Bahan dan MetodeBahan:Warfarin, DMSO, asetonitril dan semua bahan kimia lainnya yang diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Tizoxanide dibeli dari Cayman Chemical (Tallinn, Estonia). HPLC nylon filter (0,45 mikron, 47 mm) dibeli dari Pall Life Science (Port Washington, NY). Plasma manusia dibeli dari Valley Biomedical (Winchester, VA). Amicon Centrifree YM-30 (MW cutoff 30,0000) perangkat penyaring sentrifugal diperoleh dari Millipore Corporation (Billerica, MA, USA).Kelompok PengujianPengujian dibagi menjadi dua tahap. Empat percobaan dilakukan untuk setiap kelompok penelitian. Pengujian tahap I untuk mengetahui nilai ikatan protein dasar dari warfarin. Senyawa tersebut dalam dosis tunggal. Pengujian tahap II dilakukan untuk menilai efek adanya tizoxanide pada ikatan protein warfarin. Warfarin dan tizoxanide diberikan dengan dosis yang sama. Tizoxanide dipilih berdasarkan potensinya untuk diberikan bersama warfarin dalam pengaturan klinis seperti profil ikatan protein. Data ikatan protein warfarin dari pengujian tahap I dibandingkan dengan nilai ikatan warfarin pada pengujian tahap II. Konsentrasi warfarin ditentukan dengan HPLC.Metode Analisis untuk WarfarinWarfarin diukur pada semua sampel dengan metode HPLC yang tervalidasi. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan kolom C18 (100 mm X 4,6 mm, 2.6, dan 100Ao) dengan filter pra-kolom. Kolom C18 suhunya dikontrol pada 30 oC. Pengukuran dilakukan dengan deteksi ultraviolet pada panjang gelombang 220 nm. Fase gerak terdiri dari 35% asetonitril dan 65% 10 mM bufer fosfat (KH2PO4, pH 6,5). Analisis dilakukan pada suhu ruang pada laju alir konstan 1,0 mL/menit menggunakan elusi isokratik. Enam mikroliter dari ultrafiltrasi yang dihasilkan diinjeksikan ke HPLC.Penilaian IkatanIkatan nonspesifik untuk perangkat ultrafiltrasi: Sebuah penelitian awal dilakukan untuk mengidentifikasi ikatan nonspesifik warfarin ke perangkat ultrafiltrasi. Larutan warfarin ditambahkan ke perangkat ultrafiltrasi (Amicon Centrifree Micropartition System). Sistem ini disentrifugasi selama 15 menit. Ultrafiltrasi tersebut diuji untuk menentukan ikatan warfarin pada sistem ultrafiltrasi. Sampel dianalisis dengan HPLC. Penelitian dilakukan dalam rangkap tiga.Penentuan Ikatan ProteinIkatan protein plasma dari warfarin dievaluasi dengan menggunakan ultrafiltrasi. Studi dilakukan pada suhu dan pH fisiologis. Aliquot dari plasma manusia ditempatkan pada tabung dan ditambahkan larutan stok warfarin untuk menghasilkan sampel dari berbagai konsentrasi (misalnya, 50, 75, dan 100 mg/ml). Tizoxanide (500 g/mL) ditambahkan hanya untuk studi interaksi (Tahap II). Sampel dapat dihomogenkan pada shaker bath (37 oC) selama 30 menit. Alikuot (1 ml) dari campuran plasma manusia warfarin ditambahkan ke Amicon Centrifree Micropartition System (MW cutoff 30,0000). Sistem ini disentrifugasi selama 15 menit @ 1500 gram. Pengujian ultrafiltrasi untuk menentukan konsentrasi warfarin bebas. Sampel dianalisis dengan HPLC. Semua percobaan dilakukan rangkap empat.Analisis DataFraksi tidak terikat (fu) dari warfarin dihitung sebagai rasio dari konsentrasi tidak terikat (ultrafiltrasi) dan konsentrasi plasma keseluruhan.

Dimana:fu: Fraksi tidak terikat (bebas)Cu: Konsentrasi tidak terikat (bebas) dari warfarinCt: Konsentrasi total warfarinAnalisis StatistikPerkiraan rata-rata dari parameter ikatan protein akan dibandingkan dengan menggunakan ANOVA. Dengan cara ini, perbedaan ikatan protein warfarin akan terdeteksi antara grup pengujian. Signifikansi statistik diambil sebagai p-value