HPLC II

Indah Solihah

2 HPLC-2011

Teknik Elusi

Isokratik: - teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak tetap (polaritas tetap) selama proses

kromatografi berlangsung

Gradien: - teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)

selama proses kromatografi berlangsung

3 HPLC-2011

Teknik Isokratik

4 HPLC-2011

Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

5 HPLC-2011

30 % B

35 % B

6 HPLC-2011

Teknik Gradien

Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,

kemudian dilakukan

teknik elusi gradien

7 HPLC-2011

Hasilnya

8 HPLC-2011

Normal-Phase HPLC [ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

Senyawa polar:

- terelusi belakangan (tR panjang)

- semakin non-polar fase gerak,

tR senyawa polar makin panjang

Solven:

- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

Eluent strength:

- dimodifikasi dengan n-heksan

9 HPLC-2011

Reversed-Phase HPLC

Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu

Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar

lebih kuat tertahan

Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-

hidrofuran

Eluent strength:

- dimodifikasi dengan air (Kellner dkk., 1998)

Reversed-Phase HPLC [ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak metanol/air (70:30)

Nandrolone

Methyltestosterone

Detektor

Bagaimana

Memilih detektor

dan

Apa pertimbangannya

???

Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Detektor HPLC

Bulk property detector (BPD) :

- mengukur sifat solute dan fase gerak

contoh : detektor indeks bias ( RI )

Solute property detector (SPD) :

- hanya mengukur sifat solute

- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD

Contoh : detektor UV

Syarat Detektor :

• Cukup sensitif

• Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi

• Respon linear terhadap solut

• Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung flow rate (kec.alir)

• Mudah digunakan

• Tidak merusak sampel

Detektor UV

• Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut sedangkan sampel menyerap dengan kuat.

• Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan λ yg dapat diubah-ubah antara 200-700 nm

• Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar

• Detektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor

Kromofor UV-HPLC

Kromofor UV-HPLC

Detektor UV

Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan

minimal nilai senyawa harus ≥ 10 M-1. cm-1 pada ≥ 185 nm.

Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-

UV diperlukan minimal nilai senyawa harus ≥ 1000 M-1. cm-1

Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV,

senyawa dengan nilai senyawa 100 M-1. cm-1 tidak mungkin dilakukan

UV / Visible detector

Advantages

• High sensitivity & small sample volume required

• Can be used with gradient elution

• Is relatively cheap and not sensitive to temperature

• Sensitive to large number of organic compounds

Disadvantages

• Does not work with compounds that do not absorb light at this wavelength region

• Cannot be used with the solvents having large absorption in the UV region

• Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region

21

Detektor PDA

• Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yg berbeda dlm sekali proses (single run)

• Pada kromatogram dapat pula ditampilkan spektrum UV shg dpt digunakan untuk memilih λmaks utk sistem HPLC

• Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi, panjang gelombang, dan waktu)

Detektor Fluoresensi

• Merupakan detektor yg paling peka, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karena itu kadang2 solut diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi

26 HPLC-2011

Detektor UV vs Fluorescen

UV

Fluorescen

27 HPLC-2011

Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescensi

Fluorescene detection

• Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels (trace level analysis)

• Fluorescence detectors sense only those substances that fluoresce

excitation

Mobile phase

emission

basic principles of HPLC - 1 suwedo hadiwiyoto 28

HPLC-2011 29

Derivatisasi

Apa arti derivatisasi … ?

Apa tujuannya … ?

Bagaimana caranya … ?

Derivatisasi Post-/Pre-column … ?

30 HPLC-2011

Tujuan Derivatisasi

Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi)

Syarat reaksi derivatisasi

1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;

2. Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);

3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi;

4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.

32 HPLC-2011

Captopril

N

HS

COOH

CH3

O

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV ?

33 HPLC-2011

Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

Etilamin

Captopril p -Br fenacylbromide

N

HS

COOH

CH3

O

C-CH2-BrBr

O

+

34 HPLC-2011

Hasil derivatisasi :

Captopril + p -Br Fenacylbromide

N

HS CH3

O

Br

OO

C-O-CH2-C

Dapat dideteksi secara UV

35 HPLC-2011

Gabapentin

C

OH

O

H2N

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen ?

R-NH2

HPLC-2011 36

Derivatisasi dg Dansilklorid

Fluorescent derivative

+ R-NH2

O=S=O

Cl

N

CH3H3C

- HCl

O=S=O

NH

N

CH3H3C

R

Dansil klorid

Contoh Senyawa

Asli

Yang

Berfluorescensi

38 HPLC-2011

Kunang-kunang

39 HPLC-2011

Fluorescensi

Asam Salisilat

C

O

OH

OH

As.Salisilat - Fluorescensi

C

O

OH

OH

Papaverin HCl

N

CH2

OCH3

OCH3

H3CO

H3CO .HCl

Riboflavin

N

N

NH

N O

OH OH OH

CH2-CH-CH-CH-CH2OH

O

H3C

H3C

44 HPLC-2011

Detektor Indeks Bias

• Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda

• Detektor mengukur perbedaan antara indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya solut.

• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi bergradien karena indeks bias sistem berubah selama kromatografi

• Sangat sensitif terhadap perubahan suhu

Refractive index (RI) detection

• The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it

• The RI is a measure of molecule’s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell

• The amount of deflection is proportional to concentration

• The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive

basic principles of HPLC - 1 46

Detektor Elektrokimia

• Detektor ini menggunakan sifat redoks solut untuk mengukur kehadiran solut tersebut.

• Memiliki kepekaan yg tinggi

• Fase gerak harus polar dan mengandung elektrolit pendukung

Detektor Spektrometri Massa

• Untuk identifikasi senyawa murni

• GC-MS : terjadi pola fragmentasi

• LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi

• Data berupa berat molekul, terkadang ditambah berat molekul pelarut

49 HPLC-2011

Bentuk Kromatogram

Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:

- tailing, fronting (leading)

- asimetri, simetri

- pecah

- lainnya

Possible cause: Possible solution:

Dead volume in flow path

Check all fittings, especially post-column and at the column head

Mobile phase too weak

Remake mobile phase or increase acid concentration

Peak Tailing

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column

Dilute sample 1:10 and rerun or use a larger capicity column

Column is poorly packed

Run high organic through column, then equilibrate and retry, or replace column

Peak Fronting

HPLC-2011 51

Peak asymmetry - tailing

USP

HPLC-2011 52

Peak Asymmetry vs Tailing

Baca:

Snyder dkk., 1997

HPLC-2011 54

Kriteria Peak

55 HPLC-2011

Pengatasan Peak Tailing

Tambahkan 30 mM:

- Trietilamin (utk seny. basa)

- Amonium asetat (utk seny. asam)

Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:

10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-

amin asetat

Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja

TEA mencegah tailing ?

56 HPLC-2011

Tailing Senyawa Basa

Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam

kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat

dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati

kolom tersebut.

Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin

modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:

trietilamin [ TEA ].

TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga

saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi

ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat

memperkecil terjadinya tailing.

57 HPLC-2011

Penggunaan TEA

Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.

Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi

residu silanol pada kolom RP-18.

Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:

pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

fase gerak yang mengandung TEA

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column Dilute sample 1:10 and rerun

Retention time too long Modify gradient so that peaks elute earlier

Extra-column volume too large Reduce tubing diameters and lengths where possible, particularly post-column

"Dead" volume Check all connections for proper fit

Detector time too slow Increase detector Hz rate

Broad Peaks

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column Dilute sample 1:10 and rerun or use a higher capacity column

Sample volume too large Inject less than 1/6 of the column volume, or increase sample concentration

Dead volume in flow path Check all fittings, in particular post-column and at the column head

Problems internal to column Run high organic through column, equilibrate and retry, or replace column

Clogged sample filter Replace filter

Peak Doubling

Jenis-Jenis HPLC

Kromatografi Adsorpsi

• Pemisahan menggunakan fase normal

• Sering terjadi tailing

• Fase gerak dimodif dengan penambahan pelarut polar (air, metanol, etanol)

• Detektor UV lazim digunakan

Kromatografi Partisi

• Pemisahan menggunakan fase terbalik

• Pemisahan dilakukan untuk senyawa2 yg bersifat asam lemah atau basa lemah

• Fase gerak harus dijaga pH-nya dengan buffer agar analit tidak terionisasi

Kromatografi Penukar Ion

• Fase diam dapat menukar kation atau anion dg fase gerak

• Fase gerak mengandung air untuk proses ionisasi

• Retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak

Kromatografi Eksklusi Ukuran

• Prinsip pemisahan berdasarkan ukuran molekul fase gerak

• Digunakan untuk memisahkan senyawa dg BM>2000 dalton

• Fase diam berupa silika atau polimer yg bersifat porus