III. DISOSIASI JARINGAN TESTIKULAR IKAN GURAMI

ABSTRAK

Disosiasi jaringan testikular untuk mendapatkan suspensi sel donor yang

mengandung populasi sel spermatogonia banyak dan viabilitas tinggi merupakan

teknik dasar yang menunjang keberhasilan transplantasi. Pada penelitian ini

dilakukan pengujian jenis larutan disosiasi dan lama inkubasi terhadap jumlah dan

viabilitas sel spermatogonia yang dihasilkan pascadisosiasi. Dua jenis larutan

disosiasi yang diuji, yaitu larutan A: tripsin 0,5% dalam PBS (phosphate buffered

solution) , dan larutan B dengan komposisi: tripsin 0,5%, dan DNase 10 unit/µL

dalam PBS dilengkapi dengan 1 mM CaCl2, 25 mM HEPES, dan 5% FBS (fetal

bovine serum). Lama inkubasi dalam larutan disosiasi adalah 1, 2, 3, 4, dan 5 jam.

Setiap perlakuan dilakukan 3 ulangan. Testis segar didisosiasi pada masing-

masing larutan hingga mendapatkan suspensi sel testikular. Jumlah sel

spermatogonia yang berdiameter >10 µm dihitung menggunakan hemositometer

dan viabilitas sel diidentifikasi menggunakan pewarna trypan blue; sel yang

hidup (viable) terlihat transparan, sedangkan yang mati berwarna biru. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa jumlah rata-rata sel spermatogonia hasil disosiasi

menggunakan larutan B lebih banyak (P<0,05) dibandingkan larutan A,

sedangkan viabilitas sel spermatogonia pada kedua jenis larutan tidak berbeda

(P>0,05). Lama waktu inkubasi tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah sel

(P>0,05), namun berbeda nyata terhadap viabilitas sel. Hasil uji lanjut

menunjukkan bahwa viabilitas sel hingga lama masa inkubasi 3 jam belum

berbeda nyata dengan lama inkubasi 1 dan 2 jam. Dengan demikian dapat

disimpulkan bahwa larutan disosiasi B lebih baik dari larutan A untuk disosiasi

jaringan testikular ikan gurami, dan masa inkubasi optimum dalam larutan B

adalah 3 jam.

Kata kunci: testis, spermatogonia, ikan gurami, disosiasi, viabilitas .

*) Bab ini telah dipublikasi dengan judul: Morphological characteristic of

spermatogonia dan testis dissociation : a preliminary study for the germ cell

transplantation in giant gourami (Osphronemus goramy), pada Indonesian

Aquaculture Journal 5(2):163-17.

26

III. THE DISSOCIATION OF TESTICULAR TISSUE ON

GIANT GOURAMI

ABSTRACT

Testis dissociation is the first necessary steps to obtain highly amount and

viable population of spermatogonia as donor cells for transplantation. This

research examined the effect of two methods of testis dissociations (i.e. medium

A contained 0.5% trypsin in PBS (phosphate buffered solution) and medium B

contained 0.5% trypsin and DNase 10 IU/µL in PBS complemented with 1 mM

CaCl2, 25 mM HEPES and 5% FBS (fetal bovine serum). We also determined the

optimum incubation time (1, 2, 3, 4 and 5 hours) in dissociation medium. Freshly

isolated testis of immature giant gouramy were minced in dissociation medium

and then incubated to get monodisperce cell suspension. Parameters observed

were the number and viability of spermatogonia (ø > 10 µm). The viability was

analyzed using trypan blue exclusion dye, a cell with blue color indicated a death

cell. The results showed that the average number of spermatogonia observed in

medium B was higher than in medium A (P<0.05), meanwhile the viability of

spermatogonia between medium A and B were not significantly different (P>0.05).

The viability of spermatogonia decreased by the increasing of duration time of

dissociation, however the amount of spermatogonia were not different

significantly by the increasing of duration time of incubation. Post hoc test

showed that until 3 hours incubation, the viability of spermatogonia did not

differed significantly with cell viability in 1 dan 2 hours incubation time. In

conclusion, application of dissociation medium B yielded higher number of

viable spermatogonia than dissociation medium A with 3 hours optimum

incubation time in medium B.

Key words: testis, spermatogonia, giant gourami, dissociation, viability.

PENDAHULUAN

Disosiasi merupakan teknik dasar yang menunjang keberhasilan tansplantasi

sel spermatogonia. Selama ini ketersediaan sel spermatogonia dalam jumlah dan

viabilitas tinggi adalah salah satu kendala dalam melakukan transplantasi sel

germinal spermatogonia. Semakin sedikit jumlah spermatogonia yang

terkandung dalam suspensi sel yang disuntikkan, maka peluang sel donor

terkolonisasi semakin kecil. Oleh karena itu, pengadaan sel donor yang kaya

spermatogonia merupakan langkah penting dalam melakukan transplantasi (Kim

et al. 2006, Shinohara & Brinster 2000).

27

Tahap pertama yang dilakukan untuk mendapatkan spermatogonia sebagai

sel donor adalah disosiasi jaringan gonad testis dengan tujuan memisahkan sel-sel

gamet dari bagian atau jaringan pengikat tempatnya melekat, dan menghilangkan

bagian-bagian yang nekrotik, pembuluh darah dan lemak yang menempel.

Jaringan dapat didisosiasi secara mekanik melalui proses pencacahan dan

pemipetan secara perlahan-lahan. Cara lain adalah secara enzimatik, yaitu dengan

menggunakan enzim-enzim tertentu seperti tripsin, kolagenase, elastase,

hyaluronidase, DNase, pronase atau variasi dari beberapa jenis enzim dalam

larutan dapar atau medium tertentu sampai diperoleh suspensi sel tunggal

(Worthington 2003). Selain bertujuan untuk mendapatkan suspensi sel testikular

yang tunggal, teknik disosiasi yang efektif seharusnya menghasilkan suspensi sel

yang memiliki viabilitas tinggi dan dapat meminimumkan terjadinya proses

agregasi sel kembali pascadisosiasi (Freshney 2005). Oleh karena itu berbagai

macam teknik disosiasi pada hewan vertebrata dilakukan oleh para peneliti untuk

mendapatkan suspensi sel yang memiliki kriteria-kriteria tersebut, namun sedikit

sekali yang menjelaskan teknik disosiasi pada ikan.

Penelitian disosiasi jaringan testikular pada ikan masih sangat terbatas

(Takeuchi et al. 2003, Hong et al. 2004, Okutsu et al. 2006b, Lacerda et al. 2008).

Sementara itu, disosiasi jaringan dapat berbeda-beda pada setiap jenis hewan dan

jaringan karena setiap hewan atau jaringan memiliki karakteristik anatomi yang

berbeda-beda khususnya yang berkaitan dengan besarnya jaringan pengikat antar

tubulus pada testis dan kekuatan membran tunika yang membungkus testis (Kim

et al. 2006). Selain jenis dan asal jaringan yang digunakan, umur hewan, tipe

enzim, dan larutan dapar atau medium serta lama inkubasi jaringan dalam larutan

disosiasi juga menentukan efektivitas proses disosiasi (Worthington 2003). Oleh

karena itu, untuk mendapatkan suspensi sel spermatogonia ikan gurami yang

dapat digunakan sebagai sel donor, dibutuhkan uji coba metode disosiasi yang

tepat untuk jaringan gonad ikan gurami.

Pada penelitian ini diuji dua metode disosiasi enzimatik sel testikular ikan

gurami. Metode pertama merujuk pada Takeuchi et al. (2002) yang menggunakan

satu jenis enzim pengurai saja, yaitu tripsin. Metode disosiasi ini diterapkan pada

ikan rainbow trout. Metode kedua merujuk pada Takeuchi et al. (2009) yang

28

menggunakan dua enzim pengurai, yaitu tripsin dan DNase untuk mendapatkan

suspensi sel testikular tunggal dari jaringan testis ikan nibe. Tripsin dikenal

sebagai enzim pengurai yang kuat, sedangkan DNase merupakan enzim pengurai

yang lemah (Worthington 2003). Tripsin bertugas melepaskan matriks

ekstraseluler glikoprotein dari sel dan sekaligus menguraikan sisa-sisa matriks

yang terdapat dalam larutan disosiasi (Jones & Werb 1980). Sementara DNase

pada beberapa kasus ditambahkan ke dalam larutan disosiasi untuk menghindari

terjadinya penggumpalan sel akibat pelepasan DNA bebas dari sel-sel yang mati

selama proses disosiasi (Crabbe et al. 1997). Kombinasi dari kedua enzim ini

diharapkan juga dapat meningkatkan jumlah sel spermatogonia tunggal dalam

suspensi sel testikular yang dihasilkan pascadisosiasi.

Beberapa penelitian melaporkan bahwa dalam proses disosiasi jaringan,

enzim dapat menyebabkan efek kerusakan pada sel (Nicosia et al. 1975, Bellve et

al. 1977, Du et al. 2006). Lama waktu inkubasi dalam larutan disosiasi yang

mengandung enzim merupakan faktor yang penting diketahui dalam melakukan

disosiasi. Hal ini bertujuan untuk menghindari kerusakan pada sel-sel selama

proses disosiasi berlangsung. Oleh karena itu pada penelitian ini juga dilakukan

pengujian lama waktu inkubasi terhadap hasil disosiasi yang meliputi jumlah dan

viabilitas sel spermatogonia. Metode disosiasi dengan larutan disosiasi yang

tepat dan waktu inkubasi yang optimum diharapkan dapat menghasilkan suspensi

sel spermatogonia ikan gurami dalam jumlah dan viabilitas yang tinggi. Metode

disosiasi yang efektif akan memperbesar peluang keberhasilan transplantasi

spermatogonia pada ikan khususnya pada ikan gurami.

BAHAN DAN METODE

Gonad (testis) ikan gurami dengan bobot tubuh 700–900 g/ekor diisolasi

serta dibersihkan dari jaringan lemak dan pembuluh darah yang menempel dalam

larutan NaCl fisiologis lalu ditimbang beratnya. Selanjutnya gonad dipotong-

potong menjadi 5 bagian secara acak dengan kisaran bobot gonad per potong

sekitar 30 mg. Kelima potongan testis segar dicincang secara terpisah dengan

29

skapel atau gunting dalam 1 mL larutan disosiasi dan diinkubasi pada suhu ruang

masing-masing selama 1, 2, 3, 4 dan 5 jam.

Larutan disosiasi pertama terdiri atas larutan tripsin (Worthington) 0,5%

dalam Phosphate Buffered Saline/PBS (selanjutnya diberi nama larutan A) dan

larutan disosiasi kedua terdiri atas larutan tripsin 0,5% dan 30 µL DNase 10

IU/µL dalam larutan PBS yang telah ditambahkan 5% fetal bovine serum/FBS

(Sigma), 1 mM CaCl2 dan 25 mM HEPES (selanjutnya diberi nama larutan B).

Setiap 30 menit inkubasi, suspensi sel dipipet dengan perlahan-lahan agar

jaringan ikat cepat terlepas dari sel. Setelah masa inkubasi selesai, suspensi sel

hasil disosiasi disaring menggunakan nylon screen steril dengan ukuran 35 μm

untuk menghilangkan jaringan-jaringan yang tidak diinginkan. Untuk

menghilangkan aktivitas tripsin, suspensi sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali.

Percobaan ini diulang sebanyak tiga kali dengan rancangan acak lengkap faktorial

pada lima taraf lama waktu inkubasi.

Parameter yang diamati adalah jumlah dan viabilitas sel spermatogonia yang

berdiameter >10 µm atau sebesar satu skala pada pembesaran lensa objektif

mikroskop 10x. Sebanyak 10 µL suspensi sel hasil disosiasi diwarnai dengan

menggunakan pewarna vital trypan blue 0,4% (1:1). Sel yang mati akan terwarnai

oleh trypan blue sehingga terlihat berwarna biru, sedangkan yang hidup akan tetap

terlihat transparan. Jumlah total sel spermatogonia dan jumlah sel spermatogonia

yang mati dihitung menggunakan hemositometer di bawah mikroskop. Viabilitas

dihitung berdasarkan persentase jumlah sel spermatogonia yang hidup per jumlah

total sel spermatogonia.

Jumlah dan viabilitas sel spermatogonia pada setiap perlakuan dianalisis

dengan sidik ragam. Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Duncan multiple

range test (DMRT). Data diolah dengan menggunakan program SPSS 17.0 dan

MS Office Excell 2007.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada bab II dijelaskan bahwa tipe-tipe spermatogonia dapat diidentifikasi

berdasarkan karakter diameter sel. Hasil disosiasi jaringan testikular ikan gurami

pada Gambar 4A memperlihatkan morfologi berbagai tipe spermatogonia

30

berdasarkan perbedaan ukuran diameter sel. Sel punca spermatogonia (SSC)

adalah sel spermatogonia yang paling mudah dikenali karena memiliki ukuran

yang terbesar dengan membran sel yang lebih tipis dan transparan (Gambar 4B).

Sel spermatogonia lainnya hanya dapat dibedakan berdasarkan ukuran diameter

selnya. Dengan pewarnaan trypan blue, sel-sel yang mati tampak berwarna biru

(Gambar 4C), sedangkan sel-sel yang transparan adalah sel-sel testikular yang

masih hidup.

Gambar 4 Suspensi sel testikular ikan gurami pascadisosiasi. A. Tipe-tipe sel

spermatogonia. B. Sel punca spermatogonia dengan membran sel

yang tipis (kepala panah adalah membran sel). C. Sel yang mati

berwarna biru setelah pewarnaan dengan trypan blue. Skala 20 µm.

SSC = sel punca spermatogonia, SpA = spermatogonia A, SpT =

spermatogonia transisi, SpB = spermatogonia B.

Pengaruh Lama Waktu Inkubasi dan Jenis Larutan Disosiasi terhadap

Jumlah dan Viabilitas Sel Spermatogonia

Hasil disosiasi jaringan testikular ikan gurami memperlihatkan bahwa

jumlah sel rata-rata hasil disosiasi pada masing-masing larutan A dan B

bertambah sejalan dengan meningkatnya lama waktu inkubasi (Gambar 5A)

meskipun hasil analisis statistik RAL faktorial menunjukkan bahwa faktor waktu

inkubasi tidak pengaruh nyata terhadap jumlah sel (P>0,05) (Lampiran 3).

Peningkatan jumlah sel secara rata-rata seiring dengan meningkatnya lama waktu

inkubasi menunjukkan bahwa semakin lama jaringan diinkubasi dalam larutan

31

disosiasi, maka semakin banyak bagian dari jaringan ikat yang terdisosiasi oleh

proses enzimatik tripsin dan DNase sehingga jumlah sel spermatogonia tunggal

yang dapat diisolasi juga semakin banyak.

Sementara itu viabilitas sel rata-rata yang menggambarkan persentase

jumlah sel yang hidup mengalami penurunan yang nyata baik pada larutan A

maupun larutan B diakibatkan oleh semakin lamanya jaringan diinkubasi dalam

larutan disosiasi (Gambar 5B). Hasil analisis menunjukkan bahwa lama waktu

inkubasi berpengaruh nyata terhadap viabilitas sel (P<0,05). Semakin lama

jaringan diinkubasi baik dalam larutan disosiasi A maupun larutan disosiasi B

dapat menyebabkan semakin banyak sel yang mati atau rusak.

Gambar 5 Jumlah dan viabilitas sel spermatogonia ikan gurami pada larutan

disosiasi dan lama inkubasi berbeda. A. Jumlah sel spermatogonia

yang dihasilkan pada lama waktu inkubasi 1 hingga 5 jam dalam

larutan A dan larutan B. B. Viabilitas sel spermatogonia pada lama

inkubasi 1 hingga 5 jam dalam larutan A dan larutan B.

Larutan A ( ), Larutan B ( ).

Analisis pengaruh larutan disosiasi terhadap jumlah dan viabilitas sel

spermatogonia (Lampiran 3) menunjukkan bahwa perbedaan larutan disosiasi

yang digunakan berbeda nyata terhadap jumlah sel spermatogonia yang

dihasilkan (P<0,05) tetapi tidak berbeda nyata terhadap viabilitas sel

spermatogonia (P>0,05). Jumlah rata-rata sel spermatogonia yang dihasilkan oleh

larutan A adalah 27.489±11.062 sedangkan larutan B menghasilkan jumlah rata-

rata 55.318±29.304. Dengan demikian komposisi larutan disosiasi B memberikan

pengaruh yang lebih baik terhadap jumlah sel hasil disosiasi dibandingkan larutan

32

disosiasi A. Larutan disosiasi B yang mengandung dua enzim (tripsin dan DNase)

mampu menguraikan atau mendisosiasi jaringan testikular lebih banyak

dibandingkan larutan A yang hanya mengandung enzim tripsin.

Metode disosiasi jaringan testis bersifat spesifik spesies karena masing-

masing spesies memiliki karakteristik anatomi testis yang berbeda (Marret &

Durant 2000, Kim et al. 2006). Testis ikan terdiri atas 2 rongga yaitu tubular dan

intertubular. Rongga tubular terdiri atas epitel seminiferus, tempat menempelnya

sel germinal dalam sista dan sel-sel sertoli, tunika propria tersusun atas basal

lamina dan sel-sel peritubular myoid serta lumen yang berisi cairan yang

dikeluarkan oleh sel sertoli (Nobrega et al. 2009). Rongga intertubular terdiri atas

sel-sel Leydig, jaringan ikat dan pembuluh darah (Grier 1993, Pudney 1993).

Antar sel germinal terdapat juga jembatan sitoplasmik yang menghubungkan sel

germinal yang satu dengan yang lainnya (Loir et al. 1995). Anatomi dan ciri-ciri

fisik ini mungkin saja berbeda pada setiap jenis ikan sehingga metode disosiasi

enzimatik yang sama dapat memberikan hasil yang berbeda-beda.

Enzim tripsin dalam larutan A dan B berfungsi menghidrolisis protein-

protein yang menyusun jaringan ikat pada gonad menjadi ikatan-ikatan peptida

kecil atau asam-asam amino. Selama proses disosiasi berlangsung, jaringan ikat

dan jaringan interstisial antara tubulus maupun sista akan terurai oleh enzim.

Secara bersamaan sel-sel germinal terlepas dari sel sertoli dan jembatan

sitoplasmik menjadi melemah hingga akhirnya sel germinal akan terlepas sebagai

sel tunggal. Proses enzimatik ini digambarkan oleh Bellve et al. (1977) pada

disosiasi jaringan testikular tikus menggunakan enzim tripsin. Namun demikian,

proses enzimatik ini juga memungkinkan membran sel tercerna (Du et al. 2006),

sehingga semakin lama jaringan diinkubasi, maka sel-sel testikular yang telah

terpisah dari jaringan ikat tadi juga akan mengalami kerusakan membran sel.

Oleh karena itu semakin lama jaringan didisosiasi, jumlah sel yang mati semakin

bertambah atau dengan kata lain viabilitas sel semakin menurun.

Penambahan enzim DNase dalam larutan disosiasi B membantu proses

disosiasi jaringan. DNase adalah enzim hidrolisis yang berfungsi untuk digesti

asam-asam nukleat dengan cara menghidrolisis ikatan DNA ganda menjadi

ikatan-ikatan DNA tunggal. Disosiasi sel darah merah yang memiliki sitoskeleton

33

dengan protein membran periferal kompleks ketika ditambahkan DNase,

sitoskeleton menjadi terdisosiasi dan filamen aktin menjadi larut. DNase

mencegah terjadinya polimerisasi aktin (Sheetz 1979).

Hasil analisis menunjukkan bahwa jenis larutan disosiasi tidak memberikan

pengaruh nyata terhadap viabilitas sel (P>0,05). Viabilitas rata-rata yang tidak

berbeda nyata antara larutan A dan larutan B menunjukkan bahwa penggunaan

dua enzim dalam larutan B tidak mempengaruhi kemampuan atau daya tahan sel

spermatogonia selama proses disosiasi. Tripsin dikenal sebagai enzim pengurai

yang kuat namun DNase merupakan enzim pengurai yang lemah (Worthington

2003). Dengan tambahan senyawa komplemen seperti FBS, CaCl2 dan HEPES,

larutan B dapat mempertahankan daya hidup sel spermatogonia seperti halnya

pada larutan A yang hanya terdiri atas satu enzim saja.

Dalam aktivitas hidrolisisnya, DNase membutuhkan kondisi fisiologis

dimana Ca2+

dan Mg2+

tersedia dalam jumlah cukup. Penambahan CaCl2 pada

medium atau larutan disosiasi meningkatkan efisiensi DNase menguraikan

jaringan (Dwyer et al. 1999). Ion Ca2+

berfungsi mempertahankan integritas

membran plasma spermatogonia tikus sehingga viabilitas sel tetap tinggi selama

proses disosiasi berlangsung. Di samping itu, ion Ca2+

juga sangat dibutuhkan

untuk mempertahankan keseimbangan osmotik dan potensial membran sel

(Yazawa et al. 2007).

Penambahan serum berfungsi untuk menekan aktivitas tripsin dan

memberikan zat nutrisi yang dibutuhkan oleh sel selama proses disosiasi

berlangsung (Freshney 2005). Pemberian serum pada medium disosiasi biasanya

dilakukan untuk disosiasi yang menggunakan konsentrasi tripsin tinggi dan dalam

waktu inkubasi yang lama agar sel tetap kuat. Pemberian tripsin dengan

konsentrasi tinggi bertujuan agar penempelan antar sel tidak terjadi (Brown et al.

2007). Oleh karena itu meskipun aktivitas disosiasi tinggi disebabkan oleh

kedua enzim yang berperan dalam proses disosiasi tetapi viabilitas sel pada

larutan disosiasi B ini tetap tinggi. Serum juga bermanfaat untuk melindungi

medium dari efek toksisitas senyawa-senyawa tertentu pada media yang

digunakan (Mather & Roberts 1998).

34

Senyawa HEPES atau 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

umumnya digunakan sebagai komplemen medium sel-sel yang dikultur pada

udara terbuka atau tanpa menggunakan inkubator CO2. Dalam proses disosiasi sel,

HEPES berperan sebagai dapar dan menstabilkan pH dalam medium (Mather &

Roberts 1998).

Lama Waktu Inkubasi yang Optimum dalam Larutan Disosiasi A dan B

Secara umum kriteria lama waktu inkubasi yang optimum dalam disosiasi

sel adalah lama waktu inkubasi yang menghasilkan jumlah sel spermatogonia

yang terbanyak dengan viabilitas tertinggi. Viabilitas menggambarkan persentase

jumlah sel yang hidup. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa analisis

faktorial (Lampiran 3) menghasilkan lama waktu inkubasi yang hanya

berpengaruh nyata pada viabilitas sel spermatogonia (P<0,05), tidak berpengaruh

nyata terhadap jumlah sel (P>0,05). Jenis larutan disosiasi diketahui tidak

memiliki interaksi yang nyata dengan lama inkubasi (P>0,05). Hal ini

mempertegas pembahasan sebelumnya bahwa jenis larutan disosiasi yang berbeda

tidak memberikan pengaruh nyata terhadap viabilitas sel atau dengan kata lain

perbedaan viabilitas pada lama masa inkubasi berbeda tidak dipengaruhi oleh

jenis larutan. Dengan demikian faktor lama inkubasi terhadap viabilitas sel akan

memberikan pengaruh yang sama pada larutan A dan larutan B.

Hasil uji lanjut pengaruh lama waktu inkubasi terhadap viabilitas sel

menunjukkan bahwa viabilitas sel rata-rata dari larutan disosiasi A dan B jam ke

1 hingga jam ke 3 tidak berbeda nyata. Hal ini menunjukkan bahwa disosiasi

jaringan testikular baik dalam larutan A maupun larutan B dengan lama waktu

inkubasi satu hingga tiga jam belum menunjukkan penurunan viabilitas yang

nyata (Tabel 3). Penurunan viabilitas mulai terlihat nyata pada jam ke 4 dan

menurun drastis pada jam ke 5 inkubasi. Meskipun lama inkubasi tidak

berpengaruh nyata terhadap viabilitas namun jumlah sel rata-rata baik pada

larutan A maupun larutan B menunjukkan kenaikan dengan semakin

bertambahnya lama masa inkubasi. Dengan demikian lama waktu inkubasi yang

optimum adalah tiga jam karena waktu tiga jam inkubasi memberikan jumlah sel

spermatogonia hidup lebih banyak dari satu dan dua jam inkubasi.

35

Hasil analisis menunjukkan bahwa jumlah sel hasil disosiasi tidak berbeda

nyata dengan semakin lamanya jaringan diinkubasi. Hal ini diduga disebabkan

oleh adanya peran proses disosiasi secara mekanik yang terjadi selama proses

disosiasi berlangsung yaitu pemipetan larutan setiap 30 menit selama masa

inkubasi. Oleh karena itu proses penguraian jaringan testikular menjadi sel-sel

testikular tunggal tidak sepenuhnya disebabkan oleh disosiasi enzimatik.

Pada penelitian ini terdapat dua tahap disosiasi mekanik, yaitu 1) proses

eliminasi pembuluh darah dan jaringan-jaringan ikat lainnya pada testis

semaksimum mungkin dengan tujuan agar proses disosiasi berlangsung sama dan

tidak terkontaminasi oleh sel-sel darah, dan 2) proses pencacahan dan pemipetan

larutan setiap 30 menit selama masa inkubasi dengan tujuan untuk membantu sel

terpisah dari jaringan. Secara teknis, kedua proses mekanik ini dapat

mempengaruhi hasil disosiasi, baik dari jumlah maupun viabilitas sel sehingga

hasil penghitungan jumlah sel spermatogonia tidak memberikan perbedaan nyata

terhadap lama waktu inkubasi.

Tabel 3 Jumlah dan viabilitas rata-rata sel spermatogonia hasil disosiasi

jaringan testikular ikan gurami dalam larutan A dan B

Larutan

disosiasi

Waktu inkubasi

(jam)

Jumlah spermatogonia

(x103)/ mg testis

Viabilitas (%)

A 1 15.946 ± 3.475 100,00 ± 0,00 a

2 23.461 ± 6.807 98,15 ± 3,21

a

3 29.429 ± 15.390 97,32 ± 2,52

ab

4 31.654 ± 12.094 95,20 ± 0,94

bc

5 36.956 ± 4.978 94,15 ± 2,07

c

B 1 42.100 ± 38.822 100,00 ± 0,00

a

2 53.316 ± 33.713 100,00 ± 0,00

a

3 57.556 ± 35.026 97,51 ± 0,93

ab

4 60.667 ± 37.671 96,00 ± 1,75

bc

5 62.952 ± 17.757 91,81 ± 5,84

c

Larutan A: Tripsin dalam PBS. Larutan B: Tripsin dan DNase dalam PBS mengandung HEPES,

CaCl2 dan FBS.

Huruf superskrip yang berbeda setelah angka pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata

(P<0,05). Angka adalah rata-rata±SD, n=3.

Informasi lama waktu inkubasi yang optimum pada ikan khususnya teleostei

dan kaitannya dengan jumlah sel yang dihasilkan dan viabilitasnya setelah

disosiasi belum ada. Namun, umumnya para peneliti menggunakan lama waktu

36

inkubasi 2 jam dalam larutan disosiasi seperti pada ikan rainbow trout (Okutsu et

al. 2006b), ikan nila (Lacerda et al. 2008), dan ikan nibe (Takeuchi et al. 2009).

Pada ikan gurami dengan lama waktu disosiasi 3 jam, viabilitas sel spermatogonia

selama proses disosiasi belum berbeda dengan lama waktu inkubasi 1 dan 2 jam.

Hal ini menunjukkan bahwa daya tahan sel spermatogonia ikan gurami diduga

lebih kuat dibandingkan dengan ikan nila, rainbow trout dan ikan nibe.

KESIMPULAN

1. Larutan disosiasi yang mengandung tripsin-DNase memberikan hasil

disosiasi dengan jumlah sel spermatogonia yang lebih banyak dibandingkan

larutan disosiasi yang mengandung tripsin saja.

2. Waktu inkubasi yang optimum untuk disosiasi adalah 3 jam.