1

BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Kromatografi gas (GC) merupakan salah satu teknik spektroskopi

yang menggunakan prinsip pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan migrasi komponen-komponen penyusunnya. Kromatografi gas

biasa digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat pada

campuran gas.

Kromatografi gas biasa digunakan untuk mengidentifikasi suatu

senyawa yang terdapat pada campuran gas dan juga mempunyai peranan

penting dalam mengestimasi konsentrasi suatu senyawa dalam fasa gas. Data-

data yang dihasilkan oleh detektor GC berupa kromatogram yang

pembacaannya memiliki fungsi tertentu tiap spesifikasinya.

Kromatografi gas dapat digunakan untuk menganalisis alkohol dan

obat-obatan terlarang dalam darah. Ketika minuman beralkohol dikonsumsi,

maka minuman tersebut turun melewati esofagus (kerongkongan) melalui

lambung dan menuju ke usus halus. Sejumlah kecil alkohol diserap melalui

aliran darah dalam membran mukus, dan sebagian besar memasuki aliran

darah melalui dinding usus halus. Alkohol larut dalam air dan aliran darah

dengan cepat menyalurkan etanol ke seluruh bagian tubuh dimana etanol

tersebut diserap ke dalam jaringan tubuh sesuai dengan proporsi kandungan

airnya.

B. PROBLEM STATEMENT

Dalam percobaan ini, sampel darah akan dianalisis dengan metoda

analisis GC/MS, yang akan menetapkan apakah terdapat alkohol dalam darah.

2

C. INFORMASI YANG DIBUTUHKAN

- GC/MS :

a. Dampak alkohol dan obat-obatan terlarang bagi kesehatan

b. Prinsip kerja GC/MS

c. Fungsi instrumen dari GC/MS

d. Bentuk metode analisis GC/MS

e. Syarat penggunaan analisis dengan metode GC/MS

f. Tahap-tahap rancangan penelitian dengan metode GC/MS

g. Parameter bebas alkohol dengan metode GC/MS

h. Parameter bebas obat-obatan terlarang

i. Metode lain yang dapat digunakan

j. Tingkat keakuratan metode GC/MS

k. Parameter dalam menggunakan GC/MS

l. Alasan penggunaan GC/MS dalam penentuan alkohol/obat terlarang

dalam darah

- HPLC :

a. Gambaran umum

b. Prinsip kerja

c. Penjelasan instrumen

d. Syarat penggunaan

e. Metode analisis

f. Kelebihan dan kekurangan

g. Penjelasan instrumen

- GC dengan Thermal Conductivity:

a. Gambaran umum

b. Prinsip kerja

c. Penjelasan instrumen

d. Syarat penggunaan

e. Metode analisis

f. Rumus-rumus dalam metode ini

3

BAB II

ISI

TUGAS 1:

Susunlah pertanyaan penting atau variable penelitian untuk merancang suatu

penelitian analisis alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah, paling

sedikit terdapat tujuh pertanyaan (metode penelitian menggunakan GC/MS).

1. Dampak alkohol dan obat-obatan terlarang bagi kesehatan?

Alkohol yang terkandung dalam minuman keras memang awalnya jika

hanya dikonsumsi sedikit tidak menimbulkan bahaya bagi kesehatan. Namun,

jika dikonsumsi berlebihan bahkan jika sudah kecanduan, tentu akan

menimbulkan efek negatif bagi tubuh manusia yang mengonsumsinya.

Berikut adalah gambar yang menunjukkan bahaya alkohol bagi tubuh

manusia.

Gambar 1. Bahaya Alkohol bagi Kesehatan Manusia

(Sumber: www.dampak-miras.com)

4

Selanjutnya, dampak obat-obatan terlarang terhadap kesehatan manusia adalah:

a. Gangguan pada jantung

b. Gangguan pada hemoprosik

c. Gangguan pada traktururinarius

d. Gangguan pada otak

e. Gangguan pada tulang

f. Gangguan pada pembuluh darah

g. Gangguan pada endorin

h. Gangguan pada kulit

i. Gangguan pada system syaraf

j. Gangguan pada paru-paru

k. Gangguan pada sistem pencernaan

l. Dapat terinfeksi penyakit menular berbahaya seperti HIV AIDS, Hepatitis,

Herpes, TBC, dan lain-lain.

2. Bagaimana prinsip kerja GC/MS?

GC-MS sesuai namanya terdiri dari kromatografi gas dan spectrometer

massa. Prinsip kerja GC-MS didasarkan pada perbedaan kepolaran dan massa

molekul (sifat kimia) sampel yang dapat diuapkan. Sampel yang berupa cairan

atau gas langsung diinjeksikan ke dalam injektor, jika sampel berbentuk

padatan maka harus dilarutkan pada pelarut yang dapat diuapkan. Aliran gas

yang mengalir (gas pembawa) akan membawa sampel yang sudah teruapkan

untuk masuk ke dalam kolom. Komponen-komponen yang ada pada sampel

akan dipisahkan berdasarkan partisi diantara fase gerak (gas pembawa) dan

fase diam (kolom). Molekul-molekul memerlukan jumlah waktu yang berbeda

(disebut waktu retensi) untuk keluar dari kromatografi gas. Kemudian,

molekul gas tersebut selanjutnya akan diionisasikan pada spectrometer massa

dan molekul gas itu akan mengalami fragmentasi yang berupa ion-ion positif.

Ion akan memiliki rasio yang spesifik antara massa dan muatannya sehingga

kemudian dapat diketahui dan diidentifikasi jenis dan berat molekul senyawa

tersebut.

5

3. Apa saja fungsi instrumen dari GC/MS?

Kromatografi Gas (GC)

o Injection port (tempat injeksi)

Dalam pemisahan dengan GC sampel harus dalam bentuk fase

uap. Sampel yang dapat diinjeksikan harus dalam bentuk gas atau cairan,

jika dalam bentuk padatan maka harus dilarutkan dahulu dalam larutan yang

bersifat volatile dan organik. Senyawa yang berbentuk cairan dan padatan

harus diuapkan terlebih dahulu. Penguapan ini terjadi di tempat injeksi.

Namun, suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab ada

kemungkinan akan terjadi penguraian sampel.

o Oven

Digunakan untuk memanaskan column pada temperatur tertentu

sehingga mempermudah proses pemisahan komponen sample. Biasanya oven

memiliki jangkauan suhu 30oC – 320

oC.

o Column (kolom)

Kolom merupakan komponen paling penting pada kromatografi

gas. Kolomberisi fasa diam, sedangkan fasa bergerak akan lewat didalamnya

sambil membawa sampel. Secara umum terdapat 2 jenis kolom, yaitu:

1) Packed column, umumnya terbuat dari kaca atau stainless steel coil dengan

panjang 1 – 5 m dan diameter kira-kira 5 mm.

2) Capillary column, umumnya terbuat dari purified silicate glass dengan

panjang 10-100 m dan diameter kira-kira 250 mm.

Beberapa jenis stationary phase(fasadiam) yang sering digunakan:

Polysiloxanes untuk sampelnonpolar.

Polyethylene glycol untuk sampelpolar.

Inorganic atau polymer packing untuk sampel bersifat small gaseous

species.

6

Gambar 2. Instrumen Kromatografi Gas

(Sumber: ashadisasongko.staff.ipb.ac.id)

Spektroskopi Massa (MS)

a. Sumber Ion

Setelah melewati rangkaian gas kromatografi, sampel gas yang akan

diuji dilanjutkan melalui rangkaian spektroskopi massa. Molekul-molekul

yang melewati sumber ion ini diserang oleh elektron, dan dipecah menjadi

ion-ion positifnya. Tahap ini sangatlah penting karena untuk melewati filter,

partikel-partikel sampel haruslah bermuatan. Ionisasi pada spektroskopi

massa yang terintegrasi dengan GC ada dua, yakni Electron Impact

ionization (EI) dan Chemical Ionization (CI). Pada EI molekul yang melalui

sumber ion diserang oleh elektron bebas yang akan menyebabkan molekul

terionisasi. Sedangkan pada CI digunakan reagen berupa metana atau

ammonia yang akan berinteraksi dengan molekul dan menyebabkannya

terionisasi.

b. Filter

Selama ion melalui rangkaian spekstroskopi massa, ion-ion ini

melalui rangkaian elektromagnetik yang menyaring ion berdasarkan

perbedaan massa. Para ilmuwan memisahkan komponen-komponen massa

untuk kemudian dipilih yang mana yang boleh melanjutkan yang mana yang

tidak (prinsip penyaringan). Filter ini terus menyaring ion-ion yang berasal

dari sumber ion untuk kemudian diteruskan ke detektor.

c. Detektor

7

Detektor terdiri atas High Energy Dynodes (HED) dan Electron

Multiplier (EM) detector. Ion positif menuju HED, menyebabkan elektron

terlepas. Elektron kemudian menuju kutub yang lebih positif, yakni ujung

tanduk EM. Ketika elektron menyinggung sisi EM, maka akan lebih banyak

lagi elektron yang terlepas, dan menyebabkan sebuah arus/aliran. Arus

tersebut yang kemudian akan dideteksi oleh detektor.

Gambar 3. Instrumen Spektroskopi Massa

(Sumber: www.gusnil45mind.wordpress.com)

Gambar 4. Instrumen GC/MS

(Sumber: en.wikipedia.org)

8

4. Bagaimana bentuk metode analisis GC/MS?

Pada metode analisis GC/MS adalah dengan membaca spektra yang

terdapat pada kedua metode yang digabung tersebut. Pada spektra GC jika

terdapat banyak puncak (peak) maka sampel tersebut mengandung banyak

senyawa. Berdasarkan data waktu retensi yang sudah diketahui dari literatur,

bisa diketahui senyawa apa saja yang ada dalam sampel.

Selanjutnya, setelah senyawa dianalisis dengan GC maka masuk ke

dalam instrument MS. Sampel yang masuk ke dalam MS sudah dalam bentuk

komponen tunggal masing-masing hasil pemisahan yang dilakukan GC.

Setelah itu, didapat hasil dari spektra MS yang berbeda dengan spektra GC.

Informasi yang diperoleh dari masing-masing spektra pada kedua

teknik ini akan mengidentifikasi senyawa yang terkandung dalam sampel.

Untuk spektra GC, informasi terpenting yang didapat adalah waktu retensi

untuk tiap-tiap senyawa dalam sampel. Sedangkan untuk spektra MS, bisa

diperoleh informasi mengenai massa molekul relatif dari senyawa sampel

tersebut.

5. Syarat penggunaan analisis dengan metode GC/MS?

Senyawa yang dianalisis harus bertekanan uap berkisar 10-10

torr.

Jika tekanan < 10-10

torr maka hanya senyawa turunan saja yang bisa

dianalisis.

Sampel harus dalam bentuk larutan agar bisa diinjeksikan ke dalam

kromatografi.

Jumlah sampel harus 1-100 pg per komponen.

Sampel harus mudah menguap.

Pelarut harus bersifat volatile dan organik (contoh: heksana atau

diklorometana)

6. Bagaimana tahap-tahap rancangan penelitian dengan metode GC/MS?

Tahap-tahap suatu rancangan penelitian GC/MS:

1. Preparasi sampel

2. Derivatisation

9

3. Injeksi

Menginjeksikan campuran larutan ke kolom GC lewat heated injection

port. GC/MS kurang cocok untuk analisa senyawa labil pada suhu tinggi

karena akan terdekomposisi pada awal pemisahan.

4. GC separation

Campuran dibawa gas pembawa (biasanya Helium) dengan laju alir

tertentu melewati kolom GC yang dipanaskan dalam pemanas. Kolom GC

memiliki cairan pelapis (fasa diam) yang inert.

5. MS detector

Aspek kualitatif : lebih dari 275.000 spektra massa dari senyawa yang

tidak diketahui dapat teridentifikasi dengan referensi komputerisasi.

Aspek kuantitatif : dengan membandingkan kurva standar dari senyawa

yang diketahui dapat diketahui kuantitas dari senyawa yang tidak

diketahui.

6. Scanning

Spektra massa dicatat secara regular dalam interval 0,5-1 detik selama

pemisahan GC dan disimpan dalam sistem instrumen data untuk

digunakan dalam analisis.

7. Parameter bebas alkohol dengan metode GC/MS?

Pada analisis alkohol dengan GC/MS pada darah, seseorang dikatakan

bebas alkohol bila dengan menggunakan analisis ini didapat hasil lebih kecil

dari 0,01 gram alkohol per 100 ml darah. Dan untuk sampel darah yang

diambil post-mortem dikatakan negatif (bebas alkohol) bila hasilnya lebih

kecil dari 0,02 gram alkohol per 100 ml darah.

8. Parameter bebas obat-obatan terlarang?

Berbeda dengan alkohol yang masih memiliki parameter, untuk obat-

obatan terlarang jika terdeteksi dalam darah maka tentunya orang tersebut

mengkonsumsi narkotika. Obat-obatan terlarang banyak jenisnya namun yang

paling umum atau sering digunakan adalah ganja, cocaine, heroin, morphine,

amphetamine, phencyclidine. Masing-masing obat tersebut memiliki

10

parameter aman sebagai berikut: cocaine (< 1 mg/L), heroin (< 0,1 mg/L),

morphine (< 0,2 mg/L), amphetamine (< 0.5 mg/L), dan phencyclidine (< 0.3

mg/L).

9. Apakah ada metode lain yang dapat digunakan?

Ya, ada untuk alkohol dapat dianalisis dengan analisis napas dan analisis

urine. Sedangkan, untuk obat-obatan terlarang dapat dianalisis dengan analisis

urine. Untuk analisis urine biasanya alat yang digunakan sama yaitu, GC/MS.

Dan untuk analisis napas ada alat tersendiri bernama Digital Alcohol Tester

(Alcohol Meter), hanya dengan menghembuskan nafas maka langsung muncul

di layar berapa kandungan alkoholnya.

10. Tingkat keakuratan metode GC/MS?

Analisis kandungan alkohol dan obat-obatan terlarang yang paling akurat

memang dengan metode GC/MS karena memiliki sifat sensitivitas yang tinggi

walaupun dalam sampel hanya terdapat dalam konsentrasi yang rendah. Dan

darah memang merupakan cairan tubuh yang lebih bagus dijadikan sampel

dibandingkan urine karena dalam urine alkohol dan obat-obatan terlarang

dapat hilang paling lama dalam dua hari. Selain itu, jika dengan analisis napas

juga kurang akurat karena sensitivitasnya lebih rendah daripada GC/MS.

TUGAS 2:

Bila anda hendak menggunakan GC/MS dalam analisis darah

1. Parameter apa saja yang harus diketahui?

Rasio partisi

Pada saat fasa bergerak mengalir sepanjang kolom terjadi kesetimbangan

dinamis antara komponen yang terlarut. Untuk zat terlarut spesies A,

kesetimbangan dinamis yang terlibat dapat dilihat pada persamaan dibawah

ini.

𝐴𝑏𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘 ⇌ 𝐴𝑑𝑖𝑎𝑚

Konstanta kesetimbangan untuk reaksi diatas adalah rasio partisi / koefisien

partisi, yang nilainya

11

𝐾 =𝑐𝑠

𝑐𝑚 …(1)

Dimana K = rasio partisi / koefisien partisi, cs= konsentrasi molar analitik

dari zat terlatur saat berada dalam fasa diam, dan cm= konsentrasi molar

analitik dari zat terlarut saat berada dalam fasa bergerak.

Idealnya rasio partisi konstan dalam jangkauan konsentrasi zat terlatur yang

bervariasi dan cs berbanding lurus dengan cm.

Waktu Retensi

Pada lampiran gambar 1 dapat dilihat sebuah kromatogram sederhana

yang memiliki 2 puncak. Puncak kecil yang berada di kiri merepresentasikan

spesies yang tidak ditahan oleh fasa diam. Waktu (tM) setelah injeksi sampel

sampai dengan munulnya puncak ini seringkali dinamakan waktu mati (dead

time). Waktu mati memberikan pengukuran dari laju migrasi rata-rata dari

fasa bergerak dan merupakan suatu parameter yang penting dalam

mengidentifiasi puncak analit. Seringkali suatu sampel akan mengandung

spesies yang tidak ditahan, jika mereka tidak memiliki spesies yang tidak

ditahan maka penambahan spesies dengan sifat seperti ini dapat dilakukan

untuk membantu identifikasi puncak.

Puncak lebih besar yang terdapat di bagian kanan lampiran gambar 1

merupakan puncak dari spesies analit. Waktu yang diperlukan puncak ini

untuk mencapai detektor atau waktu yang diperlukan spesies analit untuk

keluar dari kolom dan mencapai detektor dinamakan waktu retensi (tR). Laju

linear rata-rata dari migrasi zat terlarut (v) dan kecepatan linear rata-rata dari

spesies dalam fasa bergerak (u) diberikan pada persamaan dibawah ini:

𝑣 =𝐿

𝑡𝑅 …(2)

𝑢 =𝐿

𝑡𝑀 …(3)

Dimana L = panjang dari kolom

Nilai dari v juga dapat dinyatakan dalam u dan rasio partisi (K) dengan cara

mengekspresikan nilai laju v sebagai fraksi dari kecepatan pada fasa bergerak.

Penurunannya adalah sebagai berikut:

12

𝑣 = 𝑢 × 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑤𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑧𝑎𝑡 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑏𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘

𝑣 = 𝑢 ×𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎𝑕 𝑚𝑜𝑙 𝑧𝑎𝑡 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑏𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎𝑕 𝑚𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

𝑣 = 𝑢 ×𝑐𝑀𝑉𝑀

𝑐𝑀𝑉𝑀 + 𝑐𝑠𝑉𝑠= 𝑢 ×

1

1 + 𝑐𝑠𝑉𝑠 𝑐𝑀𝑉𝑀

𝑣 = 𝑢 ×1

1+𝐾𝑉𝑠 𝑉𝑀 …(4)

Dimana Vs = volume dari fasa diam dan VM = volume dari fasa bergerak.

Faktor kapasitas

Faktor kapasitas merupakan parameter eksperimental yang

menyatakan perbandingan mol komponen analit dalam fasa diam terhadap

mol komponen dalam fasa gerak, yang nilainya tergantung pada temperatur.

Faktor ini banyak digunakan untuk mendeskrispsikan laju migrasi zat terlarut

dalam kolom. Untuk spesies A nilai faktor kapasitasnya adalah sebagai

berikut. (dengan KA adalah nilai rasio partisi untuk spesies A)

𝑘′𝐴 =𝐾𝐴𝑉𝑠

𝑉𝑀 …(5)

Persamaan 5 dapat disubstitusi ke persamaan (4).

𝑣 = 𝑢 ×1

1+𝑘′𝐴 …(6)

Agar nilai k’A dapat dicari dalam kromatogram maka persamaan (2) dan (3)

dapat disubstitusi ke persamaan (6)

𝐿

𝑡𝑅=

𝐿

𝑡𝑀×

1

1+𝑘′𝐴 …(7)

𝑘′𝐴 =𝑡𝑅−𝑡𝑀

𝑡𝑀 …(8)

Besarnya faktor kapasitas menentukan laju elusi komponen. Jika k’ > 1 maka

elusi akan berlangsung dengan cepat dan jika k’ > 20-30 maka waktu elusi

akan berlangsung sangat panjang.

Faktor Selektivitas atau Pemisahan

Faktor Selektivitas adalah faktor yang menyatakan ukuran untuk

distribusi relatif komponen diantara fasa diam dan fasa gerak yang nilainya

tergantung pada temperatur. Faktor selektivitas disebut juga faktor pemisahan.

13

Faktor seletivitas untuk dua spesies A dan B dinyatakan dengan rumusan:

𝛼 =𝐾𝐵

𝐾𝐴=

𝑡𝑅2

𝑡𝑅1 …(9)

Untuk ilustrasi akan nilai tR2 dan tR1 yang lebih jelas dapat dilihat pada

lampiran gambar 2.

Jumlah dan Tinggi Plat Rata-Rata

Plat teoritik adalah istilah yang berasal dari teori destilasi yang

kemudian diadaptasi ke dalam kromatografi. Plat ini menandakan suatu titik

dalam kolom dimana terdapat kesetimbangan antara fasa cair dan gas (platnya

hanya imaginer). Jumlah plat teoritik (n) dapat diukur dengan menggunakan

rumus di bawah ini.

𝑛 = 16 𝑡𝑅

𝑊𝑏

2

…(10)

Dimana tR = waktu retensi dan Wb = lebar puncak pada pita elusi hasil

kromatografi. Ilustrasi yang dapat memperjelas nilai Wb dapat dilihat pada

lampiran gambar 3. Walaupun tR didefinisikan sebagai waktu, tetapi

sebenarnya kita dapat mengukur jarak pada kertas daftar perekam dalam cm

atau mm, perlu diingat bahwa tR dan Wb harus diukur dalam satuan yang

sama.

Tinggi plat teoritik disebut juga HETP (Height Equivalent Theoritical

Plate). HETP berfungsi untuk merepresentasikan efisiensi dari kolom. Nilai

HETP secara sederhana dapat dicari dengan menggunakan rumus dibawah ini.

𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝐻 = 𝐿

𝑛 …(11)

Dimana L = panjang kolom, dan n = jumlah plat teoritik. Semakin besar nilai

N maka semakin kecil nilai HETP dan semakin besar efisiensi kolom.

Resolusi Kolom

Resolusi kolom (Rs) dapat mengukur kemampuan kolom untuk memisahkan

dua analit secara kuantiitatif. Untuk lebih jelasnya dapat dituliskan dalam

persamaan berikut:

BA

ARBR

BA

SWW

tt

WW

ZR

22 …(12)

14

Dimana Z merupakan jarak puncak analit A dan B yang terbaca pada

kromatogram.

Resolusi kolom dapat dipengaruhi oleh faktor selektivitas, kapasitas sepasang

zat terlarut pada kolom yang dapat dilihat pada persamaan berikut:

B

BS

k

kNR

'1

'1

4

…(13)

Dimana adalah faktor selektivitas. Dari persamaan di atas dapat digunakan

juga untuk mencara jumlah piringan yang dibutuhkan untuk mencapai resolusi

kolom dengan nilai tertentu.

22

2

'

'1

116

B

BS

k

kRN

…(14)

Selain itu resolusi kolom dapat mempengaruhi retention time (tR), dan kita

dapat melihat hubungan keduanya sebagai berikut:

2

322

'

'1

1

16

B

BS

BRk

k

u

HRt

…(15)

2. Mengapa metoda GC/MS sering digunakan untuk penentuan kandungan

alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah?

Metode GC/MS memiliki beberapa keuntungan dibanding metode analisis

alkohol lainnya, yaitu :

Sangat akurat, spesifik dan sensitif dan merupakan prosedur standar untuk

analisis alkohol dan senyawa-senyawa volatil dalam bidang toksikologi

forensik. Akurat dan spesifik karena teknik ini menghasilkan molekular

fingerpint atau spektrum massa yang unik. Spektrum ini dapat digunakan

untuk mengidentifikasi ada/tidaknya alkohol dalam sampel. Sensitif karena

alkohol dalam darah dapat diketahui jumlahnya, walaupun dalam kuantitas

kecil.

Dengan menggunakan analisis darah GC/MS, sampel yang sama dapat diuji

beberapa kali, jika sampel dijaga dengan baik.

15

Waktu yang diperlukan cepat (penentuan alkohol dapat dilakukan dalam 6-8

menit) bila alat-alatnya dihangatkan secara teratur.

3. Dalam analisis komponen, dikenal juga metode HPLC. Apa yang anda

ketahui tentang alat tersebut?

a. Gambaran umum

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga

disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada

akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan

teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik

dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. Seperti teknik kromatografi pada

umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan

perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan

dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam

(stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa

sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam

tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita

akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta

tinggi puncak suatu senyawa.

b. Prinsip kerja

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam

sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa

konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya

hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC.

Yang pertama adalah proses separasi atau pemisahan dan yang kedua adalah

proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam

keberhasilan proses analisa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, prinsip

kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali

dari komponen yang dipisahkan pada saat komponen tersebut dibawa oleh

fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya

16

perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang didasarkan

oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut antara

kedua fasa.

c. Penjelasan instrumen

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,

pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,

wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator

atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

Gambar 5. Instrumen HPLC

(Sumber: pubs.rsc.org)

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut

kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.

Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter

pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang

dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan

resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan

pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk

fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi

meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase

17

terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi

menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase

gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan

komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan

analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak

tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak

berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada

kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi

campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas

yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase

terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air

dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang

paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan

pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.

Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase

terbalik.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus

inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan

sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan

preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah

untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

18

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa

dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran

fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan

sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan

konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam

fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Gambar 6.

(a) Posisi pada saat memuat sampel, (b) Posisi pada saat menyuntik sampel

(Sumber: lansida.blogspot.com)

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam

untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor

mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,

yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

19

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan

fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika

yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.

Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus

silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan

menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan

bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus

fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling

banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang

lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika

aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang

tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu

retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang

digunakan.

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:

detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat

spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor

spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,

detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus

mempunyai karakteristik sebagai berikut:

20

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada

kadar yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

d. Syarat penggunaan

HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat

molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika

molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan

semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasikan secara

kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen

tersebut secara kuantitatif.

e. Metode analisis

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu

retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi

sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan

untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

4. Berdasarkan area kromatogram

5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

21

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.

Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis

komponen dalam sampel. Sampel yang mengandung banyak komponen didalamnya

akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak

saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan

perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan

tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke

HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

f. Kelebihan & kekurangan

HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan

fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika

dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:

Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran.

Mudah melaksanakannya.

Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi.

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis.

Dapat digunakan bermacam- macam detektor.

Kolom dapat digunakan kembali.

Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali

cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang

dianalisis.

Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas.

Banyak pilihan fasa geraknya cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1

jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk

analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit

bisa dicapai.

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana

interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi

dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

22

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa

gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan

yang diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam

HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari

bermacam-macam zat.

Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah

sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer

Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dan lain-lain, dapat juga digunakan dalam

HPLC.

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang

bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang

diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa

dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk

menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal

sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC

tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang

diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah

dikumpulkan setelah melewati detektor.

Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi

penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.

Hanya bisa digunakan untuk asam organik.

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient

elusi.

23

Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas.

TUGAS 3:

Bagaimana anda menentukan:

a. Konsentrasi senyawa etanol dalam sampel darah

Dalam pemicu kita mendapatkan data sebagai berikut:

Tabel Hasil Pengamatan

Volume Ethanol Volume n-

Propanol

Konsentrasi (ml/ml) Ethanol

dalam n-Propanol

0.1 1.9 5.26%

0.2 1.8 11.11%

0.3 1.7 17.65%

0.4 1.6 25%

0.5 1.5 33.33%

Dari data yang dimiliki kita dapat membuat kurva kalibrasi standar dengan tinggi

puncak etanol sebagai sumbu y dan konsentrasi etanol dalam n-propanol sebagai

sumbu x.

y = 3.75xR² = 1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

5.26 11.11 17.65 25 33.33

Kurva Kalibrasi Standar

24

Dari grafik di atas, diperoleh persamaan garis y = 3.75x. Untuk mengetahui

kandungan etanol dalam sampel darah yang mempunyai tinggi 12.5, digunakan

persamaan:

𝒚 = 𝟑.𝟕𝟓𝒙

Dimana y adalah tinggi puncak gelombang (mm) dan x adalah konsentrasi (%).

Maka: 𝑦 = 3.75𝑥

12.5 = 3.75𝑥

𝑥 = 3.33%

Sehingga diperoleh kandungan etanol dalam 2 ml sampel sebesar 3.33% atau sama

dengan 0.0666 ml. Maka kandungan senyawa etanol dalam 5𝜇𝑙 sampel darahadalah:

5𝑥10−3𝑚𝑙 𝑥 3.33% = 𝟏.𝟔𝟔𝟓 𝒙 𝟏𝟎−𝟒𝒎𝒍

b. Resolusi kolom (Rs) [tanpa satuan]

Data-data yang diketahui adalah sebagai berikut:

(tR)A = waktu retensi A = 2.4 menit

(tR)B = waktu retensi B = 7.2 menit

WA = lebar dasar puncak ke etanol = 1.45 menit

WB = lebar dasar puncak n-propanol = 3.65 menit

Persamaan yang digunakan untuk mencari Rs adalah sebagai berikut:

𝑅𝑆 = 2 ∆𝑧

𝑊𝐴 + 𝑊𝐵=

2 (𝑡𝑅 𝐴 − 𝑡𝑅 𝐵]

𝑊𝐴 + 𝑊𝐵……… (16)

𝑅𝑠 = 2[7.2 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 − 2,4 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡]

1.45 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 + 3.65 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

𝑅𝑠 = 9.6 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

5.1 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡= 1.88

Jadi, resolusi kolom (Rs) adalah 1.88.

25

c. Jumlah piringan rata-rata (N rata-rata)

Data-data yang diketahui adalah sebagai berikut:

(tR)A = waktu retensi A = 2.4 menit

(tR)B = waktu retensi B = 7.2 menit

WA = lebar dasar puncak ke etanol = 1.45 menit

WB = lebar dasar puncak n-propanol = 3.65 menit

Persamaan yang digunakan untuk menentukan nilai jumlah piringan (N) adalah

sebagai berikut:

𝑵 = 𝟏𝟔 𝒕𝑹

𝑾 2……… 17

Perhitungan jumlah piringan untuk etanol:

𝑁 = 16 𝑡𝑅

𝑊 2

𝑁 = 16 2.4 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

1.45 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 2

N = 43.833

Perhitungan jumlah piringan untuk n-propanol:

𝑁 = 16 𝑡𝑅

𝑊 2

𝑁 = 16 7.2 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

3.65 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 2

𝑁 = 65.258

Perhitungan jumlah piringan rata-rata:

𝑁𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 = 𝑁𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 + 𝑁𝑛−𝑝𝑟𝑜𝑝𝑎𝑛𝑜𝑙

2……… (18)

𝑁𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 =

43.833 +65.258

2

𝑁𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 = 53.045

Maka, jumlah piringan rata-rata (N rata-rata) adalah 53.045.

26

d. Tinggi piringan (H) dalam meter

Misalkan panjang kolom (L) adalah 100 cm. Maka tinggi piringan (H) adalah:

𝐻 =𝐿

𝑁=

100

53.045= 1.885 𝑐𝑚

Maka, tinggi piringan (H) adalah 1.885 cm

e. Panjang kolom jika resolusi kolom menjadi 1.5

Dari persamaan:

𝑁 = 16𝑅𝑠2

𝛼

𝛼−1 2

1+𝑘′𝐵

𝑘′𝐵 2

……… (19)

Diketahui bahwa dan k’B konstan dengan berubahnya N dan L, sehingga kita dapat

menuliskan persamaan menjadi:

(𝑅𝑠)1

(𝑅𝑠)2= 𝑁1

𝑁2

……… (20)

Memasukkan nilai (Rs)1 dan (Rs)2 masing-masing 1.885 cm dan 1.5 cm, sehingga

didapatkan N2 yaitu:

1.885 𝑐𝑚

1.5 𝑐𝑚= 53.045

𝑁2

𝑁2 = 33.59

Panjang kolom adalah:

𝐿 = 𝑁 𝑥 𝐻

𝐿 = 33.59 𝑥 1.885

𝐿 = 63.32 𝑐𝑚

Maka, panjang kolom jika resolusi diganti menjadi 1.5 adalah 63.32 cm.

f. Waktu elusi senyawa etanol dalam kolom yang telah diperpanjang

27

Dengan menggunakan persamaan (4) :

𝑁 = 16𝑅𝑠2

𝛼

𝛼−1 2

1+𝑘′𝐵

𝑘′𝐵 2

diketahui bahwa tR berbanding lurus dengan Rs2, maka dapat dituliskan persamaannya

menjadi:

𝑡𝑅𝐴 1

𝑡𝑅𝐴 2=

𝑅𝑆12

𝑅𝑆22 ……… (21)

Waktu elusi untuk kolom yang sudah diperpanjang adalah:

2.4 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

𝑡𝑅𝐴 2=

1.8852

1.52

𝑡𝑅𝐴 2 = 1.528 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 = 91.67 𝑑𝑒𝑡𝑖𝑘

Maka, waktu elusi untuk kolom yang sudah diperpanjang adalah 91.67 detik.

BAB III

PENUTUP

KESIMPULAN

Kromatografi gas (GC) merupakan salah satu teknik spektroskopi yang

menggunakan prinsip pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi

komponen-komponen penyusunnya. Kromatografi gas biasa digunakan untuk

mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat pada campuran gas. Kromatografi gas

dapat digunakan untuk menganalisis alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah

Pada kromatograf, jumlah peak (puncak) menunjukkan jumlah komponen

yang terdapat dalam cuplikan, sedang luas peak menunjukkan konsentrasi komponen.

Terdapat beberapa parameter yang digunakan dalam menganalisis suatu campuran

melalui metode kromatografi, diantaranya yaitu waktu retensi. Waktu retensi yaitu

28

lamanya cuplikan berada pada kolom kromatografi hingga cuplikan tersebut terelusi

dan terdeteksi oleh detektor dan dicatat oleh kromatograf dalam bentuk suatu puncak.

Berikutnya yaitu resolusi kolom, yaitug ukuran kuantitatif dari kolom yang

menunjukkan kemampuan kolom tersebut untuk memisahkan dua zat terlarut.

Analisis dalam kromatografi gas dapat bersifat analisis kualitatif maupun

kuantitatif. Analisis kualitatif berupa pengidentifikasian senyawa yang terkandung

dalam suatu campuran dengan menggunakan perbandingan waktu retensi antara analit

standar dengan sampel. Sedangkan analisis kuantitatif dapat diaplikasikan untuk

mengetahui nilai-nilai yang berhubungan dengan kromatogram. Nilai-nilai yang dapat

diketahui adalah resolusi kolom, konsentrasi sampel (dengan metode kurva kalibrasi),

efisiensi, dan lain-lain. Penggunaan Gas kromatografi dapat dipadukan dengan

spektroskopi massa guna memperoleh data yang lebih akurat dalam mengidentifikasi

senyawa gas.

DAFTAR PUSTAKA

Fowlis, Ian A.,1998. Gas Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning.

John Wiley & Sons Ltd: Chichester.

Khopkar, S.H. 1985. KonsepDasar Kimia Analitik. PenerbitUniversitas Indonesia

(UI-Press) : Indonesia

Pavia, Donald L., Gary M. Lampman, George S. Kritz, Randall G. Engel

(2006). Introduction to Organic Laboratory Techniques (4th Ed.). Thomson

Brooks/Cole. pp. 797–817.

Skoog, Douglas A., Donald M. West, F. James Holler. 1991. Fundamental of

Analytical Chemistry. Seventh Edition. New York: Saunders College

Publishing.

http://dedihumas.bnn.go.id/read/section/artikel/2014/03/20/957/dampak-langsung-

dan-tidak-langsung-penyalahgunaan-narkoba (diakses pada Minggu, 30

November 2014 pukul 15.28)