identifikasi spesies organisme
DESCRIPTION
MikroorganismeTRANSCRIPT
IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANI
SME SAMPEL
I. Tujuan
Mahasiswa dapat menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan,
dan uji biokimia yang telah didapat sebelumnya untuk menentukan
spesies kultur bakteri yang belum diketahui
II. Dasar teori
1
Dalam biologi, sistem tata nama binomial merupakan sistem
formal penamaan organisme yang dikenalkan oleh Carl Linnaeus,
maka sejak saat itu nama ilmiah suatu makhluk hidup terdiri atas dua
nama atau kata yaitu kata pertama menunjukan genus (penulisannya diawali
dengan huruf kapital) dan kata kedua menunjukan nama spesiesnya, misal
Staphylococcus epidermidis, nama Staphylococcus merupakan nama
genus, sedangkan epidermidis merupakan nama spesies. Spesies
berasal dari bahasa Latin “species” yang merupakan tingkatan dalam
taksonomi yang terkecil (tingkatan terendah dalam tingkat taksonomi),
biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup
maupun organisme yang fosil. (sumber dari: anonim. Binomial Nomenclatrure.
http://www.absolute astronomy.com /topics/Binomial_nomenclature).
Metode identifikasi dapat digunakan juga sampai mengetahui spesies
dari suatu bakteri. Penggunakan kunci dikotomi akan sangat
membantu praktikan sehingga tidak perlu melakukan semua uji untuk
dapat mengetahui spesies dari sampel bakteri yang tidak diketahui.
Dikotomi adalah pembagian organisme sesuai karakteristik yang
muncul pada suatu kelompok dan karakteristik tersebut tidak
ditemukan pada kelompok yang lain. Dikotomi sebagai bagian proses
identifikasi spesies (kunci dikotomi) merupakan sekelompok pertanyaan
berkesinambungan (“series of question”) dimana tiap lajur panah
merupakan set dari karakteristik organisme yang ujungnya atau akhir
menunjukkan pada spesies tertentu. (sumber dari: anonim. Dichotomy.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Dichotomy)
Identifikasi spesies mikroorganisme tidak seperti identifikasi
genus, dimana praktikan diharuskan mengkultur mikroorganisme pada
semua media uji. Pada identifikasi spesies, langkah awal yang
dilakukan adalah dengan pewarnaan gram dan dilanjutkan dengan uji
biokimia.
PEWARNAAN GRAM
2
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Pewarnaan gram bakteri berfungsi untuk mengetahui jenis gram
(positif yang ditandai dengan warna biru-ungu atau negatif yang
ditandai dengan warna merah) dan bentuk dari sel bakteri.
Gb 1. Perbedaan dinding sel bakteri Gram Positif dengan Gram
Negatif
Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis larutan atau reagen,
antara lain: kristal gentian violet (Gram I), iod (GramII), etanol 96%
(GramIII), dan safranin (Gram IV). (sumber dari: anonim. Gram staining.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Gram_staining).
Prinsip dasar dari metode pewarnaan gram adalah harus dilakukan
adalah fiksasi, fiksasi berfungsi untuk membunuh dan melekatkan
bakteri pada kaca objek sehingga pewarnaan dapat dilakukan dengan
baik. Setelah itu baru dilanjutkan dengan penambahan senyawa-
senyawa pewarna. Reagen pertama yang digunakan disebut warna
dasar yaitu karbol gentian violet. Pewarna ini akan menempel pada
lapisanpoeptidoglikan gram positif dan LPS pada gram negative.
3
Reagen kedua untuk memperkuat penempelan warna pada
membran sel bakteri yaitu pewarna lugol. Sedangkan raegen ke 3
yaitu etanol absolute digunakan untuk mencuci warna (decolorizing
agent). Lunturnya tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bakteri gram negative yang mempunyai LPS warnanya
akan luntur karena lemak larut dalam alkohol, dan sedangkan warna
pada dinding sel bakteri gram positif tidak luntur karena warna sudah
terikat pada dinding sel.
Dengan kata lain, pemberian etanol memiliki 2 fungsi yaitu pada
gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi
sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet
tidak dapat keluar dari sitoplasma. Sedangkan pada gram negatif
alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada
peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel
menjadi tidak berwarna. Reagen yang terakhir adalah warna
pembanding yaitu fuchsin, pewarna tandingan ini akan masuk ke
dinding sel bakteri gram negatif. Sehingga didapat perbedaan warna
antara gram negative dan gram positif dari warna yang terlihat.
Dari hasil yang didapat, bakteri dapat diamati bentuk , ukuran, dan
jenis gram bakteri. Berikut ini adalah skema dari pewarnaan gram.
Gb 2. Pewarnaan Gram Bakteri Gram Positif dan Negatif
4
Setelah pewarnaan gram selesai kita lakukan, kita lakukan
pengamatan di mikroskop untuk melihat bentuk dan jenis bakteri.
Bentuk bakteri sendiri ada bermacam-macam antara lain cocci (bulat),
bacilli (batang),vibrio (koma), coccobaccil, dan masih banyak lagi.
Dari berbagai bentuk tersebut, bentuk paling umum yang dimiliki oleh
sebagian besar bakteri adalah bentuk cocci dan bacilli.
Setelah kita mengetahui bentuk dan jenis gram bakteri (gram
positif atau negatif), kita dapat melakukan berbagai uji biokimia yang
jalurnya telah ditentukan berdasarkan kunci dikotomi. Kita ikuti uji
apa yang harus dilakukan setelah kita ketahui bentuk dan jenis
gramnya, tiap bakteri dengan bentuk dan jenis gram yang berbeda
akan melalui jalur uji yang berbeda.
Dari hasil uji tersebut kita bisa menentukan lagi uji apa yang harus
kita lakukan selanjutnya,hal itu terus kita lakukan hingga akhirnya kita
dapat menentukan spesies bakteri sampel kita. Berikut ini adalah
kunci dikotomi untuk penentuan spesies bakteri gram positif dan
negatif :
5
a. Indol
Media ini biasanya digunakan
dalam indetifikasi yang cepat. Hasil
uji indol yang diperoleh negatif
karena tidak terbentuk lapisan (cincin)
berwarna merah muda pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini
tidak membentuk indol dari tryptopan
sebagai sumber carbon, yang dapat
diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan
merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein,
sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh
mikroorganisme akibat penguraian protein(Anonim, 2008)
b. MR-VP
1. Uji MR
Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah
ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam
campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung
8
dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan
menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator
metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH seredndah itu maka
indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini
peragi asam campuran(Anonim, 2008)
2. Uji VP
Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada
medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir
fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin) (Anonim,
2008)
9
c. SIM
Hasil yang diperoleh pada uji ini
adalah positif, hal ini terlihat adanya
penyebaran yang berwarna putih seperti
akar disekitar inokulasi. Hal ini
menunjukan adanya pergerakan dari bakteri
yang diinokulasikan, yang berarti bahwa
bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga
terlihat ada warna hitam, yang berarti
bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit
(H2S) (Anonim, 2008)
10
d. Simmons Citrate
Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak
terjadinya perubahan warna. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim
sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam
sel(Anonim, 2008)
e. TSIA
· Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena
bakteri bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak
memfermentasi laktosa dan sukrosa(Anonim, 2008)
· Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan Co2
dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S
positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini
terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion
11
yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe++ yang
terdapat pada media dan menghasilkan endapan hitam(Anonim, 2008)
· Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini
menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Media ini biasanya
digunakan untuk membedakan Salmonella dan Shigella dengan bakteri
Gram negatif bentuk batang lainnya bedasarkan pola fermentasi penghasil
hydrogen sulfide. Untuk pengamatan pola-pola pengunaan karbohidrat.
TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa
0,1% dan phenol red sebagai indicator yang menyebabkan perubahan
warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga
mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S,
ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk
membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakterinya(Anonim, 2008)
f. Uji gula-gula(Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)
Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu
memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi
perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna
12
kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada
media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang
diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi
berbentuk gas(Anonim, 2008)
g. Uji Urease
Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang berperan dalam
proses perkecambahan. Enzim urease memiliki substrat spesifik yaitu urea.
Enzim ini dapat mengkatalis reaksi pemecahan urea yang bersifat patogen
dalam sel tumbuhan menjadi amonia dan CO2. Urease ditemukan terutama
dalam kuantitas besar pada jackbean dan kedelai juga terdapat pada
beberapa jaringan hewan dan pencernaan mikroorganisme. Urease
ditemukan pada berbagai macam organisme seperti bakteri, jamur dan
tumbuhan tingkat tinggi. Urease pada lingkungan berperan dalam jalur
sistem transportasi nitrogen.
(NH2)2CO urease
→
H 2 O CO2 + 2NH3
Reaksi enzimatis yang melibatkan enzim urease tergolong ke dalam
reaksi hidrolisa dimana aktivitasnya dipengaruhi oleh adanya air.
Uji urease atau uji hidrolisis urea digunakan untuk mengidentifikasi
kelompok Proteus dari patogen-patogen gram negatif lainnya. Salah satu
ciri khas Proteus ialah kemampuannya menghasilkan enzim urease yang
dapat melepaskan amoniak dari molekul urea. Ciri ini tidak dimiliki oleh
bakteri lain yang mungkin dikelirukan dengan Proteus.
Medium yang digunakan dalam uji ini adalah kaldu urea yang
merupakan larutan ekstrak khamir dan urea yang diberi larutan penyangga.
Medium tersebut juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Bila
mikroba yang diidentifikasi menghasilkan urease, maka amonia yang
13
dilepaskan ke dalam medium akan menaikan pH. Bila pH menjadi makin
tinggi maka merah fenol akan berubah warna dari kuning menjadi merah
keunguan (Hadioetomo, 1985).
h. Uji Reduksi Nitrat
Dalam keadaan kekurangan oksigen atau pada mikroorganisme yang
bersifat anaerob dan tidak memiliki enzim sitokrom oksidase (sitokrom
aa3), maka mikroorganisme akan menggunakan molekul bukan oksigen
sebagai akseptor elektron terakhir. Nitrat (NO3-) digunakan oleh
mikroorganisme tertentu sebagai akseptor elektron terakhir dengan cara
mereduksi nitrat menjadi nitrit (NO2-). Beberapa mikroorganisme
mereduksikan nitrit menjadi gas nitrogen (N2).
NO3- + 2e- + 2 H+ nitratase
→ NO2
- + H2O
2NO2- + 7e- + 8 H+ nitratase
→ N2(g) + 4 H2O
Kemampuan mereduksi nitrat dapat digunakan sebagai ciri dalam
identifikasi bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa mampu
menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir. E. coli
mereduksikan nitrat menjadi nitrit sedangkan P. aeruginosa mampu
mereduksikannnya lebih lanjut menjadi N2. Sebaliknya Straphylococcus
epidermis tidak dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron
terakhir.
14
Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam
kaldu nutrien yang mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung
Durham. Setelah masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung
Durham dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap
dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas N2
berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2 merupakan produk
respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam media dapat diuji dengan
penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin yang akan bereaksi dengan
nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah
atau merah muda (Lay, 1994).
i. Uji Katalase
Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2
dengan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-).
Kedua bahan ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan
kompenen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan
diri seperti dengan produksi O2 atau akan terbunuh.
Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis
superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase
yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida.Katalase adalah enzim yang
mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan
O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga
15
mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan
zat toksik tersebut.Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi
kelompok bakteri bentuk kokkus, dalam membedakan Staphylococcus dan
Streptococcus. Dimana kelompok streptococcus bersifat katalase negative
dan Staphylococcus bersifat katalase positif. Penentuan adanya katalase ini
terlihat dari pembentukan gelembung udara di sekitar koloni setelah
ditambahkan larutan H2O2 3%. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh
enzim terlihat sebagai berikut :
superoksida
2 O2 + 2H+ O2 + H2O2
Dismutase
Katalase
H2O2 H2O + ½ O2(gelembung udara)
Peroksidase
j. Uji Litmus Milk
Media yang dipakai dalam uji ini adalah litmus milk yaitu media
yang terdiri dari 2 komponen utama yaitu susu dan litmus. Litmus
milk adalah medium berbasis susu untuk membedakan spesies antar bakteri. Laktosa,
16
litmus dan kasein terkandung dalam medium yang dapat dimetabolisme oleh tipe
bakteri yang berbeda. Penambahan litmus lebih mengarah pada perubahan pH
berlaku sebagai oksidasi dan reduksi indikator. Tes sendiri menunjukan ketika
bakteri dapat menfermentasikan laktosa, mereduksi litmus, membentuk gas,
membentuk gumpalan atau memulai peptonisasi. Jadi uji ini bertujuan
untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan komponen-
komponen yang terdapat pada susu, misalnya laktosa, protein susu
(kasein), lacto-albumin, dan lactoglobulin.
Dan untuk mendeteksi perubahan digunakan indikator litmus.
Bakteri-bakteri yang mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon, berarti
mempunyai enzim galaktosidase yang dapat memecah molekul laktosa
menjadi glukosa. Proses berikutnya adalah fermentasi karbohirat yang
akan menghasilkan asam sebagai produk akhirnya. Oleh karena adanya
asam maka akan mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu
menjadi merah muda. Perubahan warna litmus ini akan terjadi disekitar pH
4.
Fermentasi biasanya diikuti juga dengan pembentukan gas. Gas
yang terbentuk umumnya adalah gas hidrogen dan gas karbondioksida.
Pembentukan gas ini dapat menyebabkan muncul retakan pada curd yang
terbentuk. Selain mendekteksi peristiwa diatas, uji litmus milk dapat
digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mereduksi litmus.
Litmus ini tereduksi akibat adanya peranan litmus sebagai akseptor
electron dalam proses metabolisme bakteri tersebut. Pereduksian litmus ini
akan mengubah warna media dari ungu menjadi putih susu. Aktivitas biokimia
bakteri dapat menghasilkan dua jenis curd, yaitu acid curd dan rennet curd
bergantung pada mekanisme pembentukannya.
Acid curd terbentuk karena adanya asam organik pada media dan
dapat menyebabkan presipitasi berupa calcium caseinate dari kasein susu
membentuk gumpalan yang tidak dapat larut. Gumpalan yang
terbentuk keras dan tidak dapat berpindah dari dinding tabung walaupun
tabung dimiringkan. Sedangkan rennet curd, diproduksi oleh beberapa
17
organisme yang mampu memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja
pada kasein dan membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion
kalsium akan diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk
gumpalan lembut dan bersifat semi-solid. Apabila tabung digoyangkan,
maka gumpalan akan ikut bergerak. Bagian lain dari susu yang dapat
digunakan adalah protein susu.
Beberapa bakteri dapat menghasilkan enzim proteolisis yang dapat
memecah protein menjadi asam amino dan hal itu dapat dilihat dari media
yang menjadi jernih kecoklatan. Proses pemecahan ini akan
mengakibatkan pelepasan amonia yang akan meningkatkan kebasaan dari
media. Naiknya nilai pH ini akan menimbulkan pita berwarna ungu tua
pada bagian atasmedia. Kegunaan lainnya, uji litmus milk juga dapat
digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mendegradasi kasein.
Degradasi dari kasein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek
ini diikuti dengan pelepasan produk akhir yang bersifat basa yang
mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu menjadi biru tua.
18
III. Alat dan Bahan
Alat :
Spiritus
Jarum Ose
Tabung Reaksi
Objek Glass
Beaker Glass
Erlenmeyer
Cawan Petri
Pengaduk
Bahan
Kultur
Kultur yang digunakan berupa bakteri yang diberi kode dan merupakan
kultur murni yang ditumbuhkan pada trypticase soy agar slant.
Media
Trypticase Soy Agar
(TSA)
Phenol red lactose
broths
Phenol red glucose
broths
Simmons citrate agar
SIM
Litmus Milk broth
NB-KNO3
Reagen
Crystal violet
Gram’s iodine
Ethanol 96%
Fuschin
Reagen Kovacs
Solution A dan B
Bubuk Zn
19
IV. Cara Kerja
Pewarnaan Gram
1. Menyiapkan kaca obyek bebas lemak, meneteskan NaCl pada kaca obyek lalu
dengan jarum ose bakteri diambil dari biakan padat dan diletakkan pada
tetesan NaCl. Lalu dibiarkan mengering diudara.
2. Setelah itu dilakukan fiksasi untuk melekatkan olesan bakteri pada kaca
obyek dengan cara melewatkan olesan yang telah kering di atas api spiritus
beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap atas).
3. Lalu olesan bakteri diberikan dengan beberapa tetes larutan karbol gentian
violet (gram I), lalu dibiarkan selama 3 menit dan dibilas dengan air.
4. Lalu olesan bakteri diberikan dengan larutan lugol (gram II) beberapa tetes,
lalu dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan air.
5. Setelah itu dicuci dengan larutan gram III (alkohol 96%) dengan
memiringkan preparat kemudian ditetesi pelan-pelan dengan gram III hingga
tidak ada pewarna yang terlunturkan dan dibilas dengan air.
6. Setelah itu preparat ditetesi dengan larutan fuchsin (gram IV) beberapa tetes.
Didiamkan selama 3 menit.
7. Preparat dibilas dengan air dan dikeringkan di udara atau dengan menyerap
kelebihan air dengan tissue.
8. Preparat dilihat di mikroskop dengan perbesaran 1000 X.
9. Mencatat warna dan morfologi sel bakteri
Uji Biokimia (Sesuaikan dengan Skema Identifikasi Spesies)
1. Menginokulasi sampel pada trypticase soy agar slant
2. Gunakan kultur yang didapat untuk berbagai uji biokimia.
Phenol Red Laktose Broth
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.
Phenol Red Glucose Broth
20
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.
SIM Agar Deep Tube
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media padat dengan menusukkan ose dan diinkubasi pada suhu
37ºC selama 24-27 jam.
o Setelah itu ditambahkan reagen Kovac’s beberapa tetes dan
diamati.
NB-KNO3
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.
o Tambahkan solution A dan B beberapa tetes dan amati. Bila
media tidak berubah warna menjadi merah, tambahkan serbuk
Zn dan amati.
Simmons Citrate Agar Slant
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media padat dengan menggores zig-zag pada permukaan media
dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.
Litmus Milk
Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam
pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.
21
VI. Pembahasan
Pada percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan spesies dari
masing-masing sampel yang didapatkan. Ada 2 sampel yang diuji.
Berikut pembahasan untuk masing-masing bakteri uji :
1. Bakteri A
Uji pertama untuk penentuan spesies adalah dengan
pewarnaan gram. Bakteri A setelah diuji pewarnaan gram,
menunjukkan hasil gram negatif. Gram negatif tampak dari warna
pink dan bentuk sel yang basil.
Setelah melalui tahap pewarnaan gram, pada tabel skema
identifikasi bahwa langkah pengidentifikasian yang selanjutnya
adalah pengulturan sampel pada lactose broth.
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa tidak terdapat
perubahan warna pada broth dan tidak terbentuk gelembung udara.
Uji ini menunjukkan bahwa bakteri sampel A tidak dapat
memfermentasikan laktosa sehingga sampel dinyatakan negatif
pada uji ini.
Untuk teknik identifikasi selanjutnya didasarkan pada
lactose broth negatif yang mengarah pada uji glukosa. Pada uji
glukosa ini, bakteri A dikulturkan pada broth yang mengandung
glukosa dan menunjukkan hasil yang negatif
Hasil uji glukosa menunjukkan hasil yang negatif,
selanjutnya, sesuai dengan tabel identifikasi yang ada, maka uji
dilanjutkan dengan uji reduksi nitrat. Uji nitrat dilakukan dengan
menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu nutrien yang
mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung Durham. Setelah
masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung Durham
dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap
dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas
25
N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2
merupakan produk respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam
media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin
yang akan bereaksi dengan nitrit yang menunjukkan perubahan
warna media menjadi merah atau merah muda. Sehingga dari Uji
tersebut dinyatakan positif.
Langkah identifikasi yang terakhir adalah dengan uji litmus
milk. Uji ini dilakukan dengan menginokulasi bakteri dalam media
litmus milk. Pada uji yang dilakukan ditunjukkan dengan
perubahan warna media menjadi ungu lebih muda dan terbentuk
rennert curd. Ini dikarenakan adanya perubahan pH yang terjadi
pada media dan curd terbentuk karena bakteri mampu
memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja pada kasein dan
membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion kalsium akan
diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan
lembut dan bersifat semi-solid. Selain itu curd yang terbentuk retak
karena produksi gas hidrogen dan karbondioksida.
Dari semua hasil pengujian yang dilakukan diatas, maka
dapat diketahui spesies bakteri bersangkutan. Berdasarkan skema
identifikasi spesies, dilihat dari jalur-jalur pengujian yang
dilakukan, dapat diketahui dan disimpulkan bahwa bakteri A
merupakan Pseudomonas Aeruginosa.
2. Bakteri B
Pengidentifikasian bakteri B diawali dengan pewarnaan
gram. Hasil dari pewarnaan gram menunjukkan apakah bakteri uji
termasuk dalam strain negatif ataupun positif. Dari hasil
percobaan, didapatkan bahwa bakteri B merupakan bakteri gram
negatif dengan bentuk sel basil. Hasil ditunjukkan oleh gambar
dibawah ini.
26
Uji yang dilakukan selanjutnya adalah uji lactose. Bakteri B
diinokulasikan dalam media phenol red lactose broth. Uji lactose
positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari
merah menjadi kuning yang menandakan terbentuknya gas, dan
terbentuk gelembung gas pada tabung Durham. Hasil dari uji
lactose ditunjukkan oleh gambar di bawah ini.
Langkah identifikasi dilanjutkan dengan uji indol pada
media SIM. Uji ini untuk mengetahui apakah bakteri dapat
mendegradasi triptofan dan membentuk indol. Setelah bakteri
diinokulasi pada media dan diinkubasi, perlu penambahan reagen
Kovac untuk mengetahui perubahan warna media menjadi merah
ataupun terbentuknya cicin merah. Bakteri B menunjukkan hasil
yang negatif untuk uji ini. Hasil ditunjukkan oleh gambar di bawah
ini.
Yang seharusnya hasil dari uji ini positif. Kesalahan ini
dapat disebabkan oleh SIM yang rusak karena yang digunakan
adalah SIM yang sudah cair yang seharusya menggunakan SIM
yang baik. Selain itu, faktor kurang lamanya waktu untuk inokulasi
dapat menjadi salah satu alasan hasil negatif. Karena inokulum
masih beradaptasi dengan media. Penyebab yang ketiga bisa karena
tidak ada inokulum yang tertanam pada media agar SIM karena
kesalahan dalam pengambilan inokulum.
Pengujian lebih lanjut dilakukan dengan uji citrate. Uji ini
dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri ini mempunyai enzim
sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam
sel produksi . Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai
dengan tidak terjadinya perubahan warna. Artinya asam dari
bakteri bersangkutan tinggi atau tidak.
Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan
spesies dari bakteri B. Berdasarkan skema identifikasi spesies,
27
VII. Kesimpulan
Spesies bakteri dapat dianalisa berdasarkan kekhasan morfologi
dan fisiologi. Kekhasan ini dapat dianalisa melalui uji pewarnaan
Gram (morfologi) dan uji Biokimia (fisiologi). Penentuan spesies
bakteri dilakukan dengan mengikuti alur skema identifikasi spesies.
Setiap melakukan 1 uji dan didapatkan hasilnya, langkah untuk
identifikasi berikutnya sesuai dengan yang tertera pada skema sampai
mendapatkan spesies dari bakteri uji.
Hasil analisa menunjukkan bahwa bakteri A adalah, bakteri B
adalah Escherichia coli.
VIII. Daftar Pustaka
Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of
Biotechnology. 4: 125–1529.
Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor &
Francis Group, LLC.
Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw
Hill Book Company, Inc.
Poedjiadi A. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Penerbit Universitas
Indonesia.
Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of
themicrobial α-Amylase family. African Journal of
Biotechnology. 2: 645–648.
Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher.
Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown
Publication.
29
LAMPIRAN
Lampiran 1 (Hasil Pewarnaan Gram)
Gambar 1.1Bakteri A
Gambar 1.2Bakteri B
Lampiran 2 (Hasil Uji Biokimia)
Hasil Sampel A Hasil Sampel B
Gambar 2.1aMedia Phenol Red Lactose Broth
Gambar 2.1bMedia Phenol Red Lactose Broth
30