Tujuan

Mengklon gen apoptin di dalam bakteri Escheiricia coli untuk mempermudah proses pemurnian, ujung C-terminal apoptin ditambahkan 12 histidin dan untuk mempermudah penetrasisel ditambahkan 8 arginin pada N-terminal.

Teori Dasar• Kloning merupakan teknik menghasilkan individu-individu

dari jenis yang sama (populasi) yang identik secara genetik. Kloning ini hasil usaha-usaha yang dilakukan manusia untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau gen yang nantinya digunakan untuk kehidupan manusia, salah satunya pengobatan.

• Apoptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor secara terprogram. Apoptin mengakibatkan terjadinya apoptosis pada sel tumor. Apoptosis pada umumnya berlangsung seumur hidup dan bersifat menguntungkan bagi tubuh.

• Organisme yang dipilih untuk menjadi sel inang atau host adalah E. Coli.

Rancangan Kloing Gen Apoptin

CAVE.coliJM109

(Sumber gen apoptin)

isolasi DNA genomik

ekstrak DNA genomik

gen yang akan diklon(gen apoptin)

pemotongan menggunakan enzim resktriksi

fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran

fragmen yang membawa gen apoptin

isolasi plasmid pUC19

plasmid terpotong

ligasi fragmen-fragmen DNA genomik dengan DNA plasmid

plasmid sendiri (religasi)

DNA rekombinan tanpa gen apoptin

DNA rekombinan yang membawa

gen apoptin

chemnical transformation (Heat shock) transformasi sel inang (E.coli BL21(DE3)

sel inang utuh (non transforman)

sel inang dengan plasmid religasi

sel inang dengan DNA rekoombinan tanpa

gen apoptin

sel inang dengan DNA rekoombinan tanpa & dengan gen apoptin

seleksi untuk memilih sel inang dengan DNA rekombinan yang membawa gen apoptin

reisolasi DNA rekombinan

harvesting danpemurnian

Isolasi Gen Apoptin

Gen Apoptin (VP3) pada Chicken Anemia Virus (CAV)

Chicken Anemia Virus (CAV)

VP1

Protein untuk menyusun kapsid

VP2Protein yang memiliki spesifitas

terhadap fosfatase

VP3Protein apoptin yang mampu menginduksi apoptosis pada sel limosit pada ayam dan

beberapa jalur sel pada sel tumor. Tetapi tidak menginduksi lisis pada sel normal

CAV adalah virus DNA yang menyebabkan anemia dan atropi organ pada ayam

• VP3 adalah protein yang terdiri dari 121 asam amino, terutama dari prolin, serin, threonin dan asam amino dasar lainnya. Apoptin mengandung sinyal Bipartite-type nuclear (atau NLS1 dan NLS2) pada posisi 82-88 dan 111-121 atau pada ujung c-terminalnya. Selain itu, ada nuclear export signal (NES) yang menunjukkan adanya potensi perpindahan dari nukleus ke sitoplasma dan sebaliknya.

• Sel memicu apoptosis dengan cara intrinsik mitokondrial yang memerlukan caspase-3 (efektor, membelah berbagai substrat yang mati) dan caspase-9 (inisiator dalam proses kematian sel).

• Bentuk apoptin sangat stabil, multimerik aktif biologis terdiri dari 30-40 monomer dan nukleoprotein kompleks tingkat tinggi.

purifikasi DNA Chicken anemia virus dari kultur

1. Ekstraksi fenol-kloroform

Sampel dari jaringan hati kemudian dipanaskan pada suhu 650C selama 20

menit untuk mengurai jaringan-jaringan yang kompeks.

Menambahkan buffer phenol jenuh dengan volume yang sama seperti

sampel pada sampel dan mengocok sampel selama 3 menit

Penambahan fenol berfungsi untuk memisahkan fasa-fasa pada virus. Fasa organik akan terikat pada fenol dan kloroform. Fasa organik akan lebih berat dan mengikat protein-protein berat seperti kapsid yang menyusun virus. Kemudian komponen DNA akan terikat pada fasa cair yang lebih ringan. Fenol memiliki kelarutan yang buruk sehingga protein yang larut dalam fenol akan terpisah dari cairan.

purifikasi DNA Chicken anemia virus dari kultur

Penambahan etanol ditujukan untuk mengendapkan DNA. Karena DNA memiliki sifat yang sangat polar akibat muatan yang dimiliki struktur fosfatnya. Untuk itu, etanol yang memiliki sifat tidak polar dapat menyebabkan adanya atraksi elektrik antara gugus fosfat dan ion positif yang ada dalam larutan sampel sehingga membentuk ikatan ion dan mengendapkan DNA. Ion yang nantinya berikatan dengan DNA untuk diendapkan adalah ion natrium yang berasal dari Natrium asetat.

menambahkan NaAc 3M pada sampel sebanyak

1/10 dari volume sampel dan 100% EtOH sebanyak

2 kali volum sampel.

mengocok sampel selama beberapa detik, sampel didinginkan pada suhu -200C selama 30 menit.

sentrifugasi pada 14000 RPM selama 5 menit. jika

tidak terbentuk pelet pada sampel, lakukan ulang sentrifugasi selama 5

menit.

memisahkan pelet dari supernatan dengan pipet

secara perlahan-lahan

pelet dibiarkan kering sehingga tidak ada cairan

lagi didalam sampel.

Pelet disuspensikan didalam air. Sampel

tersebut mengandung DNA virus CAV yang murni untuk

kemudian dilakukan tahapan berikutnya.