGGTGAAGGCCGCCTTCGACGCCGCCGTG

AGCGGCAAGAGCGT GAGCGGCGACGTGGAGCTGACCAACATCATCAAGAACAGCAGC

TTCAAGGCCGTGATCTACGGCGGCAGCGCCAAGGACGAGGTGCAGATCATCGACGGC

AACCTGGGCGACCTGAGGGACATCCTGAAGAAGGGCGCCACCTTCAACAGGGAGACC

CCCGGCGTGCCCATCGCCTACACCACCAACTTCCTGAAGGACAACGAGCTGGCCGTG

ATCAAGAACAACAGCGAGTACATCGAGACCACCAGCAAGGCCTACACCGACGGCAAG

ATCAACATCGACCACAGCGGCGGCTACGTGGCCCAGTTCAACATCAGCTGGGACGAG

GTGAACTACGACCCCGAGGGCAACGAGATCGTGCAGCACAAGAACTGGAGCGAGAAC

AACAAGAGCAAGCTGGCCCACTTCACCAGCAGCATCTACCTGCCCGGCAACGCCAGG

AACATCAACGTGTACGCCAAGGAGTGCACCGGCCTGGCCTGGGAGTGGTGGAGGACC

GTGATCGACGACAGGAACCTGCCCC TGGTGAAGAACAGGAACATCAGCATCTGGGGC

ACCACCCTGTACCCCAAGTACAGCAACAAGGTGGACAACCCCATCGAG

-. Pembuatan DNAsintetik fusi SPD-CD40L human

Fusi SPD _ CD40L dilakukan dengan cara mengunduh sikuen mRNA penyandi

protein surfactan protein D manusia diunduh dari gen bank dengan nomor akses

NM_003019 versi NM_00301 9.4 GI:61 699225. Sikeun mRNA penyandi protein

CD40L manusia diunduh dari gen bank dengan nomor akses NM_000074 versi

NM_000074.2 GI:58331233. Fusi gen mengandung sinyal peptide yang diperlukan

supaya protein dapat diekspresikan di membran sel. Sinya peptide berada pada bagian

C terminal. Gen SpD yang diambil dalam fusi ini merupakan bagian yang dapat

membentuk strukur trimer. Hal ini ditujukan supaya CD40L yang terfusi dibagian N

terminal SPD dapat membentuk struktur trimer, karena fungsi biologis CD40L

ditentukan oleh struk:tur polimemya. Bagian CD40L yang difusi merupakan bagian

globular, yang merupakan bagian fungsional CD40L. Bagian transmembrane CD401

tidak diikut sertakan dalarn pembuatan fusi. Fusi yang dilakukan dalam peneltian ini

berbeda dengan peneltian terdah�lu yang memfusikan SPD secara utuh dengan

CD40L. Berikut ini adalah basil pensejajaran asam amino fusi SPD_CD40L, CD40L

dan SPD.

lO 20 30 40 50

FusiSPD co40L [i�����ki.TQ����4�§.��1.���htYi'.f��§.�:�§tR�k=:::=J CD40Lliuman --------------------------------------------------SPOhuman

6() 70 8() 90 100 , ... : .. : .. : ... : .. l..: ... : .. :_d .. : __ , __ ,__,_L,_� _ _. __ ,_J_: ... : .. : .. d .. : .. : ... : .. : .. L: ... : .. : .. " . .l..: ... : .. : .. : .. l..: .. : ... : .. : .. L.: .. : .. : ... d ...... ___ _ FusiSPD CD40L L!?.§.�§RE��<,;_:;.11:G.�:;>G.h!?.GM§2!:'l�!1.�§Q�G.�.Y.G.fJl:GJ;mG.$.Y.§.;.�§.?..!SG ....... J

co4oLBuiiian --------------------------------------------------SPDhuman r

·

t>G�!iG'!lE"<�-Pll:i.'iEKGl5�Gt15G1iAGQAGM!_)GQJl:GPVGPl\G.ONG-SVGE'P"GPKG""""·

···:

: .... ·----··-·-·--··--·--························--· --------···········--·······-··-··-····-·········-············ .. ·-····-······:

110 120 130 140 150

...... : ... : .. : .. : ... l .. : .. : ... : .. :_.L.: .. : .. : ... : .. L.: .. : .. : .. : .. .l..: .. : ... '. .. : .. 1..: •. : .. : ... : .. J .. : ... : .. : .. : .. .L: .. : ... '. .. : ... l .. : .. : .. : ... '. .. 1..: ... : .. : .. : ... 1 ......... . FusiSPD _ CD4 OL L. .. !?.!.(;J.:;?_�l:':r'�J:'.:E'.0!:r'.�J:'�§.�.�l?,�Ci.�Q-�l:l!(;J:'9.Ci.�J:'�J:'�.��(;.J:'���Y..c;�J:' ...... J CD40LHuman --------------------------------------------------SPDhuman

160 170 180 190 200 ••. : •• : .. : •. .-.. .1 .. : .. : ... : .. : .. 1..: .. : .. : ... : .. L: .. : .. : .. : . ..l .. : .. : ... : .. : .. L: .. : .. : ... : .. L.-... : .. : .. : .. .l .. : .. : ... : .. : .. L: .. : .. : ... : .. L: ... : .. : .. : ... I ............. .

FusiSPO CD40L Lc;�qc;�.?1-�(;Yl,(;l:'.IS(;�B:c;Y.:P..Ci.�B:c;YP.c;!i'.!'.(;JY.l:(;:?.��c;g_g_c;:?..?..�c;.P. __________ _' co40LBuiiian --------------------------------------------------SPOhuman

210 220 230 240 250

:····'··"··•··'·-L_, ___ , __ , .. L .. , .. , ... -..J .. , ........ _,._L .. , ... : .. : .. L�--'-·'··'·.J .. ,._, __ , __ ,_J .. , .. , ... : ..... 1...-• •• : •. : •.. -. .J .. ,, . .-... : .. : . .l .... �

Fus iSPD _ CD4 OL L..l?.Gl..KG.P.KG.ll'.G.P.KG.MG. .. t.S�:!.�P.Yll.$. :t.BQQ.�Q@YQIU1QMf..�.Q� ....... ..i C040LBuman -------------MJ:ETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYl.LTVFLITQMI SPDhuman L..�����PE§Ii>G�K�!f��-��!?.Y.'..����gg��i�i!f9.AA"f�q����J

260 270 280 290 300 _,_,__,__,_j • • • .:..i...:....'.- I · · · · l · ·

· - ...L.:..:..:... L:...:..:..:..L:...:. :.l�- · - I FusiSPO C040L l VELF!;GGstt.11R.RLDrff£0ERNLr:iOFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNetf'Cl C040LHuman ,....GSAµ"A�HRRLDKIEOERNLHEOFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEI � SPOhuman L_yg_!-_gPNGQSVG�ltl'.rt('1\�G�F'1'£AQLtc'l'O)l.�ts��ioou;-···'

FusiSPD C040L C040LHuman SPDhuman

FusiSPD C040L co40LHuiiian SPOhuman

310 320 330 340 350 ,_, __ ,_..__,_L,__,_,-'J .. , .. , ... : .. : . .l .. , .. , .. , __ ,_.L.-._, __ , __ , __ L: . . : ... : ..... L:. .. : .. : ... : .. L: .. .-... ,_,_.J.., __ , ___ �_,_L.: .. : .. : ... ,.L_., jKSQFEGFVKDIMLNKEETKKE.NSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSV j ! KSQFEGFVKDI�ll.NKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSV � .. QQL�Si-ITDSKTEGKFTYPTGESLVisNWAi>Gt1>Ni5oGGSEi5 _____ _

360 370 380 390 400

_: . .:. .. : .. : .. L: ... : .. : .. .-.. .1 .. : •. :_.:.� .. L.� ... : .. : .. l .. : ... : .. : .. : .. .L: .. : ... : .. : .. L: .. : .. : ... :.L ... :..:...: . .l..: .. : __ : __ : ... 1 .. .:..:_.:._: __ J... __ _ i LQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYI>.QVTFC SNREASSQA i ! LQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQA i '··cwir'l'NGRWI:iru\:C�rKtU.wc�r-·······················-··················----------········-··---·----------·······'

410 420 430 440 450 "".: ... : .. : .. : .. l.: .. .!..:_:_l.: __ , __ , ___ d __ .-... : .. : .. : .. L.:,.:_: .. : .. L .. �..:..: . .l..: ... �.:-" . .1 .. c.: •. : ... : . .l..: ... , .. : .. : .. l..: ... : .. : .. : .. l ........ , FusiSPO C040L 1 PFIASLCLKSPGRFERILLR.?i.MlTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASV !

CD40LHuiiian j---��E�_s_l:.���:;-�_(;_���-�!�����!-��-�-<:,�3.9.:.�-�-�(;�::'!,�.L..9.��:'.?;�_Y. _____ _J SPOhuman

460 4i0 __ .: .. : .. : .. : .. l .. : .. : .. : ... : .. L ... : .. : .. : .. L :."--'--'-..1 .. : .. : .. o..: .• l ........ .

FusiSPO C040L i FVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL C040LBuman i__�i:>-�:g��'.1�.(;�_'l:'-�-��-:--�!?.:.: .. _______ , SPOhuman

Garn bar 6 . Pensejajaran asam amino fusi SPD _ CD40L dengan SPD dan CD40L asal

manusia. Sikuen asam amino SPD berada dalam kotak warna biru, pada sikuen Fusi

SPD_CD40L dipisahkan oleh asam amino GGGS, sikuen asam amino CD40L berada dalam

kotak wama kuning.

Gen penyandi asam amino protein fusi SPD _ CD40L selanjutnya disusun dengan

menggunakan piranti lunak DNA2.0. Berikut ini adalah sikeun DNA penyandi protein fusi

SPD CD40L.

> HumanSPD-CD40L

ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGGAATGAAGACCTACTCCCA

CAGAACCATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGA

GAGAGGGCCCTCGCGGCGAG.l\AGGGCGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCA

GTTGGCCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCC

CGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCC.�GGCCCAA.AAG

GAGAAGCTGGCCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCAGCGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGA

GAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGAGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAG

TCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGP.AGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTC

CAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCCTGCAAGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAG

AAAGTTGAGCTCTTCGGAGGTGGATCTCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTCCATGAAGATTTTGT

ATTCATGAA.l\ACCATCCAGCGGTGTAACACCGGCGAAAGATCCCTGTCCCTGCTCAACTGCGAAGAGATTAAA.�GCCAGTTTG

AAGGCTTTGTGAAGGATATAATGCTGAACAAAGAGGAGACCAAGAAAGAAAACAGCTTTGAA.'f\.TGCAAAAAGGCGATCAGAAT

CCTCAAATTGCTGCTCACGTCATAAGCGAGGCTAGCAGCAAAACAACATCTGTGCTGCAGTGGGCTGA.�GGATACTACAC

CATGTCCAATAATCTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGrTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAG

TCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTAGCAGCCAAGCTCCTTTTATAGCCAGCCTCTGCCTGAAGTCCCCCGGCAGATTCGAG

AGAATCCTGCTCCGGGCTGCTAATACCCACTCCTCCGCCAAACCTTGCGGCCAACAATCCATTCACCTGGGCGGCGTGTTCGA

GCTGCAGCCTGGCGCCTCCGTGTTTGTGAATGTGACAGATCCTAGCCAAGTGAGCCATGGCACAGGCTTCACATCCTTTGGCC

TCCTCAAACTC

V.6. Perancaogan dao Konstruksi vektor pengekspresi vaksin DNA berfusi dengan gen

adjuvant.

Gen periyandi protein adjuvant ·yaitu gen VP22 penyandi pmtein VP22, gen C3b atau P28

penyand i protein C3b (P28). Gen akan di klona secara berfusi pada bagian C tenninal protein

Hemaglutinin, menggantikan posisi Tran.s·membrane dan Cytoplasmic tail sehingga protein

yang dihasilkan merupakan protein hemaglutinin berfusi dengan gen penyandi VP22 atau

P28. Dalam peneltian ini kemampuan hemaglutinin untuk membentuk struktur trimeric tidak

dihilangkan, sehingga protein fusi yang dihasilkan akan dapat membentuk struktur trimer dan

protein adjuvant akan ada dalam keadaan multimer.

Gen adjuvant CD40L akan dibuat dengan memfusikan surface protein D pada bagian

N terminal CD40L. gen fusi selanjutnya akan diklona dalam vektor pcDNA3.1, sehingga

akan diperoleh pCDNA3.1 SPD-CD40L. Saat digunakan sebagai adjuvant, plasmid

pcDNA3. l SPD-CD40L akan dimasukkan/disuntikkan bersama-sama dengan DNA vaksin.

Diharapkan penyuntikan plasmid penyandi protein CD40L akan meningkatkan respon

kekebalan humoral.

Adjuvant Lysteriolisin dibut berdasarkan kemampuan lysteriolisin untuk melepaskan

'5ri dari endosom sehingga protein tidak dihancurkan oleh protease lisosom. Dalam

;enelitian ini gen Jysteriolisin akan diklona dalam vektor ekspresi prokariota. Protein

�"Steriolisin akan ditambahkan pada saat formulasi vaksin DNA, Baculovirus atau protein sub

.::n it.

V.7. Pengklonaan gen HA-H5Nl tanpa daerah transmembran dan cytoplasmic tail {HAACTM) ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1(+)

Fraginen gen HA H5N I tanpa daerah cytoplasmic tail dan transmembran domain

diamplifikasi menggunakan teknik PCR dengan template berupa fragmen gen HA full yang

relah diklona ke dalam plasmid pcDNA3. l (+). Ukuran pita DNA yang diharapkan dari basil

amplifikasi adalah ± 1400 bp. Gambar 7 menunjukkan hasil amplifikasi DNA sisipan dan

pemotongan DNA vektor.

�et-: M :M..t&l>NA..-ule< 1 : he:lll PCR HMTM

: pcDHJ\3.Hfhd

Gambar 7. Persiapan DNA vektor dan insert HAL\TM

DNA insert dan vektor yang telah direstriksi dengan enzim restriksi Nhel dan EcoRJ

kemudian dipurifikasi dan diisolasi menggunakan 0,8% Low Melting Agarosa dan dil igasi

dengan perbandingan DNA sisipan:vektor = 3: 1.

Seleksi menggunakan teknik PCR koloni dengan pasangan primer yang mengamplifikasi

daerah MCS vektor. Gambar 8 menunjukkan bahwa 1 2 dari 14 klon teridentifikasi positif

mengandung sisipan HA� TM.

Agarosa0,8"; 110 V; 30 menit

Keteransan: 7-11 : plasmid rekombinan pcDNA 3.1· M :MarbDNA Wt :�idwild-type(271bp)

a

Gambar 8. Ha5il verifikasi PCR dari pcDNA3 . l HA�TM

Aprosa0,8%; l.10 V; 30 menit

Keten.npn: 12-20 : pla=>id ieb>mbinan pcDNA 3.1.-HA (174lbp) M : Matb DNA wt : plasmid wild-type (271 bp)

b

Salah satu klon, yaitu ·pcDNA3 1 (+)J:-IA�1M(13) diverifikasi sekuensing dan

menunjukkan kesesuaian DNA sisipan dengan template gen HA H5N1 . Hasil sekuensing

menunjuk.kan bahwa gen HA telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+) (Gambar

9). Plasmid kemudian diperbanyak dan disimpan dalam bentuk stok kultur.

10 lC . I . I ·

lO . I .

50 I · · · · I · I . .

60 I .

HAH5 A T G G A G A A A A T A G T G C T T C T T C T T G C A A T A G T C A G T C T T G T T A A A A G T G A T C A G A T T T G C A T

M E K V L L l A V S l V K S D 0 C

pc0N"31HATM AT QQA Q A A A A T A Q T C C T T CT T C T T Q C A A T A Q T C A G T C T T GT T A A A A G T G A T C AG A TT T G C A T

M E K L A V S L V K S D 0 C

100 I . . I ·

::o I . . · I · i .

·zo 130 . . . I . ' .

HAHO A T G C A A A C A A T T C A A C A Q A G C A G G T T Q A C A C A A T C A T G G A A A A G A A C G T T A C T G T T A C A C A T

H A N N S T E Q V D T M E K N V T V T H pcDNA31HATM AT G C A A A C A A T T CAA CA G A G C A GG T T G A C A C A A T C A T G G A A A A GA A C G T T A c T G T TA CACA T

H A N N S T E Q V D T M E K N " T V T H

150 . I .

>to . I ·

170 I .

180 . I

190 I . . · I

200

HAH5 C A T A C T G G A A A A G A C A C A C A A C G G G A A G C T C T G C Q A T C T A G A T G G A G T G A A G C C T C T A A T T T

L E K T H N G K L C D L 0 G V K P L

p.cDNA31HATM CAT A c T G G A A AA G A C A C A C A A C G G G A A G C T c TGCGA T C T A G A T G G A G I GA A GCCTCT A A T T T

L E K T H N G K L C D D G V K P L

Z20 I · · · I . . · · I ·

230 I . . · · I ·

2<.0 . I ·

250 . I .

260 · I . . · I · · · I ·

270 I .

HAH5 T G T A G T G T A G C T G G A T G G C T C C T C G Q Q A A C C C A A T G T G T G A C G A A T T C A T C A A T G T A C C G G A

c s v A G w L l G N p M c 0 e F N v p e pc:ONA31HATM TOT A G T GT A QCT QQA T G G C TC C T CQGGAACCCAA T G T G I g A C G A A T T C A T C A A T GT A CCGGA

C S V � G W L G � P M C D E F N V P E .

I . I . . I 300

I . I . . . . . . I ))0

. I . I . . I HAH5 A C A T A G T G G A G A A G G C C A A T C C A A C C A A T G A C C T C T G l l A C C C A G G G A G T T T C A A C G A C T A T

Y V E K A N P T N 0 L C Y P G S N O Y

pc0NA31HATM A CAT A G t GGA G A A G G C C A A T C C A A C C A A T G.ACCTCT G T T A C C C A G G G A G T T T CAA CGACT A I

Y V E K A N P T N D L C Y P G S F N 0 Y

l60 370 I . I .

HAH5 G A A A C A C C T A T T Q A G C A G A A T A A A C C A

K' H L S f\ N

pc:ONA31HATM GAA A CAT C t AT T G A G C C G A A T A A A C C A

K H S R N

Garn bar 9. Hasil alignment pcDNA3.1 (+)HAll.TM

V.8. Pengklonaan adjuvan gen Cd40L ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1(+)

Sintesis DNA sisipan CD40L yang menyandi protein CD40L dilakukan melalui proses

amplifikasi polymerase chain reactor reverse transcriptase (RT-PCR) menggunakan RNA

yang diekstraksi dari sel PMBC mencit sebagai materi genetik pola cetaknya. Amplifikasi

DNA penyandi protein CD40L menggunakan reagen One Step RT-PCR Superscript 111/Taq

Platinum dan pasangan primer MSCD40L_F l dan CD40L F2. Gambar IO menunjukkan

hasil PCR dari DNA sisipan Cd401.

10000

l'et�: M :MMUOHA......,....

: ha<ll PCR CD40t. (782 bpi · : pob DHA CD40l (78l bp)

Garn bar I 0. Hasil PCR CD40L

DNA adjuvan Cd401 akan diklona ke dalam plasmid ekspresi mamalia pcDNA3. l

dengan situs restriksi HindIII dan EcoRI. Gambar 1 1 menunjukkan skema pengklonaan

DNA adjuvan Cd401 ke daI11:m vektor pcDNA3.1 .

Gambar 1 1 . Skema pengklonaan DNA adjuvan CD40L dalam vektor pcDNAJ. l

Plasmid pcDNA3. l (+) pertama-tama direstriksi dengan enzim restriksi Hindlll selama

16 jam. Hasil yang diharapkan adalah plasmid terlinearisasi, kemudian dipurifikasi

menggunakan QIAEXII gel extraction kit dengan metode desalting. Gambar 12

menunjukkan plasmid pcDNA3. l yang telah direstriksi dengan Hindlll dan dipurifikasi

menggunakan kit tersebut.

bp

3000 -

1000 ret�nt"ft: "' :"'acbDHA�

: �pdlNAl.l .. ld l}'PP : pl..smld pcDN3.1 dioettb Hindlll (5427 hp)

• :p�•DHApdlNA3.l�<i

Gambar 12. Restriksi plasmid pcDNA3.l dengan HindIII.

Plasmid pcDNA 3. 1 (+) yang telah dilinearkan dengan HindIII kemudian direstriksi

kembali dengan EcoRI. Pengklonaan menggunakan dua enzim restriksi memiliki keuntungan

yaitu tidak diperlukan verifikasi orientasi DNA sisipan. Gambar 1 3 menunjukkan hasil

restriksi pcDNA3.l Hine/Ill dengan EcoRI

bp M 1 2

10000 -

6000 -

3000 -

500-l(et�npn: M : Malb DH.A lf'IM"Uler

: plasmid pcONA3.1 wild type : plasmid pcON3.l din:strit:si Hindlll-fooRI (5427 hp) : pibt DNA pc:DNA3.1 tetfine.arisasi

AprosaO,B'l(,; 100Y; 30menit

Gambar 13. Hasil purifikasi restriksi plasmid pcDNA3.l dengan HindllI dan EcoRl

DNA sisipan CD40L yang telah berhasil diamplifikasi juga harus direstriksi dengan

enzim restriksi Hindlll dan EcoRI. Gambar 14 menunjukkan hasil purifikasi DNA sisipan

setelah direstriksi dengan kedua enzim restriksi tersebut.

bp M

10000 -

1000 -

500 -

1

1(--: M : Mad:aONA,.....uler 1 : DNA act;uv ... Cd40I direstribi det>Pft Hindl9-Ea>RI

- : p;ta ONA adj<Moned4CI {7112 bp) Aposa 0,11%; 100\f; 30 menit

Gambar 14. DNA sisipan CD40L direstriksi dengan Hindlll dan EcoRI

DNA plasmid dan sisipan yang telah diisolasi menggunakan Low Melting Agarosa

kemudian diligasi dengan enzim T4 DNA ligase. Perbandingan DNA vektor dan sisipan

adalah 1 :3. Campuran reaksi ligasi diinkubasi pada suhu l6°C overnight. Hasil ligasi akan

ditransformasi ke dalam sel Escherichia coli TOPI 0 kompeten. Proses transformasi

menggunakan metode heat shock. Pertumbuhan _bakteri terlihat berupa koloni p�tih pada . .

plate sebaran hasil ligasi pcDNA 3.1(+) dengan CD40L, �enunjukkan keberhasilan ligasi.

Namun demikian, perlu verikasi lebih lanjut apakah koloni yang tumbuh membawa DNA

sisipan CD40L. Koloni putih juga tumbuh pada kontrol positif transformasi, yaitu pcDNA

3.1 (+) wildtype (10 ng/µ1) (Tabel 1). Kontrol negatif transforrnasi yang hanya berisi sel

kompeten E. coli TOPI 0 tidak menunjuk.kan pertumbuhan sama sekali. Hasil perhitungan

efisiensi transformasi menunjukkan efisiensi yang tinggi yaitu sebesar 8,25 x 105 cfu/µg._

Tabet 1 . Jumlah koloni hasil transformasi

Hasi I transformasi Jumlah koloni Transformasi hasil Ji_gasi pcDNA 3 . 1 (+) - Cd401 (50 µI) 5 Transformasi hasil ligasi pcDNA 3 . 1 (+) - Cd40/ (200

23 µI) Kontrol ligasi pcDNA 3. 1 (+) - Cd40/ -

Kontrol positif pcDNA 3. 1 (+) widtype ( 1 0 ng/µl) 1650 Kontrol negatif transformasi (sel kompeten) -

Verifikasi DNA rekombinan dengan tek.nik PCR koloni menggunakan pasangan primer

vektor yaitu CMV _F dan BHG_R, pasangan primer tersebut akan mengapit daerah vektor

yang membawa DNA sisipan. Hasil analisis pada gel agarosa 0,8% menggunakan marka gene

ruler DNA ladder mix menunjukkan adanya pita DNA pada lajur 1 --3, 6, dan 12 yang

berrnigrasi hampir sejajar dengan marka DNA 900 pb dan kemungkinan merupakan insert

CD40L. Visualisasi agarosa 0,8% hasil amplifikasi PCR koloni rekombinan dapat dilihat

pada gambar 1 5.

bp

3000

1000 •

500

M wt 1 2 3 4

Ketennpn: M :M•rbDNA�

""' : pd)NA3.l wild-type 1-13 : pd)NA3.1 Cd40I reiDmbinan

s 6 7 8 9 10 11 U 13

-> : pita DNA hasil.wnplifibsi prw.-CMVMHGR (i90D bp)

Gambar 15. PCR koloni plasmid rekombinan

Sebanyak 2 plasmid rekombinan pcDNA3.l-Cd40L yang positif mengandung sisipan

CD40L dengan verifikasi PCR kemudian dikultur ke dalam 4 ml media Luria Bertani cair dan

diisolasi plasmi� untuk kemudian diverifi_kasi dengan sekuensing. Hasil sek�ensing gen

CD40L telah berhasil diklona ke dalam plasmi.d pcDNA3.l. Gambar 16 menunjukkan hasil

pensejajaran plasmid rekombinan dengan sekuen CD40L awal.

�H/..11CD.\Ol.8HGR CO'Ot.ori 0.H'I Co1u•n•u.s

pd)NAl1C04C>L.BHO.A: COIOl.o" Cltnul Co1n•nt1u

td)HJ.l1CC»OL .. B>tGR .......... Ow\Qj COM.eft'HH

!( -) ·� • I , I I I

C G � A G � G G 4 A G T � A , C C T T C A T0 A A G � l. T l 1 G T � T 1 C A T � c o ; � G ! G G 4 ; G f A A • C C T T C 4 T Q A j � � T T T t G , ;. r T C A T ;.

,t_, ··r . I I I ;. .:. ;. ;. � G C T • • � G � 0 4 T O C A • C · · � G G .& G � .& GG A T C T T T • T - ! � A A G C l A .;. l Q A O • T G C > .& C ll 4 • G G � G � • GG A � C T T 1 • 1

' : I �IC�_811GR c c ; •Ge l G .... � c fGTG,,.GG ... o Ii TG .. c:. :.GGC - ... i'. T J G . o. G ;. Cl).t:OLof'I C C T T GC t G ;. :. c r G J G , G G .& 0 4 T O A 0 ,;. ,t. G G C :. - � T T G • ,;. G -' Ornul Con'"'""''

�1C0.&.01.._IWGR CDoO<.on Oir\ut ConHn�1n

td)+WtCO-*OL._8'.HGR a:MCl\.on Ont.a1Conu11n1t

..oN.UtCD&.Ol_BHGR awo<.on OM:uf COl'l••n'l.1o1t.

... f r • I

C C T • G 1 c ;. ;. Q G � l � T ;. � C O T T � � � c - � � G � - G � G ;. � - � , ;. C C T T G T C ! ;. G G - T ! T ! � e o r r � � � c - � -=- G .t � G � G ;. ;. � � � �

. : · I I ' I � .

G � � � � C ! G C l T T G � � A l O C A A � O A O O i G J I G ! Q G A T C C T C G ; ;. � a C r G C T T l O � t � 1 G C A � ' 0 4 0 G i G � T O r G O � t C C 1 C

:• 1 • ' . ' I ! � � l ! GC ; G C A C � CO T l 0 l 1 r O CG - � o c c , � c � u 1 r ... 1 a c ! � � 1 1 o c ; G C .O C A C G T T G l � � o c c � - o cc , • c � G 7 � ! T GC

pc0NAJ.IC0401..,.8HOA' CO"'°"'o-rl Cl\ltl>I COl"lteMu�

pc0H,A:)1CO.Ol.._8HOR COo40l.ori C1un•1 C...,,.",.,,''

p.<01!.\31CC)..IOL .. 8HGR C040!..on Clu1UI c-'•"'-'"

"H ·� ! I I ! I

A G C � l C C G l f C T • C A G T 0 0 0 C C A � C � .l. � G G £ T a ? T A � � c c ' G C � T C C G l l C T n C � O T G G O C C A & 0 � £ A G G � T � T T � T A C C

1�.1 i I I I I ' I 4 T a lo. ' }'. .... G c ,I. . .;,,, c l t G G r " � f 0 c f r 0 It. A ,\ J. r GG G 4 .. ... c AG c 4 T G A � � � a c � � C � T G G l � A t f C f T Q A � A A T GG G A A A C A O C

�- � .:.� ' ' ' C C � 1 T C .t T C G T C G G C C T C T O O c · o - .1. o c c c 6 G C • G l G G .o.. T C C � 1 T C 6 T C G � c G G C C T C l G Q c f o ... � o c c c ..;.. G C ; G T G G .o. 1

poc0UAJtC�L.,.6HCA C TO ... G :. G .:. ;. T C T "I ;. C 1 C. .:. .:.oOC.CCC. - - T .o.. CCC .:... C .11. G l '! C CO�o" c j Q .lt. G .\ G .t - r e T T .;. c I c :. ..;.. Q O C O O C .a. .I. A 1 .- . e c. c ... cs.GT "J C C::IU•ulC9ft•·•"" .. '

pcOHAl1CO-.,..&HCR c · c c c -c;e'! T t G C C - G C - c c .. G : c · e r 1 c ;. .: ' t T G G G C G G • CQ.IOt..on c · c c c .o.GC"! 1 1 C. C G - tl C -oc .. c re t G . "' C ;. c J l G G G C G G ­Cl1.1•UICO"', .... ,�

••ONAl 1CC..OL_8HOA 0 � G f �TC ... ;:.. T T ;. c ... .. G c 1 OG T 0 c r i e - 0 T 0 � T t G T c ... - C G CO.liOl..•rl G , G T T T G .::. � T J ,. � .. ;. G c 1 G G , G c f • c T G T Ci ; T r G T c - M C; G Cl1.1•u•C-••"'•1.1•

pc.O"Al 1Cl).tOl.,,.BHOR CO-'OL..o" Cl1.1t.t•I C:O .. ,•rt11.1•

pcCHlAl IC:0.-:01...BttOA CD"«.o" Cl1.1•u•I Co"t•"'Mn

I ·� . T G � C T G � � G C & • G C C A 4 G l 0 A l CC � C � 0 A C 1 T O G � T T C T C: r G .i:. c 1 c .:.. .; G C .1. • G C C ..., ... G r o .0 1 c c .. c .... o A C r 1 � G c r r c r c

EcoRI

Gambar 16. Hasil alignment DNA sisipan dengan gen CD40L mus musculus

Plasmid pcDNA3. J -Cd401 yang telah terverifik.asi dengan sekuensing kemudian akan

diisolasi skala besar dan dibuat stok kultur untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.

pc0NA31P28(131_BHGR pcDNA31P28(13)_CMVF p28 Clu•tlll Consensu•

pc0NA31P28(131_BHGR pc0NA31P28(13)_CMVF p28 Clust•I Consensus

pc0NA31P28(131_BHGR pc0NA31P28{13)_CMVF p28 Clusul ConHnsus

pcDNA31P28(13)_BHGR pcDNA31P28(131_CMVF p28 Clusul Consensus

pcDNA31P28(13J_BHGR pc0NA31P28(13 )_ C MVF p28 Clusul Consensus

pc0NA31P28(13)_BHGR pcDNA31P28(13)_CMVF p28 Chatal Coni.•nsus

Hind Ill n m • I I I I I I

C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A G G A C A A G A A C C

A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A G G A C A A G A A C C

50 60 70 80 I I I I I I I I

G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A C G T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A CG T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C CG G C A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C

90 Barn HI m i20 I I I I I I I I

C A G C T A C G C A T A A G G A T C C G G T T G G A G G G A G C A A G T T C C T C A G C T A CG C A T A A G G A T C C G G T TG G A G GG A G C A ; G T T C C T C A G C T A C G C A T A A G G A T C C

1m MO 1� NO I I I I I I I I

G A C C A C CG C C A AG G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C CG G C G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C C G G C

170 180 190 200 I I I I I I I I

A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C C A G C T A C G C A T A A G G A T A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C C A N C T A C G C A T A A G G A T

210 220 230 2• I I I I I I I I

C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C TG A C C A C C G C C A A G G A C A A C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A GG A C A A

2-5.0 260 270 280 I I I I I I I I

pc0NA31P28(13)_BHGR G A CGG TGGG A GG A C C C C G G C A AG C TG T A C A A CG T G G A G G C p�DNA31P28(13)_CMVF G A CGG T G G G A G G A C C C C G G C A A G C TG T A C A A C G T G G A G G C p2B Clustal Cons•nsus

290 300 310 320 I I I I I I I I

pc0NA31P28(131_BHGR C A C C AG C T A C G C A T A AG GA T C C A C T AG T C C A G T G T G G T G G pcDNA31P28(131_CMVF C A C C AG C T A C G C A T A AG G A T C C A C T AG T C C A G T G i G G T G G p28 Clusul Consensu.s

pc0NA31P28(131_BHGR pcDNAl1P28(13)_CMVF p28 Clusul Con .. nsu•

JN l•O I I I I I

A A T T C T G C A G A T A T C C A G C � C A G T G G C G A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G

Gambar 19. Hasil sekuensing plasmid pcDNA-P28(13)

Sisa ligasi kemudian ditransfonnasi ulang, kemudian dilakukan seleksi koloni

terhadap plasmid rekombinan yang dihasilkan. Verifikasi sekuensing tehadap plasmid

pcDNA3. J -P28(5) menunjukkan bahwa fragmen P28 telah berhasil diklona ke dalam plasmid

pcDNA3 . 1 ( +) (Garn bar 20).

� w m � � I · · · · I · · I · • · I · · · · I · · I · I · · I · · I

00 70

P,1(5),_CMVF A A OCT TA AOT 1 CCT QACCACCOCCAAGOACA AOAACCQOTGQOAGOACCCCCCCAACCT ('1" A CAA CGTGG

K L K F L 1 T A K D K N A W ! D P 0 K l V U V

pU · · · · · · AAOTTCCTOACCACCQCCAA00ACAA0AACC001000A00ACCCCGOCAAGCTQTACAACGTOG

� f l T T A K 0 K N R W E D P G K L Y N V

· · · · I · · · I - - - - I - - - - I - - I -!>29(�)..CMV,- ACOCCACCAOCT A COCA T AAGGA TCC

! A T S V A • G S -· AOOCCACCAQCTACOCATAAGQATCC

! A T S V A • 4 S

Garn bar 20. Hasil alignment pcDNA3. l P28(5)

V.10. Pengklonaan adjuvan gen VP22 ke dalam vektor plasmid pcDNA3.l(+)

DNA sisipan VP22 diamplifikasi dengan template gen sintetik VP22, DNA sisipan

kemudian direstriksi dengan enzim restriksi Hindlll dan BamHI (Garn bar 21)

bp

3000-

1000· soo-100·

•

bp

10000-

3()00-

1000-

500-

1.llO -

b

Ketennpn: M :MaibDNA 1 : -f'Cll VP'22 (1.17 bp) z : VP22 llunHl-Hindlll (117 bp)

Gambar 2 1 . DNA insert VP22 dan vektor pcDNA3.1 (+)

Hasil ligasi dari DNA vektor dan sisipan VP22 kemudian diseleksi dengan PCR ko]oni

menggunakan primer yang mengamplifikasi daerah Mutiple Cloning Sites (MCS) dari vektor

plasmid pcDNA3. l(+). Berdasarkan hasil seleksi PCR (Gambar 22), beberapa kJona yang

diperkirakan positif mengandung DNA sisipan Yn2 kemudian diverifikasi sekuensing

(Gambar 23).

bp

1000 500

100 -

Keteranpn:

bp

1-14 : plasmid reloombinan pcDNA 3.l-VP22 {388bp) M : Mam DNA Wt : plasmid wild-type (271 bp)

Garn bar 22. Has ii PCR sekuensing klona plasmid pcDNA3. l -VP22

pc0NA31VP22( 4 J_BHO R pe.ONAl1VP22(4)_CMVF VPMR ' Clusul Cons•n•u•

pcDNA31VP2:214)_8HOR pc0NA31VP22(4)_CMVI' VPMR Clu·:naf Con1o•n1u1

pcDNAJ1VP22(4)_8HOR pcDNA31VP22(4)_CMVF VPMR Clustal Con••n1ua

pcONA31VP22(4)_8HGR pcDNA.J1VP22f4l_CMVF

VPMR Ctust:al Con••nt.ut.

pc0NA31VP22(4)_8HGR pc:ONA31VP22(.&)_CMVIE VPMR Cluu�I Cona•n•u�

pc:.ONA31VP2'(4')_8HGR pcONA31VP22(4)_CMVF VPMR Clust.-1 Con$•ntus

.10 &O I J I l I I I G A G C T C T C T G G C T A O C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G O C T G A G C T C � C T O G C T A A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C � G O C l

:J ?.a :-o I I I I I I

T • T C G A A A T T A A T A C O A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A � O C T T A T C G A A A T T A a T A C O A C T C A C T a T A G G G A G A C C C A N G C T

Hindll oo 100 110 1.:v

I I I I I I I I G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C T TG A C G C T G C T A C A G C T A C G G C T O G C G T T T A a A C T T A A G C T TG • C G C T G C T A C A G C T A C

G � C O C T G C T A C A G C T A C '------' 1.H1 1.sO '::V 1H>·

l J I j $ ! 1 I A C G � G G T C G T T C T G C T � C T T C T A A O C C • A C T G A A C G 1 C C A • C G T G G T C G T T C T G C T G C T T C T A A A C C � A C T G A A C G , C C A A C G T O G T C G T T C T G C T G C T l C T A A A C C � A C T G A • C G T C C A

HUI :g..,. ;<.)1 I I I I r l J

C G T G C T C C � G C T C G T T c i o c T T C T C G T C C � C G T C G T C C � G C G � G C T C C � G C T C G T T C T G C T T C T C G T C C � C G T C G T C C A C C O T G C T C C A G C l C G T T C T G C T T C T C G T C C � C G T C G T C C � G

Bamff

T T G ;.. l T A A b � ... ,;:. T C �1 l C T � G T T G � � T � A b G A T C C A C T A N T T G . .1. A

Garn bar 23. Hasil sekuensing pcDNA3. l -VP22( 4)

5.7.Pengklonaan gen HA-HSNJ tanpa daerah traosmembran dan cytotoxic tail ke

daJam vektor plasmid pcDNA3-1(+)VP22 dan pcDNA3.1(+)Cd401

Tahap selanjutnya setelah semua gen berhasil dik.Jona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+)

adalah pembuatan vektor untuk fusi gen hemaglutinin dan adjuvan gen. Gen HA�TM dik.Jona

ke dalam vektor yang telah mengandung adjuvan gen, yaitu adjuvan gen CD40L, VP22, dan

P28.

DNA insert HALffM diamplifikasi menggunakan enzim TaqHifi polymerase, kemudian

diklona ke dalam pcDNA 3.l (+)CD40L. Fragmen HAf1TM basil PCR dipurifikasi,

kemudian direstriksi menggunakan enzim Nhel dan Hind/JI secara sekuensial. pcDNA3.1 (+)

yang telah mengandung fragmen CD40L digunakan sebagai vektor juga direstriksi dengan

enzim yang sama. Gambar 24 merupakan visualisasi hasil restriksi fragmen HA11TM dan

pcDNA3 . 1 CD40L

bp

6000 5000 3000

1000

-soo

bp

3000 1500 1200 1000

500

--

Agarosa 0,8 %, 100 V, 30 menit

Keterangan: M : marker

1 : pcDNA3.1(+) Cd401 uncur 2 : pcDNA3.1(+} Cd401- Nhel Hindi II

(6.210 bp}

Keterangan:

M : Marker

1 : HAllTM - Nhel Hindlll (1470 bp)

Gambar 24. Restriksi DNA insert HAf1TM dan vektor pcDNA3. I CD40_L dengan enzim Nhe 1 dan HindlII

Hasil digesti fragmen HALffM dan pcDNA. l CD40L dipurifikasi dengan low melting

agarose, selanjutnya diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase. Campuran reaksi ligasi

diinkubasi 16°C selama 1 6 jam. Kontrol ligasi yang digunakan yaitu campuran ligasi yang

hanya berisi vektor terlinearisasi, tanpa diberi DNA insert. Hasil ligasi selanjutnya

ditransformasi ke dalam set kompeten Escherichia coli TOP 10 dengan metode heat shock

Hasil koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR koloni dan dibuat replika koloni. Garn bar

25 merupakan visualisasi hasil PCR koloni pada agarosa 0,8%. Berdasarkan hasil PCR

koloni, terdapat 4 koloni dari total 8 koloni yang diverifikasi, mengindikasikan membawa

fragmen HAt1TM yaitu koloni no. 2,3,6, dan 7.

-

Agarosa 0,8%, lOOV, 30 men it

Ket er ,rng.rn: 1-8 : rekombinan pcDNA3.l(+)Cd401-HAbTM (2523 bp)

Wt : pcDNA3.l(+)Cd401 (1053 bp) M : marker

bp

3000

2500

1000

500

Gambar 25. PCR koloni plasmid rekombinan pcDNA3. l CD40L HA�TM

Koloni yang menunjukkan hasil positif pada PCR koloni kemudian diverifikasi

kembali dengan teknik digesti. Plasmid rekombinan dilinearisasi menggunakan enzim

HindIII untuk memastikan ukuran plasmid rekombfoan. Gambar 1 8 menunjukkan hasil

visualisasi verifikasi digesti plasmid · rekombinan pada gel agarosa 0,8%. Hasil linearisasi

plasmid rekombinan pcDNAJ.l(+)Cd401 HALffM koloni 2,3,6, dan· 7 menunjukkan pola

migras.i antara marka DNA 6.000 dan 7.000 bp. Sesuai dengan yang diharapkan yaitu

berukuran 7.680 bp, gabungan antara pcDNA3 . 1 CD40L (6.2 10 bp) dan .HA�TM (1 .470 bp).

bp

8000 6000 5000

3000

1000

soo

Ket er angan:

Agarosa 0,8%, lOOV, 30 m;.>nit

M : marker

Wt : pcDNA3. l(+)Cd401-HA6TM uncut

1-8 : linearisasi pcDNA3.l(+)Cd401-HA6TM dengan Hindlll (7.680 bp)

Garn bar 26. Linearisasi rekombinan pc DNA 3. l CD40L HA6 TM dengan

enzim HindIII

Analisis urutan basa nukleotida plasmid rekombinan pcDNA 3 . 1 CD40L HAlffM

dilakukan dengan metode sekuensing. Plasmid rekombinan pcDNA 3. CD40L HAO.TM no 2,

3, dan 7 disekuensing dengan primer CMVF. Hasil pensejajaran sebagian hasil sekuensing

menunjukkan bahwa gen HALffM telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3.1 (+)

Cd40l.

Plasmid pcDNA3.1 VP22 dan gen HALiTM hasil amplifikasi PCR direstriksi

menggunakan enzim restriksi Nhel dan HindlII. Gambar 27 merupakan visualisasi gel

agarosa 0,8% hasil restriksi DNA insert HALiTM dan vektor pcDNA3.1 VP22 menggunakan

enzim NheI dan HindllI.

bp bp

6000

5000

3000 3000

1500 - · 1200

1000 1000

500 500

Agarosa 0,8%, 100 V, 30 menit

Keterangan:

Wt : pcDNA3.l(+) wild eype Nhel Hindlll (5.428 bp)

: rekombinan pcDNA3.l(+)VP22-

N/Jel ·Hindlll (5.545 bp)

M : marka ONA

Keterangan:

M : Marka DNA

1 : H.-v.nr - Nhel Hindlll (1470 bp)

Gambar 27. Restriksi fragmen HALffM dan vektor pcDNA3. l VP22 menggunakan enzim

Nhel dan HindlII

Hasil digesti fragmen HALiTM dan pcDNA. 1 VP22 dipurifikasi dengan low melting

agarose, selanjutnya dil igasi menggunakan enzim T4 DNA ligase. Campuran reaksi ligasi

diinkubasi 16°C selama 16 jam. Kontrol ligasi yang digunakan yaitu campuran ligasi yang

hanya berisi vektor terlinearisasi, tanpa diberi DNA insert. Hasil ligasi selanjutnya

ditransformasi ke dalam sel kompeten Escherichia coli TOPI 0 dengan metode heat shock.

Hasil koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR koloni dan dibuat replika koloni. Gambar

28 merupakan visualisasi hasil PCR koloni pada agarosa 0,8%. Seleksi PCR koloni terhadap

1 1 klon plasmid pcDNA3. l VP22-HAlffM menunjukkan hanya terdapat 1 klon yang diduga

mengandung sisipan gen HAilTM.

Agarosa 0,8%; 100V; 30 menit

ll:eteninpn: 1-11 : plasmid relcombinanpcDNA 3.1-VP22HMTM (l.BS8bp) M : Marita DNA wt : plasmid wild-type (388 bp)

bp

- 3000

- 1000 - 500

Garn bar 28. PCR koloni pcDNA3.1 VP22 HA6TM

Koloni l yang menunjukkan basil positif pada PCR koloni kemudian diveriftkasi

kembali dengan teknik digesti menggunakan enzim NheI dan HindJ.11. Keberadaan DNA

insert HAilTM diketahui dari hasil digesti, yaitu hasil digesti menunjukkan terbentuknya 2

pita spesifik yang berukuran 5.545 hp yang merupakan vektor pcDNA3 . 1 VP22 dan pita

berukuran 1 .470 bp yang merupakan fragmen HAilTM (Garn bar 29).

6000

�888 1500 M88

500

--

pcON.0.3.1l •)VP22 15.S•S bp)

'------'

-- 1 HA�Tl\!(l 470bp) I

Agaros.;i 0,8 %, 100 V, 30 menit

Keterangan:

M : Marka ONA Wt : rekombinari pcDNA3.l{+)VP22 H.�.lff'.\l 1111c11r 1 : rekombinan pcDNA3.l(+)VP22 H.AllD-1 - Nhel Hindlll

Gambar 29. Verifikasi digesti rekombinan pcDNA3.1 VP22 HAilTM

Analisis urutan basa nukleotida plasmid rekombinan pcDNA 3.1 VP22 HA�1M

dilakukan dengan metode sekuensing. Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa fragmen

HA�TM telah berhasiJ diklona ke dalam plasmid pcDNA3.1 VP22.

6. KESIMPULAN

I . Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3. l P28

2. Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3. I HA�CTM

3. Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3.1 Cd401

4. Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3. l VP22

5. Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3.1 Cd401-HA�CTM

6. Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3.l VP22-HA�CTM

7. TARGET PENCAPAIAN TAHUN I

1 . Diperoleh _prediksi struktur sekunder dan tersier protein fusi

2. Diperoleh konstruksi dan ekspresi vaksin DNA, 56

3. Diperoleh konstruksi vektor dan ekspresi antigen rekombinan virus pada sistem ekspresi

prokariota

4. Diperoleh konstruksi vektor dan ekspresi VLP pada sistem ekspresi baculovirus

PERSETUJUAN ATASAN

Jakarta, 01 Februari 2013

MENYETUJUI :

Kepala Bidang Biomedis Ketua Pelaksa na

� dr. Roselinda, M. Epid

NIP. 19580701 1987012001 NIP. 19650409 199203 1 002

DISETUJUI,

Ketua Panitia Pembina llmiah

Dr.drg. Magdarina 0.A,MSc

NIP 195012061984022001 NIP 19621119 198803 1 001