PERBAIKAN SIFAT GENOTIPE TANAMAN MELALUI FUSI

PROTOPLAS

Oleh : Endeh Masnenah

Abstrak

Perbaikan sifat genetik suatu tanaman dapat dilakukan secara konvensional misalnya

dengan persilangan seksual atau secara inkonvensional, salah satunya dengan cara fusi

protoplas. Pemuliaan tanaman secara konvensional melalui persilangan seksual adakalanya

tidak dapat diaplikasikan karena kendala genetik seperti adanya inkompatibilitas seksual

antara tetua yang akan dipersilangkan atau adanya sterilitas pada salah satu tetua. Kasus

tersebut sering terjadi pada persilangan tanaman berkerabat jauh seperti persilangan antar

species (interspesifik) atau antar genus (intergenerik). Padahal sifat sifat genetik penting

seperti ketahanan terhadap hama, penyakit, nematoda,cekaman biotik maupun abiotik, dan

karakter penting lainnya, banyak terdapat pada spesies liarnya, sehingga untuk

memindahkan sifat sifat genetik penting tersebut kita harus melakukan persilangan

interspesifik atau bahkan intergenerik.

Aplikasi metode fusi protoplas atau hibridisasi somatik merupakan alternatif untuk

mengatasi masalah tersebut. Selain dapat mentransfer gen gen yang belum teridentifikasi,

fusi protoplas juga dapat memodifikasi dan memperbaiki sifat sifat yang diturunkan secara

poligenik . Fusi protoplas dapat memecahkan kendala genetik dalam sistem persilangan

secara seksual.

Fusi protoplas merupakan teknik penggabungan inti dan atau sitoplasma antara dua

genotipe yang berbeda secara in vitro untuk mendapatkan hibrida dengan sifat sifat yang

diinginkan. Fusi protoplas, memberi peluang produksi hibrida interspesifik maupun

intergenerik yang secara konvensional melalui persilangan seksual tidak bisa berlangsung.

Juga memberi peluang produksi galur heterozigot species sama, yang umumnya hanya bisa

dikembangkan melalui perbanyakan vegetatif,misalnya tanaman kentang dan tanaman

umbi lainnya.

Kata Kunci: Perbaikan sifat genotipe, Fusi Protoplas, Tanaman.

I. PENDAHULUAN

Pemuliaan tanaman secara konvensional telah menunjukkan kemajuan yang sangat

pesat untuk meningkatkan daya hasil tanaman. Akan tetapi, perbaikan sifat genetik

tanaman secara konvensional dengan cara persilangan seksual, adakalanya tidak dapat

diterapkan karena kendala genetik, seperti adanya inkompatibilitas seksual atau kondisi

fisiologis tanaman yang tidak memungkinkan terjadinya persilangan seperti fertilitas

polen yang rendah atau tidak bisa menghasilkan bunga (bersifat steril) .

Kendala genetik ini sering terjadi pada persilangan antara tanaman tanaman yang

berkerabat jauh, misalnya persilangan antar spesies (interspecific) atau antar genus dalam

satu famili (intergeneric). Sementara itu, beberapa sifat seperti sifat ketahanan terhadap

hama, penyakit, nematoda, atau ketahanan terhadap cekaman abiotik, biasanya terdapat

pada tanaman liarnya, sehingga untuk memindahkan sifat sifat tersebut ke tanaman

budidaya kita harus melakukan persilangan interspesifik atau bahkan mungkin

intergenerik.

Sebagai contoh: dalam budidaya tanaman jahe, salah satu kendalanya adalah

kepekaan tanaman terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh serangan bakteri

Ralstonia solanacearum, yang dapat menimbulkan kerugian hasil lebih dari 90 %. Upaya

yang paling efisien dalam mengatasi penyakit ini adalah dengan penggunaan varietas

resisten. Sementara itu, perakitan varietas resisten secara konvensional melalui cara

persilangan seksual terkendala oleh rendahnya fertilitas polen (kesuburan tepungsari) dan

adanya inkompatibilitas sendiri (self incompatibility). Oleh karena itu perlu diaplikasikan

metode inkonvensional misalnya dengan cara mutasi induksi, seleksi in vitro, produksi

tanaman haploid, penerapan metode transformasi genetik atau fusi protoplas sehingga

diperoleh variasi genetik baru sebagai bahan seleksi (Rostiana,O., 2006).

Penggunaan metode transformasi genetik merupakan cara yang ideal untuk

mentransfer gen yang diinginkan secara efisien tanpa ada hambatan seksual dan kedekatan

taksonomi. Tetapi penggunaan metode transformasi hanya dapat dilakukan pada sifat sifat

genetik yang disandi oleh gen tunggal. Beberapa sifat yang disandi oleh banyak gen

(poligenik) yang terletak di satu atau beberapa kromosom tanaman sulit untuk

diidentifikasi dan diisolasi, sehingga penggunaan metode transformasi menjadi sangat sulit

untuk diterapkan (Ramulu et al., 1995 dalam Purwito,1999); Millam et al., 1995).

Aplikasi metode fusi protoplas atau hibridisasi somatik dapat dijadikan alternatif

untuk mengatasi masalah tersebut. Selain dapat mentransfer gen gen yang belum

teridentifikasi, fusi protoplas juga dapat memodifikasi dan memperbaiki sifat sifat yang

diturunkan secara poligenik (Millam et al., 1995; Waara and Glimelius, 1995). Fusi

protoplas dimasa yang akan datang,menjadi tujuan utama manipulasi genetik, karena dapat

memecahkan hambatan genetik dalam sistem persilangan secara konvensional (Verma,N.,

et al.,2004).

Fusi protoplas merupakan teknik penggabungan inti dan atau sitoplasma dari

genotipe yang berbeda untuk meningkatkan keragaman genetik atau memperbaiki sifat

unggul tanaman yang diinginkan (Rostiana, O., 2006). Pada teknik fusi protoplas , dua

protoplas dengan genetik yang berbeda diisolasi dan difusikan dengan berbagai cara untuk

memperoleh protoplas hibrida. Fusi protoplas ini berguna untuk memproduksi hibrida

interspesifik atau bahkan intergenerik (Verma, N. et al.,2004).

Menurut Wattimena (1999), fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara

menggabungkan seluruh genom dari dua jenis protoplas dari kultivar yang berlainan

(intraspecific), atau antar species dalam genus yang sama (interspecific) , atau fusi antar

genus dalam satu famili (intergeneric).

Fusi protoplas antar kultivar yang berlainan (intraspecific) bertujuan untuk

meresintesis genotipe tetraploid dari galur tanaman dihaploid yang telah terseleksi

sehingga tanaman tetraploid hasil fusi mempunyai tingkat heterozigositas yang tinggi.

Penggunaan fusi protoplas memungkinkan produksi hibrida dengan heterozigositas yang

tinggi hanya dalam sekali langkah sehinga sangat efisien, walaupun keberhasilannya

sangat ditentukan oleh genotipe (Waara and Glimelius, 1995; Purwito, 1999).

Fusi protoplas antar species dalam satu genus (interspecific) bertujuan

mendapatkan sifat sifat tertentu, misalnya ketahanan ( resistensi) terhadap hama dan

penyakit. Untuk mendapatkan sifat sifat ketahanan juga dapat dilakukan dengan cara fusi

protoplas antar genus (intergeneric) (Purwito,1999).

Fusi protoplas dari genotipe yang berbeda dapat menghasilkan hibrida somatik

dengan tiga kategori yaitu,1.hibrida simetris dimana kedua inti dari dua tetua tergabung

secara sempurna 2.hibrida asimetris, dimana hanya sebagian saja inti dari salah satu tetua

bergabung dengan inti tetua lainnya.3. Cybrid ,yi dimana inti dari salah satu tetua

terakumulasi di dalam gabungan protoplas kedua tetua. Oleh karena itu, variasi

rekombinan sifat genetik di dalam tanaman hasil fusi akan sangat beragam dalam frekuensi

yang berbeda (Bhojwani and Razdan,1996 dalam Rostiana,O.,2006).

Fusi simetris dapat menghasilkan keragaman genetik yang tinggi yang berguna

dalam program pemuliaan tanaman, melalui beberapa kali silang balik (backcross),

dilanjutkan dengan seleksi, dapat dihasilkan kultivar baru (Mariska,I. et al., 2006).

Tanaman hasil fusi protoplas memiliki sifat sifat gabungan dari kedua tetuanya,,

termasuk sifat sifat yang tidak diinginkan yang berasal dari species liar. Untuk

menghilangkan sifat sifat yang tidak diinginkan pada tanaman hasil fusi biasanya

dilakukan dengan cara silang balik (backcross) dengan salah satu tetuanya.

II. PEMBAHASAN

Perbaikan sifat genotipe tanaman secara inkonvensional melalui kultur invitro

dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain peningkatan keragaman somaklonal,

penyelamatan embrio, kultur haploid, atau fusi protoplas (hibridisasi somatik).

Penggunaan teknik fusi protoplas atau hibridisasi somatik merupakan salah satu

aplikasi bioteknologi yang menjanjikan. Teknik hibridisasi somatik dapat mentransfer sifat

monogenik dan poligenik antar galur atau antar species dan dapat mengatasi hambatan

inkompatibilitas seksual (Millam et al.,1996 ; Purwito,1999). Kendala genetik seperti

inkompatibilitas seksual atau fertilitas polen yang rendah atau sterilitas sering terjadi pada

persilangan antara genotipe genotipe tanaman yang berkerabat jauh, yang tidak dapat

diatasi dengan metode konvensional dengan persilangan seksual. Fusi protoplas dapat

digunakan untuk mengatasi hambatan dalam persilangan tersebut.

Penelitian fusi protoplas telah menghasilkan hibrida somatik yang menunjukkan

peningkatan pada potensi genetik tanaman. Beberapa penelitian fusi protoplas telah

menghasilkan keragaman genetik tanaman, produktivitas tinggi , perbaikan sifat

ketahanan terhadap hama, penyakit, dan nematoda, serta perbaikan sifat-sifat kualitatif

seperti kandungan minyak tinggi (Mariska,I.et al, 2006).

Fusi protoplas untuk perbaikan sifat ketahanan terhadap penyakit, telah dilakukan

pada tanaman kentang (Solanum tuberosum L.). Pada tanaman kentang, sifat ketahanan

banyak terdapat pada spesies diploid, misalnya, Solanum phureja (resistensi PVY dan layu

bakteri), S.breviden (resisten terhadap PLRV), S.demissum (resisten terhadap phythophtora

infestan), S. etuberosum (resisten terhadap frost), S. pennellii (resisten terhadap

Alternaria), S.berthaultii (resisten terhadap serangga) dan S.balbocastanum (resisten

terhadap nematoda) (Purwito,1999).

Untuk mendapatkan sifat ketahanan, telah dilakukan fusi antar genus (inter

generic), seperti antara kentang dengan genus lain dalam Solanaceae, misalnya untuk

mendapatkan ketahanan terhadap penyakit hawar daun, layu bakteri dan ketahanan

terhadap kekeringan dilakukan fusi antara kentang (Solanum tuberosum) dengan species

liar Lycopersicon pimpinellifolium ;S. khasianum dengan S. aculestissima ; S. khasianum

dengan S. laciniatum); S. melongena dengan S. Aethopicum ; S.khasianum dengan S.

mammosum ; serta S.tuberosum BF15 dengan S.stenotomum (Purwito,1999).

Fusi protoplas untuk mendapatkan ketahanan terhadap penyakit juga dilakukan

pada tanaman terung. Pada budidaya tanaman terung (Solanum melongena), masalah yang

sering dihadapi antara lain adalah serangan penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh

Ralstonia Solanacearum yang mengakibatkan kehilangan hasil 15-95% (Husni, A. et al,

2004). Penyakit ini memiliki kisaran inang yang luas, bukan hanya menyerang famili

Solanaceae , tetapi juga menjadi masalah serius dalam budidaya tanaman jahe dan

beberapa tanaman lainnya.

Pada tanaman terung sumber ketahanan (resistensi) terhadap penyakit layu bakteri

banyak ditemukan pada spesies liar antara lain pada takokak ( Solanum torvum) .

Pemindahan sifat ketahanan dari species liar ke dalam species terung budidaya secara

konvensional dengan persilangan seksual sering mengalami kegagalan akibat

inkompatibilitas atau dihasilkan hibrida yang steril . Salah satu cara untuk memindahkan

sifat genetik dari dua spesies yang berbeda tersebut adalah melalui fusi protoplas (Husni,

A. et al., 2004) .

Hibrida somatik tanaman terung yang dihasilkan dari fusi protoplas toleran

terhadap penyakit layu bakteri Ralstonia solanacearum, bahkan beberapa diantaranya lebih

tahan dibandingkan kerabat liarnya. Melalui silang balik (backcross) antara tanaman

dihaploid dengan terung dapat dihasilkan genotipe baru dengan morfologi, warna dan

struktur buah yang menyerupai tetua hibridanya (Mariska, I dan A. Husni., 2006). Dari

penelitian lain yang telah dilakukan, kultur protoplas dapat menghasilkan keragaman

yang tinggi baik dalam sifat sifat morfologi maupun resistensi terhadap phytophthora

infestans dan Alternaria solanii (Husni, A. et al., 2004) , juga telah diperoleh klon klon

yang tahan terhadap herbisida ( Evans and Sharp, 1986 dalam Husni, A. et al.,2004).

Walaupun penelitian fusi protoplas telah banyak dilakukan ,metode fusi protoplas yang

dapat berlaku umum pada genus Solanum belum ada, terutama antara S. melongena dan S.

torvum yang sering mengalami kegagalan dalam regenerasi membentuk hibrida baru

(Purwito, 1999).

Fusi protoplas untuk mendapatkan ketahanan terhadap nematoda telah dilakukan pada

tanaman nilam. Nilam (Pogostemon cablin) merupakan penghasil minyak atsiri yang

potensial untuk dikembangkan dan Indonesia merupakan pemasok utama di pasar dunia.

Tanaman nilam yang dibudidayakan di Indonesia bersifat steril atau tidak berbunga

sehingga sulit mendapatkan genotipe baru melalui persilangan seksual. Selain itu,

pengembangan nilam menghadapai masalah serangan nematoda pratylenchus brachyurus.

Sifat ketahanan terhadap nematoda tersebut terdapat pada nilam jawa (Girilaya) yang

produksi minyaknya rendah. Untuk mendapatkan sifat ketahanan tersebut maka dilakukan

fusi protoplas antara nilam jawa dan nilam aceh (budidaya) yang kadar minyaknya tinggi

(Mariska, I dan A. Husni, 2006).

Mekanisme ketahanan terhadap nematoda dapat terjadi secara fisik dan kimia. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa tanaman yang tahan terhadap nematoda mempunyai

kandungan fenol dan lignin yang lebih tinggi daripada tanaman yang rentan. Hal ini sesuai

dengan hasil penelitian pada pisang bahwa senyawa fenol dan lignin memiliki hubungan

yang sangat erat dengan ketahanan terhadap nematoda. Hasil fusi protoplas nilam Aceh

dan nilam jawa (girilaya) dapat meningkatkan kandungan fenol dan lignin pada beberapa

hibrida somatik seperti pada kerabat liarnya ( Mariska, I dan A. Husni 2006).

Dalam hal peningkatan keragaman genetik, fusi protoplas pada tanaman nilam

(Pogostemon,sp) menghasilkan keragaman genetik yang luas untuk karakter tinggi

tanaman, panjang cabang primer, jumlah dan panjang cabang sekunder, panjang dan lebar

daun, panjang tangkai daun, produksi terna basah dan kering ( Martono, B., 2009).

Menurut Bhojwani dan Razdan (1996) dalam Martono,B (2009) bahwa variasi

rekombinan karakter genetik di dalam tanaman hasil fusi akan sangat beragam dalam

frekuensi yang berbeda . Variasi (keragaman) hibrida somatik dapat merupakan hasil dari

satu atau ketiga mekanisme berikut:

1. Keragaman genetik akibat subkultur kalus yang dilakukan terus menerus yang

mengakibatkan suatu variasi somaklonal.

2. Ketidakstabilan dari kombinasi inti sel yang mengakibatkan hilangnya ekspresi

gen atau hilangnya bagian dari informasi genetik,

3. Terjadinya segregasi dari inti atau sitoplasma setelah fusi yang menghasilkan

kombinasi unik antara informasi genetik pada inti dan sitoplasma.

Beberapa penelitian tentang fusi protoplas lainnya misalnya pada tembakau, tomat,

timun, kacang panjang, slada, jamur,rumput laut,padi dan jahe. Pada tanaman padi telah

dilaporkan keberhasilan regenerasi tanaman hasil fusi protoplas interspesies antara padi

budidaya subspecies japonica dan beberapa spesies padi liar (Takamura et al.,1992;Yan et

al.,2004) dalam Sukmajaya et al.,2007).

Faktor faktor penting yang berpengaruh dalam hibridisasi somatik adalah sumber

protoplas yang dipergunakan, metode isolasi protoplas, jenis dan konsentrasi enzim yang

dipergunakan, parameter listrik pada saat fusi, dan media yang dipergunakan pada awal

kultur protoplas pasca fusi serta media regenerasi protoplas (Purwito, 1999).

A. Sumber protoplas

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplas bervariasi, umumnya

jaringan muda dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda seperti pucuk muda

(dari kecambah,bibit,plantlet). Protoplas dari jaringan tersebut dinding selnya masih

sederhana terdiri dari dinding sel primer (belum berlignin). Skema perlakuan untuk

mendapatkan protoplas dapat dilihat pada gambar 1.

Jaringan daun pada umur dan kondisi fisiologis optimal (tanaman muda)

ditumbuhkan dalam growth chamber pada lingkungan terkendali dan reproducible

Direndam dalam larutan ethanol 70 %(dalam waktu sangat singkat),sterilisasi

dengan 2.5% Na-hipokhlorida (15-30 menit)

Pencucian beberapa kali dengan air steril

Bahan jaringan dikeringkan diantara kertas tissue

Lapisan epidermis bawah dikupas dengan forsep untuk memudahkan penetrasi

Enzim atau bahan jaringan dipotong selebar 1-2 mm dan penetrasi enzim

dilakukan dalam vacuum

Dibuat suspense protoplas setelah inkubasi dengan enzim

Gambar 1. Teknik Perlakuan Jaringan untuk Mendapatkan Protoplas (Mantell et

al.,1985 dalam Soemartono et al.,1992)

B. Isolasi Protoplas

Protoplas adalah sel telanjang tanpa dinding yang hanya dilindungi oleh membrane

plasma. Menurut Suryowinoto (1996), isolasi protoplas yaitu teknik untuk menghasilkan

protoplas yang utuh dan viable dari jaringan tanaman hidup dengan cara menghilangkan

dinding selnya. Isolasi protoplas pertama kali dilakukan oleh Klercker, 1892 dari potongan

irisan umbi bawang yang terlebih dahulu diplasmolisa, kemudian dimasukkan kedalam

media cair sehingga banyak protoplas yang meluncur kedalam medium (Bhojwani dan

Razdan,1983 dalam Suryowinoto, M. 1990).

Prosedur penyediaan protoplas dilakukan dengan menghilangkan dinding sel tanaman

tanpa banyak merusak protoplas dalam lingkungan osmotik yang menstabilkan membrane

protoplas. Protoplas dapat dilepaskan dari sel utuh, secara mekanik yaitu melalui proses

plasmolisis untuk melepaskan protoplas dari dinding sel, atau dengan cara hidrolisis

dinding sel dengan menggunakan enzim. Cara mekanik, hanya menghasilkan sedikit

protoplas yang viable (Soemartono, et al., 1992).

Banyak modifikasi teknik mendapatkan protoplas menggunakan macam macam

enzim untuk menghancurkan dinding sel secara lunak. Beberapa enzim patent yang

digunakan untuk memperoleh protoplas (Mantell et al,1985 dalam Soemartono, et

al.1992) sbb:1) Driselase (berasal dari Trichoderma viridis,kombinasi selulase +

pektinase); 2) Macerozyme (berasal dari Rhizopus spp, kombinase selulase + pektinase);3)

Pectolyase Y-23; 4) Onozuka R-10 ; 5) Meicelase; 6) Rhozyme; 7) Macerozyme R-10.

Enzim yang lebih banyak mengandung pektinase tanpa adanya garam,memberikan

protoplas lebih viable.

Protoplas dapat diisolasi dari hampir semua bagian tanaman seperti akar, daun, nodul ,

koleoptil, kultur kalus, dan daun invitro (Husni,A. et al., 2004). Pada isolasi protoplas

tanaman jeruk siam satsuma dan mandarin ternyata bahwa keberhasilan isolasi protoplas

sangat dipengaruhi oleh jenis, konsentrasi, dan kombinasi enzim yang digunakan

(Suryowinoto, 1990).

Demikian pula hasil penelitian Purwito (1999) ternyata bahwa pada isolasi protoplas

tanaman kentang, jenis dan konsentrasi enzim sangat menentukan banyaknya protoplas

yang dihasilkan, bahkan pada komposisi enzim yang sama menghasilkan protoplas dalam

jumlah yang berbeda akibat perbedaan genotipe tanaman. Umumnya tanaman yang

tumbuh vigor menghasilkan protoplas lebih banyak dibandingkan tanaman yang tumbuh

kurus (Purwito,1999).

Jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan dalam isolasi protoplas sangat bervariasi,

paling tidak ada 15 jenis enzim yang dapat dipergunakan, yang biasa digunakan adalah

pektinase, pektolyase, macerozim dan selulase. Pektinase, pektolyase, dan macerozim

berfungsi untuk melarutkan dinding primitive antar sel yang tersusun oleh zat pektin

sehingga menjadi sel sel tunggal, sedangkan selulase berfungsi melarutkan sisa dinding sel

yang tersusun atas zat selulosa (Suryowinoto, 1990). Jenis enzim dan lamanya

penghancuran dinding sel menentukan viabilitas protoplas (Puite,K.J.,1991).

Gambar 2. Skema Teknik Mendapatkan Protoplas (Mantell et al., 1985 dalam

Soemartono, et al. 1992)

C. Fusi Protoplas

Fusi protoplas dapat terjadi secara spontan dan dapat dengan cara induksi (buatan).

Fusi induksi dapat dilakukan dengan dua cara :

1) Metode fusi dengan cara kimia. Protoplas dengan sifat osmotik sama dapat dipacu

untuk melakukan fusi dibawah pengaruh senyawa garam seperti NaNo3. Cara ini

dapat menghasilkan 25% fusi protoplas. Senyawa lain misalnya polyvinil

Alkohol(PVA);dekstran ; polyethylene glycol (PEG) dengan media fusi yang

mengandung Ca++

dan pH tinggi (8-10). Hasil fusi sangat bervariasi dari 1-100 %,

tergantung operator dan bahan yang digunakan. (Puite,K.J.,1991; Soemartono et

al.,1992; Purwito, 1999).

Metode fusi dengan cara kimia, umumnya menggunakan enzim polyethylene glycol

(PEG) yang telah diaplikasikan secara luas (Puite,K.J.,1991). PEG berfungsi

sebagai bulking agent, yaitu sebagai jembatan antara protoplas yang mirip

fungsinya dengan plasmodesmata. Terjadinya fusi semakin besar pada saat proses

penghilangan PEG, yaitu pada saat pencucian. Keberhasilan fusi sangat dipengaruhi

oleh konsentrasi PEG dan jumlah kerapatan protoplas yang akan difusikan

(Puite,K.J.,1991; Purwito,1999). Keuntungan fusi protoplas dengan PEG antara lain

dapat dilakukan dengan peralatan sederhana.

Gambar 2.Hibridisasi Somatik antara Dua Species Tanama cara Elektrofusi

(Puite,K.J.,1991)

2) Metode fusi dengan cara elektrofusi , dilakukan dengan menggunakan aliran listrik

pada alat yang dilengkapi dengan generator AC dan DC. Generator AC berfungsi

untuk membuat protoplas berjajar, membentuk rantai lurus, selanjutnya pulsa DC

pada tegangan tertentu dapat menginduksi terjadinya fusi kru pulsa DC dapat

membuat celah yang dapat balik, sehingga protoplas dapat berfusi (Puite,K.J.,1991;

Purwito,1999).

D. Kultur protoplas dan Regenerasi Tunas

Keberhasilan kultur protoplas dan regenerasinya ditentukan oleh beberapa faktor,

seperti genotipe dan jaringan yang digunakan, fisiologi jaringan, jenis dan konsentrasi

enzim, masa inkubasi, media kultur, zat pengatur tumbuh, dan kondisi inkubasi (Bradsan

and Mackey, 1994 dalam Sukmadjaya, et al, 2007). Tidak ada metode baku dalam isolasi

dan kultur protoplas, karena setiap individu sel atau jaringan yang akan digunakan sebagai

sumber protoplas kemungkinan akan memerlukan kondisi yang khusus (Sukmadjaya et al.

2007).

Menurut Purwito (1999) bahwa keberhasilan produksi hibrida somatik sangat

ditentukan oleh keberhasilan dalam proses kultur protoplas dan regenerasinya menjadi

tanaman dari tetua- tetuanya. Oleh karena itu perlu diketahui metode kultur protoplas, baik

mengenai sumber protoplas yang dipergunakan, jenis dan konsentrasi enzim untuk isolasi,

komposisi medium penaburan protoplas dan medium regenerasi mikrokalus menjadi

tanaman pada masing masing tetua yang dipakai.

Untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi adanya hibrida somatik dapat dilakukan

dengan beberapa cara, antara lain secara visual,melihat kejaguran hibrida dari mikrokalus

yang dihasilkan, menggunakan marka biokimia seperti mutan defisiensi nitrat reduktase,

penghitungan kromosom dan analisis ploidi dengan flow cytometry, menggunakan teknik

RFLP, teknik RAPD,dan melihat morfologi tanaman di laboratorium dan di lapangan.

Identifikasi tersebut diperlukan untuk mendapatkan validitas dalam penentuan hibrida

somatik (Purwito,1999).

E. Prosedur Fusi Protoplas

Contoh Fusi Protoplas antara Solanum melongena (terung) dan Solanum torvum

(takokak) (Husni et al., 2004) sbb:

1). Persiapan eksplan (Sumber Protoplas)

Eksplan yang digunakan adalah S.melongena dan S. torvum .Benih dari kedua

species tersebut disterilkan dalam alkohol 70 %, kemudian dalam 0,05% HgCl2, dan 30 %

clorox masing masing selama 3 menit. Setelah itu benih dicuci dengan aquades. Benih

yang telah disterilisasi dikecambahkan dalam media MS + 20 g/l sukrosa dan 7 g/l agar.

Media tersebut disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 oC selama 20 menit. Setelah

berkecambah, benih disubkultur pada media baru dan diinkubasi pada suhu 25-27 oC,

dengan penyinaran 1000 lux selama 12 jam setiap hari. Satu bulan setelah pengkulturan

daunnya digunakan sebagai sumber protoplas (Husni,A. et al.,2004).

2). Persiapan Larutan Enzim

Enzim yang digunakan adalah enzim Sellulase Onozuka RS 0,5 % (ml/l); 0,5 %

(M/v) macerozyme R-10 (Yakult honssa Co.);0,05% (M/v) MES dan 9,1 % (M/v)

manitol. Senyawa tersebut dilarutkan dalam CPW dan pH diatur 5,5 5,6, dan disterilisasi

dengan filter ukuran 0,22 m. Larutan tersebut kemudian dimasukkan kedalam cawan petri

berdiameter 5 cm, masing masing 5-6 ml setiap cawan (Husni,A. et al.,2004).

3). Isolasi Protoplas

Permukaan bagian bawah daun S.melongena dan S.torvum digores dengan pisau

secara merata dengan jarak antar irisan 2-3 cm. Daun yang telah diiris ditempatkan dalam

cawan petri yang berisi larutan enzim, kemudian diinkubasi dalam kamar gelap pada suhu

27oC selama 16 jam. Untuk membantu melepaskan protoplas, cawan petri digoyang selama

30 detik sehingga diperoleh larutan protoplas.

Larutan protoplas S.melongena dan S.torvum disaring dengan metalic sieve

berukuran 100m, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1800 rpm selama 5 menit

sampai dihasilkan pelet. Kemudian larutan enzim dipisahkan dan protoplas dilarutkan

dalam 21 % sukrosa dan disentrifugasi kembali selama 10 menit. Protoplas murni diambil

menggunakan pipet dan disentrifugasi kembali. Kemudian protoplas dilarutkan dalam 0,5

M manitol + 0,5 mM CaCl2 dan disentrifugasi selama 5 menit sampai terbentuk pelet

protoplas. Akhirnya protoplas dicuci dan densitas nya diukur (Husni,A. et al.,2004).

4). Fusi Protoplas

Protoplas S.melongena dan S torvum yang telah dimurnikan seperti tersebut diatas

masing masing diencerkan dengan larutan pencuci sehingga densitasnya menjadi

+ 5 x 104 protoplas /ml. Kemudian suspensi protoplas dicampur dalam tabung reaksi

dengan perbandingan volume yang sama dan diresuspensi sampai homogen. Setelah

homogen suspensi protoplas diambil dengan pipet sebanyak 600-800 l kemudian

dimasukkan kedalam cawan petri berdiameter 5 cm dan dibiarkan selama 5 menit sehingga

protoplas mengendap. Selanjutnya di sekeliling suspensi protoplas ditambahkan 100 l

larutan PEG dengan konsentrasi 30 % atau 50 % sebagai perlakuan selama 10 dan 20 detik

untuk menginduksi terjadinya fusi. Larutan PEG kemudian dibuang dan protoplas

dibersihkan dengan larutan pencuci. Selanjutnya dilakukan penghitungan secara

mikroskopis terhadap protoplas yang mengalami fusi. Protoplas yang telah difusikan

dikultur dalam media perlakuan untuk memacu pertumbuhannya (Husni,A. et al.,2004).

5). Kultur Protoplas Hasil Fusi

Media yang digunakan adalah media dasar KM8P dan VKM, masing masing

diperkaya dengan 0,2 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l zeatin + 0,1 mg/l NAA dengan pH 5,8.Media

tersebut disterilisasi dengan filter ukuran 0,22 m. Masing masing medium dipipet dan

dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi protoplas yang telah difusi,masing masing 6

ml setiap cawan. Kultur dipelihara dalam ruangan tanpa atau dengan penyinaran 1000 lux

pada suhu 27 oC sampai terbentuk koloni sel atau mikrokalus. Pengamatan dilakukan

terhadap jumlah koloni sel dan mikrokalus yang dihasilkan (Husni,A. et al.,2004).

6). Pengenceran Suspensi (Koloni ) Sel

Untuk mendorong mikrokalus membentuk kalus, suspense sel diencerkan dengan

media dasar yang sama (KM8P dan VKM), tetapi ZPT nya diganti dengan 0.1 mg/l 2,4-D

+ 2mg/l BAP. Koloni atau mikrokalus dari setiap cawan petri dibagi menjadi tiga, dan

setiap bagian dimasukkan ke dalam cawan petri baru yang telah berisi media pengenceran

masing masing 6 ml. Kultur disimpan kembali tanpa cahaya dalam inkubator bersuhu

27 oC..Lalu diamati jumlah kalus yang dihasilkan (Husni,A. et al.,2004).

7). Regenerasi Tunas

Kalus yang dihasilkan dari setiap perlakuan dipindahkan ke dalam media padat MS

+ vitamin Morell + 0,1 mg/l IAA dan konsentrasi zeatin sebagai perlakuan (2,4 dan 6

mg/l).Kemudian diamati keberhasilan regenerasi kalus membentuk tunas. Tunas yang

dihasilkan dipindahkan ke media dasar yang sama ,yaitu MS + vitamin Morell(padat) tanpa

menggunakan zpt untuk induksi akar (Husni,A. et al.,2004).

III.PENUTUP

Keberhasilan dalam pengendalian protoplas melangsungkan fusi non spesifik memberi

peluang bagi pembentukan sel hibrida dari dua species, yang secara konvensional melalui

persilangan seksual tidak mungkin dilakukan karena keterbatasan kendala genetik seperti

inkompatibilitas atau sterilitas. Beberapa potensi keuntungan pemuliaan tanaman melalui

hibridisasi somatik (fusi protoplas)(Soemartono,et al.,1992) antara lain :

1. Produksi hibrida interspesies atau intergenus yang secara konvensional tidak

mungkin dapat berlangsung, misalnya antar protoplas dari

Lycopersicon esculentum (tomato) x Solanum tuberosum (potato)

Pomato

2. Produksi galur heterozigot species sama, yang umumnya hanya bisa dikembangkan

melalui perbanyakan vegetatif,misalnya tanaman kentang dan tanaman umbi

lainnya.

3. Transfer terbatas genom dari satu species ke species lain melalui pembentukan

heterokarion dan pemilihan unsur unsur sitoplasmik salah satu species.

4. Produksi hibrid amfidiploid yang fertil dari dua species yang inkompatibel.

DAFTAR PUSTAKA

Husni,A.,I.Mariska, dan Hobir. 2004. Fusi Protoplas dan Regenerasi Hasil Fusi Antara

Solanum melongena dan Solanum Torvum. Jurnal Bioteknologi Pertanian 9(1): 1-7.

Mariska,I., dan A.Husni. 2006. Perbaikan Sifat Genotipe Melalui Fusi Protoplas Pada

Tanaman Lada,Nilam, dan Terung. Jurnal Penelitian dan Pengembangan Pertanian

25(2): 55 60.

Martono,B. 2009. Keragaman Genetik, Heritabilitas dan Korelasi antara Karakter

Kuantitatif Nilam (Pogostemon sp.) Hasil Fusi Protoplas. Jurnal Penelitian Tanaman

Industri 15(1) :9 15.

Millam,S.,L.A.Payne, and G.R.Mackay. 1995. The Integration of Protoplast Fusion-

derived Material into a Potato Breeding Programme: a review of progress and

problem. Euphytica 85: 451 455.

Puite, K.J. 1991. Somatic Hybridisation in Biotechnological Innovations in Crop

Improvement. Open Universiteit and Thames Polytechnic. Nederland.

Purwito,A. 1999. Fusi Protoplas Intra dan Interspesies pada Tanaman Kentang. Disertasi

Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Rostiana,O.,2006. Peluang Pengembangan Bahan Tanaman Jahe Unggul Untuk

Penanggulangan Penyakit Layu Bakteri. Balai Penelitian Tanaman Obat dan

Aromatik.Hal 77-98.

Soemartono,Nasrullah & Hari Hartiko.1992. Genetika Kuantitatif dan Bioteknologi

Tanaman. PAU Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.Hal 277-296.

Sukmadjaya, D.,Novianti Sunarlim,Endang G.Lestari, Ika Roostika, dan Tintin Suhartini.

2007. Teknik Isolasi dan Kultur Protoplas Tanaman Padi. Jurnal AgroBiogen

3(2):60-65.

Suryowinoto,M.1990. Pemuliaan Tanaman secara In vitro. Petunjuk Laboratorium.

PAU.Biotek.Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta.321 hlm

Suryowinoto,M.1996. Prospek Kultur Jaringan dalam Perkembangan Pertanian Modern.

Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta. 2-18.

Verma,N.,M.C.Bansal, Vivek Kumar.2004. Protoplast Fusion Technology and its Bio

technological Applications.Departement of Paper Technology, Indian Institute of

Technology, Roorkee,Saharanpur.

Waara,S. and K.Glimelius. 1995. The Potential of Somatic Hybridization in Crop

Breeding. Euphytica 85:217-233.

Wattimena,G.A. 1999. Application of Biotechnology in Horticultural Crops Production. In

Proceeding of Seminar on Biotechnology: Application of Biotechnology in

Horticultural Production. Bogor Agricultural University-DFID British Council,Bogor,

14 April 1999.