enzim lipase

38
Tugas Enzimologi ENZIM LIPASE DARI MIKROBA Oleh SUMARLIN JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALUOLEO KENDARI 2010

Upload: zumpith

Post on 02-Jul-2015

1.417 views

Category:

Documents


5 download

DESCRIPTION

Enzim Lipase dari Mikroba

TRANSCRIPT

Page 1: Enzim Lipase

Tugas Enzimologi

ENZIM LIPASE DARI MIKROBA

Oleh

SUMARLIN

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALUOLEO

KENDARI

2010

Page 2: Enzim Lipase

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan

mempunyai fungsi penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme

yang terjadi pada organisasi hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang

menunjang berbagai proses industri. Hal ini disebabkan enzim mempunyai

efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak menimbulkan produk

samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi

(Lehninger, 1995).

Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai

aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi

pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi

pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah pH,

suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus

mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral

(Wang, 1979).

Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang

secara cepat. Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim,

meliputi industri pangan dan non pangan.

Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada

bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini

memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol.

Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik

didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih, 2004). Enzim

lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda

minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa

reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis,

alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi (Dosanjh dan Kaur, 2002).

Disamping dari tanaman dan hewan, dewasa ini lipase mulai diproduksi

dari berbagai mikroorganisme. Keuntungan memproduksi enzim dari

mikroorganisme menurut Suhartono (1989) adalah produksi enzim dapat

ditingkatkan dalam skala besar dalam ruangan yang relatif terbatas. Bakteri

merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim lipase,

karena bakteri memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan yang

Page 3: Enzim Lipase

terdapat kandungan makanan atau nutrisi yang kompleks. Oleh sebab itu pada

makalah ini kami akan mengkaji enzim lipase dari mikroorganisme.

B. Rumusan Masalah

Adapun permasalahan dari makalah ini yaitu:

1. Jenis mikroorganisme apakah yang mampu menghasilkan enzim lipase?

2. Bagaimanakah cara memproduksi enzim lipase dari mikroba?

3. Bagaimanakah cara pemurnian enzim lipase?

4. Bagaimana cara mengkarakterisasi enzim lipase?

5. Bagaimanakah cara menguji aktivitas enzim lpase?

C. Tujuan

Tujuan yang ingin dicapai dari pembuatan makalah ini yaitu:

1. Mengetahui jenis mikroba penghasil enzim lipase.

2. Mengetahui cara memproduksi enzim lipase dari mikroba.

3. Mengetahui cara pemurnian enzim lipase.

4. Mengetahui cara mengkarakterisasi enzim lipase.

5. Mengetahui cara menguji aktivitas enzim lpase.

D. Manfaat

Manfaat yang dapat diperoleh dari makalah ini ialah kita dapat mengetahui

jenis mikroba penghasil enzim lipase, cara memproduksi enzim lipase dari

mikroba, cara mengkarakterisasi enzim lipase, dan mengetahui cara menguji

aktivitas enzim lpase.

Page 4: Enzim Lipase

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

Dewasa ini, enzim adalah senyawa yang umum digunakan dalam proses

produksi. Enzim yang digunakan pada umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari

bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi yang

kemudian akan meningkatkan jumlah produksi.

Lipase (triacylglycerol hydrolase, E.C. 3.1.1.3) merupakan enzim yang penting

pada industri lemak dan minyak, yaitu untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak

dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi (Elisabeth dan

Siahaan, 2000, Ronne, T.H., et.al., 2005, Wang, et.al., 2006, Liu, et.al., 2007) sebagai

contoh yang telah berhasil dengan baik yaitu modifikasi minyak dari tumbuhan

menjadi lemak kakao subtitusi yaitu minyak sawit dengan stearin kelapa sawit,

ataupun dengan mengganti sebagian dengan lemak sapi, minyak bunga matahari yang

dilakukan secara interesterifikasi enzimatis (Macrae, 1983; Forssell, et.al., 1992;

Bloomer, et.al., 1990; Khumalo, et.al., 2002).

Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan

semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri

susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan

memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat

fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging

dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak). Sedangkan pada industri non

pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi

minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen

(melarutkan spot minyak/lemak), industri obat-obatan (mempermudah daya cerna

minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri

kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan

lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk

fisik dan kimia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih

tinggi (Khumalo, et.al., 2002).

Lipase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolase yang menghidrolisis trigliserida

menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial (monogliserida), digliserida dan gliserida

(Macrae, 1983). Aplikasi lipase untuk hidrolisis, interesterifikasi dan esterifikasi telah

menjadi objek penelitian, dengan perhatian utama pada aplikasi minyak dan lemak.

Page 5: Enzim Lipase

Lipase dapat digunakan dengan baik sebagai biokatalis dalam proses biologis (Dosanjh

and Kaur, 2002).

Lipid terstruktur adalah triasil gliserol yang mengandung campuran asam lemak

berantai pendek, medium, atau keduanya dan berantai panjang yang sebaiknya dalam

molekul gliserol yang sama supaya menunjukkan potensi maksimalnya (Akoh, 1988).

Lipid terstruktur berdasarkan lokasi asam lemak dibedakan menjadi lipid terstruktur

spesifik (LSS) dan lipid terstruktur non-spesifik (LS). LS adalah minyak dan lemak

termodifikasi atau sintetik mengandung asam lemak berantai panjang dan medium

atau pendek. LSS adalah minyak dan lemak termodifikasi atau sintetik mengandung

asam lemak berantai panjang dan medium atau pendek, dimana masing-masing

kelompok menempati secara spesifik pada posisi sn-2 atau sn-1,3 dari kerangka

gliserol. LS dapat diproduksi dengan interesterifikasi kimia (randominisasi) atau

enzimatik. Namun LSS hanya dapat diproduksi melalui interesterifikasi enzimatik

menggunakan enzim lipase regiospesifik (Xu, 2000). Pada akhir-akhir ini produk baru

berupa LSS memperoleh perhatian dunia di bidang teknologi pangan dan gizi. Bahkan

sintesis LSS dapat melalui ester asam lemak misalnya metil atau etil ester asam lemak

yang dapat digunakan pula untuk biodiesel atau bahan baku industri oleokimia.

Page 6: Enzim Lipase

BAB III

PEMBAHASAN

A. Lipase

Enzim lipase atau asilgliserol hidrolase (E.C 3.1.1.3) merupakan enzim yang

dapat menghidrolisis rantai panjang trigliserida. Keterangan dari kode enzim ini

adalah :

3 Hydrolases

1 Acting on ester bonds

1 Carboxylic-ester hydrolases

3 triacylglycerol lipase

Enzim ini memiliki potensi untuk digunakan memproduksi asam lemak, yang

merupakan prekursor berbagai industri kimia. Lipase diklasifikasikan sebagai enzim

hidrolase yang menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial

(monogliserida), digliserida dan gliserida seperti pada gambar berikut.

Produksi asam lemak secara industri menggunakan katalis kimia menghasilkan

efek samping bagi lingkungan. Selain itu enzim lipase telah banyak dikenal memiliki

cakupan aplikasi yang amat luas dalam bidang bioteknologi, seperti biomedikal,

pestisida, pengolahan limbah, industri makanan, biosensor, detergen, untuk industri

kulit dan industri oleokimia (memproduksi asam lemak dan turunannya).

Lipase sebagai katalis untuk reaksi esterifikasi dapat diperoleh dari species

mikrobia ataupun tanaman. Nelson dkk. (1996) melakukan ”screening” lipase dari

banyak spesies mikroba dalam kemampuannya melakukan transesterifikasi

trigleserida dengan alkohol rantai pendek menjadi alkil ester. Lipase Mucor miehei

ternyata paling efisien mengubah trigliserida menjadi alkil ester dengan alkohol

Page 7: Enzim Lipase

primer, sedangkan lipase dari Candida antartica paling efisien untuk transesterifikasi

trigliserida dengan alkohol sekunder menghasilkan alkohol ester bercabang. Lipase ini

juga terbukti efektif untuk transesterifikasi minyak nabati dan bahan baku lain yang

mengandung asam lemak tinggi menjadi derivat alkil ester.

B. Sisi aktif enzim lipase

Lipase juga disebut dengan serin hidrolase yang bekerja pada urutan G-X1-S-X2-G,

dimana G-glycine, S-serine, X1-histidin dan X2-asam glutamat atau aspartat. Fungsi

biologis dari lipase adalah mengkatalisis proses hidrolisis dari triacylglycerols menjadi

asam lemak bebas. Gambar beikut dapat dilihat struktur 3 dimensi dari enzim lipase.

Dari gambar diatas dapat dilihat komponen sisi aktiv dari enzim lipase yang

teridiri dari Serin-77, Aspartat-133 dan Histidin-156. Berikut adalah struktur dari asam

amino serin, aspartat dan histidin.

Interaksi residu Asp atau Glu bermuatan negatif memungkinkan residu tersebut

untuk bertindak sebagai basis umum yang dapat menangkap sebuah proton dari gugus

hidroksil situs aktif Serin. Sehingga dihasilkan ion alkoksida yang nukleofilik terhadap

residu Serin untuk menyerang gugus karbonil substrat ester membentuk perantara

asil-enzim. Komponen penting lainnya untuk mekanisme katalitik adalah oxyanion-hole

Page 8: Enzim Lipase

yang terdiri dari donor ikatan H (kebanyakan ikatan kelompok N-H). Lubang oxyanion

membantu untuk menstabilkan reaksi antara selama katalisis ketika oksigen karbonil

membawa muatan parsial negatif.

Proses aktivasi serin oleh histidin dan asp/glu lipase dapat digambarkan seperti

dibawah ini.

C. Mekanisme Hidrolisis Triasilgliserol

Secara umum proses pemutusan ikatan ester oleh lipase dapat digambarkan

seperti berikut ini.

Dari gambar di atas maka dapat kami tuliskan mekanisme reaksi dari hidrolisis

triasilgliserol secara umum seperti berikut ini.

Page 9: Enzim Lipase
Page 10: Enzim Lipase

D. Mikroorganisme penghasil enzim lipase

Kelompok yeast yang dapat manghasilkan lipase adalah dari Candida rugosa dan

dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium aurantiogriseum. Adapun

pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan adalah dari genera Bacillus, Aeromonas,

Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas,

dan Staphyloccus.

Di antara sumber lipase baik berasal dari tumbuhan, hewan dan mikroba,

ternyata lipase mikroba yang paling banyak digunakan. Hal ini disebabkan karena

mikroba dapat dengan mudah dibudidayakan dan lipase dapat mengkatalis berbagai

reaksi hidrolisis dan sintetis. Lipase digunakan dalam berbagai bidang bioteknologi,

seperti pengolahan makanan dan susu (keju pematangan, pengembangan rasa, EMC

teknologi), deterjen, farmasi (naproxen, ibuprofen), agrokimia (insektisida, pestisida)

Page 11: Enzim Lipase

dan oleokimia (hidrolisis lemak dan minyak, sintesis biosurfaktan ) industri. Lipase

dapat lebih dimanfaatkan di daerah baru di mana mereka dapat berfungsi sebagai

biocatalysts potensial.

Lipase yang dihasilkan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya

adalah lama waktu inkubasi. Lama waktu inkubasi mempengaruhi jumlah lipase yang

dihasilkan. Kemampuan bakteri dalam menghasilkan lipase telah ditemukan dengan

lama waktu inkubasi dari beberapa jam sampai beberapa hari. Pabai et al (1996) dan

Dong et al (1999) melaporkan bahwa Pseudomonas spp., P. fragi, dan P. fluorescens BW

96CC mampu menghasilkan lipase hingga mencapai maksimum setelah inkubasi antara

72 dan 96 jam. Menurut Mahadik et al (2002), aktivitas lipase Aspergillus niger

maksimum pada waktu inkubasi 5 hari. Lima et al. (2005) melaporkan bahwa jamur

Penicillium aurantiogriseum menghasilkan lipase setelah inkubasi 48 dan 72 jam.

1. Lipase Bakteri

Sejumlah relatif lebih kecil dari lipase bakteri telah diteliti dengan baik

dibandingkan dengan tanaman dan jamur lipase. Lipase bakteri adalah glikoprotein,

tetapi beberapa lipase bakteri ekstraseluler adalah lipoprotein. Winkler et al

melaporkan bahwa produksi enzim pada sebagian besar bakteri dipengaruhi oleh

polisakarida tertentu. Sebagian besar lipase bakteri dilaporkan sejauh ini konstitutif

dan tidak spesifik dalam spesifisitas substrat dan lipase bakteri sedikit thermostabil.

Di antara bakteri Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Arthrobacter sp.,

Pseudomonas sp, Staphylococcus sp dan Chromobacterium sp, telah dimanfaatkan dalam

produksi enzim lipase. Stafilokokus menghasilkan lipoprotein lipase di alam. Lipase

dimurnikan dari S. aureus dan S. hyicus menunjukkan berat molekul berkisar antara 34-

46 kDa. Mereka dirangsang oleh Ca2+ dan dihambat oleh EDTA. pH optimum bervariasi

antara 7,5 dan 9,0. gen lipase dari S. hyicus dan S. aureus telah diklon, diurutkan, dan

dibandingkan dengan lipase lainnya. Ke-duanya menunjukkan adanya domain terpisah

oleh 100 jenis residu asam amino yang mungkin untuk membentuk sisi aktif. Residu

situs putatif aktif terdapat pada His 269 dan Ser 369, pada lipase S. hyicus sangat

dilestarikan dalam dua lipase S. aureus dan dalam lipase beberapa eukariot.

Lipase dari spesies yang berbeda dari Psuedonomas telah dimurnikan dengan

pengasaman dari supernatan kultur, pengendapan amonium sulfat, kromatografi

kolom, dan fokus isoelektrik menggunakan CHAPS. Lipase yang dimurnikan dari P.

fragi, P. fluorescens, dan P. aeruginosa monomer dengan berat molekul 33 kDa, 45 kDa,

dan 29 kDa. Lipase ini dihambat oleh Zn++, Fe++, dan Al+++ dan activator oleh Ca++. Gen

lipase dari P. fragi telah dikloning dan sequenced.

Page 12: Enzim Lipase

2. Lipase jamur

Lipase jamur telah diteliti sejak tahun 1950-an, dan Lawrence, Brockerhoff dan

Jensen telah menyajikan tinjauan yang komprehensif. Lipase ini sedang dieksploitasi

karena biaya ekstraksi yang rendah, stabilitas termal dan pH, spesifisitas substrat, dan

aktivitas dalam pelarut organik. Para produsen utama dari lipase komersial ialah

Aspergillus niger, Candida cylindracea, lanuginosa Humicola, Mucor miehei, Rhizopus

arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus dan R. oryzae.

Di antara Mucorales, enzim lipolitik dari Mucor hiemalis , M. miehei, M. lipolyticus,

M. pusillus, Rhizopus japonicus, R. arrhizus, R. delemar. R. nigricans, R. nodosus, R.

microsporus, dan R. chinesis telah dipelajari secara detail. Termofilik M. pusillus dikenal

sebagai penghasil lipase ekstraseluler termostabil.

1,3 - spesifisitas (regio)-dari Rhizopus, merupakan lipase yang sangat cocok

untuk konversi trigliserida menjadi monogliserida. Lipase R. japonicus telah digunakan

untuk menghasilkan mentega, pembuatan coklat dan interesterifikasi minyak sawit

dengan metil stearate. Lipase (40 sampai 45 kDa) dari berbagai jenis Rhizopus

menunjukkan aktivitas maksimum terhadap asam lemak rantai menengah (C8-C10).

Dalam kasus R. delemar, ekstraseluler dan intraseluler isoenzim lipase telah diisolasi.

Produsen Lipase dari Entomophthorales termasuk Entomophthora apiculata, E.

coronata, E. thaxteriana, E. virulenta, Basidiobolus spp. dan Conidiobolus spp. Untuk

genus Pichia, Hansenula, dan Saccharomyces juga dilaporkan menghasilkan lipase. Dua

macam lipase telah dimurnikan dari Saccharomyces lipolytica. Lipase dilaporkan dari

Candida curvata, C. tropicalis, C. valida, dan C. pellioculosa dan spesifik terhadap obligasi

ester berbeda dalam hidrolisis trigliserida dengan C. deformans.

Jamur Geotrichum candidum berperan dalam pembentukan asam dalam produk

susu oleh lipolyzing lemak. Lipase dari G. candidum spesifisitas terhadap asam lemak

dengan ikatan rangkap cis di C9, sehingga enzim ini diterapkan untuk analisis

struktural triglycerides.

Enzim lipase intraseluler dan ekstraseluler Aspergillus niger adalah 1,3 -

(regio)-specific. A. oryzae dilaporkan efisien untuk ekspresi heterolog dari lipase dari

Rhizopus miehei dan Humicola lanuginosa. Enzim lipase dari Penicillium roqueforti

berperan dalam rasa Blue cheese. Aktivitas lipolitik juga telah terdeteksi pada P.

camemberti, permukaan cetakan putih dan keju Brie Camembert. Lipase dengan

spesifisitas untuk asam butirat telah diisolasi dari strain dari spesies Penicillium seperti

P. cyclopium, P. Verrucosum var, P. cyclopium, dan P. crustosum. Enzim lipase dari P.

cyclopium memiliki aktivitas yang jauh lebih tinggi terhadap mono dan digliserida

Page 13: Enzim Lipase

selain trigliserida. Enzim lipase dari H. lanuginosa DSM 3819 cocok sebagai aditif

deterjen karena bersifat termostabilitas, aktivitas yang tinggi pada pH basa, dan

stabilitas terhadap surfactant anionik. Lipase dari H. lanuginosa menunjukkan tingkat

tinggi aktivitas hidrolitik pada minyak kelapa dan minyak karena memiliki kandungan

asam laurat yang tinggi.

Keterangan mengenai enzim lipase dari mikroba dapat dilihat pada tabel berikut

ini.

E. Produksi dan Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri

Produksi enzim lipase dari bakteri diawali dengan penanaman bakteri dalam

media fermentasi yang terdiri dari komposisi gum arab 5%, pepton 1%, , minyak zaitun

10% dengan kondisi optimum pertumbuhan bakteri sebagai berikut: waktu inkubasi

24 jam, suhu 35°C, pH 8 (Anissa, 2006). Penanaman media fermentasi menggunakan

Page 14: Enzim Lipase

kondisi optimum dilakukan untuk memperoleh enzim lipase dengan jumlah yang

cukup besar.

Setelah diinkubasi dalam media fermentasi selama 24 jam, enzim lipase

dipisahkan dengan menggunakan alat sentrifuga dengan kecepatan 3500 rpm, 30 menit

dan suhu 4oC untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim lipase. Dari proses ini diperoleh

ekstrak kasar enzim sebanyak 985 mL dengan aktivitas unit rata-rata enzim hasil

pengukuran duplo 0,21 U/ml, kadar protein 3,55 mg/ml, aktivitas spesifik 0,059 U/mg.

Setelah didapat ekstrak kasar dilanjutkan dengan proses pemurnian enzim

secara fraksinasi bertingkat menggunakan garam amonium sulfat. Fraksi tertinggi

adalah fraksi ke V (80-100)% jenuh dengan aktivitas unit 3,5 U/ml, kadar protein 1,74

mg/ml dan aktivitas spesifik 2,011 U/mg. Fraksi tertinggi yang diperoleh ini

selanjutnya didialisis menggunakan bufer fosfat pH 8; 0,025 M. Enzim lipase hasil

dialisis fraksi ke V menunjukkan 2,04 U/ml, kadar protein 0,42 mg/ml.dan aktivitas

spesifik 4,86 U/mg. Hasil ini memperlihatkan bahwa telah terjadi kenaikan sebesar

82,37 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan perolehan 31,48 %.

Enzim lipase yang telah didialisis selanjutnya dimurnikan kembali dengan

sephadex G-100 secara kromatografi kolom, diperoleh 22 fraksi dimana fraksi 19

adalah fraksi tertinggi dengan aktivitas unit 2,83 U/ml, kadar protein 0,57 mg/ml dan

aktivitas spesifik 4,96 U/mg.

Dari 3 tahap pemurnian (fraksinasi, dialisis, dan kromatografi kolom) terlihat

bahwa aktivitas spesifik meningkat yang disebabkan oleh peningkatan kemurnian

enzim. Aktivitas spesifik enzim dipengaruhi oleh kadar protein, semakin tinggi aktivitas

spesifik suatu enzim maka semakin tinggi kemurnian enzim tersebut. Hal ini

menunjukkan terjadinya pemisahan protein lain yang bukan enzim. Dengan

meningkatnya aktivitas spesifik pada tiap tahap pemurnian, menunjukkan bahwa

proses pemurnian yang dilakukan cukup baik.

F. Pemurnian Enzim

a. Fraksinasi Amonium Sulfat

Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan fraksinasi

bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan (0-20%),

(20-40%), (40-60%), (60-80%) dan 80-100%). Fraksinasi dengan amonium sulfat

dilakukan dengan cara menambahkan amonium sulfat sedikit demi sedikit pada larutan

ekstrak kasar enzim sambil diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan diusahakan

sedemikian rupa sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang lebih 20 menit.

Page 15: Enzim Lipase

Setiap endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan

menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit kemudian

dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 8 dengan konsentrasi 0,05 M lalu diuji

aktivitasnya menggunakan Metode titrimetri dan ditentukan kadar proteinnya

menggunakan Metode Lowry. Fraksi yang memberi aktivitas tertinggi diuji aktivitas

esterifikasinya.

b. Dialisis

Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi

dilarutkan ke dalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan kedalam

kantong selofan, kemudian didialisis menggunakan buffer fosfat pH 8; 0,05 M selama ±

48 jam pada suhu 4ºC.

c. Kromatografi Kolom

Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan

kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase diam.

Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi sebagai

fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel

enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang

antar pori-pori sehingga akan lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot

molekul lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih

lambat. Setelah proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15

ml. Eluen yang telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar protein dan

aktivitas enzimnya. Fraksi yang memberikan aktivitas tinggi dikumpulkan dan

dikarakterisasi serta ditentukan aktivitas esterifikasinya.

G. Uji aktivitas enzim lipase

Untuk menentukan aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri yaitu,

sebanyak 2 ml minyak zaitun dalam erlenmeyer 100 ml, ditambah 1 ml buffer fosfat

0,05 M (pH 8), dan 1 ml larutan enzim. Campuran substrat enzim ini kemudian dikocok

menggunakan shaker inkubator pada 30°C selama 1 jam. Setelah 1 jam substrat enzim

diinaktifkan dengan menggunakan campuran aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 ml.

Campuran tersebut ditambahkan 5 tetes fenolftalein 1% sebagai indikator dan dititrasi

dengan menggunakan larutan NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan setelah campuran

berubah menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. Untuk

penetuan standar dilakukan dengan komposisi campuran yang sama, tetapi pada saat

dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol

Page 16: Enzim Lipase

untuk menginaktifkan enzim. Kemudian dititrasi dengan prosedur yang sama dengan

analisis sampel.

H. Penentuan Kadar Protein

Sebanyak 0,1 ml larutan enzim ditambahkan 0,9 ml aquades direaksikan dengan

5 ml larutan C. Larutan didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian

ditambahkan reagen Folin-Ciocelteau sebanyak 0,5 ml. Larutan dibiarkan selama 30

menit pada suhu kamar. Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang

gelombang 740 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Konsentrasi

protein ditentukan dengan menggunakan kurva standar Bovin serum Albumin (BSA)

dengan konsentrasi 0-800 ppm.

I. Uji Aktivitas Esterifikasi

Pengukuran aktivitas esterifikasi dilakukan menggunakan Metode Hariyadi

(1995) dalam Efendi (2001) yaitu dengan cara mengesterkan 0,2 M asam laurat dan 0,2

M lauril alkohol didalam tabung reaksi bertutup, masing-masing sebanyak 5 ml.

Selanjutnya di inkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Setelah suhu konstan,

ditambahkan enzim sebanyak 0,1 ml kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu

50°C. Selama reaksi esterifikasi berlangsung dilakukan pengadukan dengan stirer agar

reaksi berjalan lebih baik. Untuk mempertahankan suhu yang konstan, esterifikasi

dilakukan menggunakan circulated water bath. Media pemanas yang digunakan adalah

aliran air yang terus berputar secara kontinyu (Nuraida, 2000 dan Suhendra, 2004).

Setelah reaksi esterifikasi selesai, hasil reaksi segera disaring dengan membran

selulosa 0,45 m untuk memisahkan enzim. Filtrat yang telah terpisah dari enzim,μ

dianalisis kandungan asam lemak bebas (ALB).

Untuk pengukuran asam lemak bebas menggunakan Metode Lowry dan Tinsley

yang dimodifikasi. Filtrat yang diperoleh diambil sebanyak 0,4 ml dan dimasukkan

kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 4,6 ml heksan. Setelah itu

dihomogenkan menggunakan vortex 30 detik yang dilanjutkan dengan penambahan 1

ml cupric asetat pH 6-6,2 sebagai pewarna. Kemudian dihomogenkan kembali selama 2

menit dan diinkubasikan selama 15 menit. Lapisan atas filtrat diambil dan diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 715 nm. (kurva standar dibuat dengan

menggunakan asam laurat 0-100 mmol).

Page 17: Enzim Lipase

J. Karakterisasi Enzim

Fraksi yang digunakan untuk tahap karakterisasi enzim adalah fraksi yang

mempunyai aktivitas unit tertinggi. Selanjutnya dilakukan karakterisasi enzim yang

meliputi pH, temperatur, waktu inkubasi, Km dan Vm.

1. pH Optimum

Untuk menentukan pH optimum enzim hasil isolasi, variasi pH yang digunakan

adalah 6, 7, 8, 9, dan 10 hasilnya tertera pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat

bahwa aktivitas lipase bervariasi dengan adanya perubahan pH. Hal ini umumnya

terjadi karena adanya perubahan struktur sekunder dan tersier dari enzim. Pada pH

yang optimum muatan gugus samping asam amino berada pada keadaan yang sesuai

sehingga enzim sangat efisien dalam mempercepat reaksi biokimia yang sangat

spesifik. Aktivitas optimum lipase dicapai pada pH 8. Hal ini disebabkan karena pada

kondisi pH 8 gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik

enzim berada pada keadaan yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya tinggi.

2. Penentuan Temperatur optimum

Pada penentuan temperatur optimum, suhu yang digunakan adalah 30°C, 35°C,

40°C, 45°C, dan 50°C. Dari hasil pengujian yang dilakukan temperatur optimum lipase

adalah 45°C seperti yang tertera pada Gambar 2. Pada temperatur kurang dari 45°C

enzim cukup stabil, tetapi hidrolisis substrat minyak zaitun oleh enzim tidak berjalan

secara maksimal. Dengan meningkatnya temperatur, energi kinetik molekul-molekul

yang bereaksi bertambah sehingga molekul yang bereaksi semakin banyak dan produk

yang dihasilkan semakin besar. Diatas temperatur optimum, aktivitas enzim menurun

tajam hal ini terjadi karena enzim mengalami denaturasi protein yang dapat merubah

konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya. Pada

temperatur tinggi, substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi sehingga

gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim (Suhartono,

Gambar 1. Penentuan pH optimum

Page 18: Enzim Lipase

1989). Sedangkan pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim

juga rendah. Hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi

tersebut dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik dari

molekul enzim atau molekul substrat.

3. Waktu Inkubasi optimum

Selain pH dan temperatur, waktu inkubasi juga mempengaruhi pembentukan

produk. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan pengujian enzim lipase

pada berbagai waktu inkubasi, yaitu : 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit. Pengaruh waktu

inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 3.

Berdasarkan pada Gambar 3, aktivitas lipase optimum pada waktu inkubasi 10

menit. Pada waktu inkubasi diatas 10 menit, enzim mulai mengalami penurunan

aktivitas lipase. Hal ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan

oleh setiap enzim untuk bereaksi dengan substrat. Selain itu dengan panas 45°C enzim

Gambar 2. Penentuan temperatur optimum

Gambar 3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase

Page 19: Enzim Lipase

lipase tidak dapat terlalu lama bereaksi dengan substrat sehingga lipase mulai

mengalami denaturasi.

4. Nilai Km dan Vm

Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya

konsentrasi substrat sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi

tetap. Pada keadaan tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena

reaksi enzim dengan substratnya menjadi jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat.

Harga KM dari suatu enzim berfungsi untuk mengetahui konsentrasi dari substrat yang

menghasilkan setengah laju reaksi maksimum.

Dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa mula-mula aktivitas unit meningkat dengan

bertambahnya konsentrasi substrat, akan tetapi setelah tercapai aktivitas optimum

terjadi penurunan aktivitas. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi substrat optimum

enzim berada pada keadaan “jenuh dengan substrat”. Selain itu, dapat juga disebabkan

pengendalian umpan balik, dimana jika produk yang dihasilkan berlebih maka produk

tersebut menjadi inhibisi bagi kerja enzim.

Harga KM dihitung dengan mengukur aktivitas enzim lipase dalam berbagai

konsentrasi substrat dengan pH, temperatur, dan waktu inkubasi optimum. Pada

penelitian ini digunakan pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit. Harga KM

enzim hasil isolasi adalah 0,07 mg substrat/ml dan Vmaks sebesar 1,506 molμ

minyak/ml enzim.menit.

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase

Page 20: Enzim Lipase

K. Uji Aktivitas Esterifikasi

Penentuan aktivitas esterifikasi dilakukan dengan mencampurkan asam laurat

dan lauril alkohol sehingga akan dihasilkan ester dan air. Selain itu dalam penelitian ini

juga digunakan pelarut heksana. Heksana merupakan pelarut organik non polar yang

sering dan cocok digunakan dalam reaksi esterifikasi yang dikatalis oleh lipase. Selain

itu menurut Basri et al.,(1995) aktivitas esterifikasi yang tinggi dari enzim lipase

diperoleh dengan menggunakan pelarut organik yang bersifat non polar karena pada

pelarut hidrofobik, air cenderung akan berpartisi ke dalam molekul enzim sehingga

akan meningkatkan kelarutan dan kestabilan enzim. Sementara itu aktivitasnya akan

rendah pada penggunaan pelarut organik yang bersifat polar karena pelarut tersebut

akan menarik sebagian air esensial dari molekul enzim.

Dalam pengujian aktivitas esterifikasi dilakukan pada ekstrak kasar enzim, fraksi

tertinggi ( Fraksi V) dari fraksinasi amonium sulfat, enzim hasil dialisis, dan enzim hasil

kromatografi kolom. Dari hasil penelitian diperoleh data bahwa aktivitas esterifikasi

meningkat dari ekstrak kasar enzim sampai tahap pemurnian kromatografi kolom

seperti yang terlihat pada Tabel 1.

Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa aktivitas esterifikasi dari ekstrak kasar sampai

dengan kromatografi kolom semakin meningkat. Hal ini dapat disebabkan semakin

meningkat kemurnian enzim lipase maka makin meningkat juga aktivitas esterifikasi

enzim lipase.

Tabel 1. Hasil Uji Aktivitas Esterifikasi Lipase

TahapAktivitas esterifikasi

(mmol/ml enzim.menit)Ekstrak kasar

enzim2.38

Fraksi V (80-100%) 3.81Dialisis 4.29

Kromatografi kolom 5.24

Adanya protein lain yang bukan enzim dapat menghambat sehingga kerja enzim

tidak maksimal dalam proses esterifikasi. Maka ketika dilakukan pemurnian, enzim

telah terpisah dari protein lain yang bukan enzim sehingga dapat memaksimalkan

proses esterifikasi.

Page 21: Enzim Lipase

L. Aplikasi enzim lipase

1. Lipase dalam industri susu

Lipase digunakan secara ekstensif dalam industri susu untuk hidrolisis

lemak susu. Aplikasi saat ini meliputi peningkatan rasa keju, percepatan

pematangan keju, pembuatan produk keju-suka, dan lipolisis lemak mentega,

dan cream. Sedangkan penambahan lipase terutama lisis rantai pendek (C4 dan

C6) asam lemak yang mengarah ke pengembangan rasa, aroma tajam,

pelepasan rantai menengah (C12 dan C14) asam lemak cenderung memberikan

rasa sabun untuk produk . Selain itu, asam lemak bebas mengambil bagian

dalam reaksi kimia sederhana di mana mereka memulai sintesis bahan rasa lain

seperti aceto-asetat, ß-keto asam, metil keton, ester rasa, dan lactones.

2. Lipase dalam deterjen

Penggunaan enzim dalam sabun bubuk masih tetap menjadi pemasaran

terbesar untuk industri enzyme. Tren di seluruh dunia terhadap suhu

pencucian yang lebih rendah telah menyebabkan permintaan jauh lebih tinggi

untuk formulasi deterjen rumah tangga. program skrining terakhir intensif,

diikuti oleh manipulasi genetik, telah menghasilkan pengenalan beberapa

persiapan yang cocok, misalnya, Novo Nordisk's Lipolase (lipase Humicola

disajikan dalam Aspergillus oryzae).

3. Lipase di industri oleokimia

Ruang lingkup penerapan lipase pada industri oleokimia sangat besar

karena menghemat energi dan meminimalkan degradasi termal selama

hidrolisis, glycerolysis, dan alcoholysis. Miyoshi Minyak dan Lemak.Co Jepang,

melaporkan penggunaan komersial cylindracea lipase Candida dalam produksi

sabun. Pengenalan generasi baru enzim murah dan sangat termostabil dapat

mengubah keseimbangan ekonomi yang mendukung penggunaan lipase.

Kecenderungan saat ini di industri oleokimia adalah suatu gerakan

menjauh dari menggunakan pelarut organik dan emulsifiers. Berbagai reaksi

yang melibatkan hidrolisis, alkoholisis, dan glycerolysis telah dilakukan

langsung dalam campuran substrat menggunakan berbagai lipase amobil. Ini

telah menghasilkan produktivitas yang tinggi serta terus menerus menjalankan

proses. Hidrolisis enzimatis mungkin menawarkan harapan terbesar untuk

membelah lemak tanpa investasi yang besar dalam peralatan mahal serta

pengeluaran dalam jumlah besar energy termal.

Page 22: Enzim Lipase

4. Lipase dalam sintesis trigliserida

Nilai komersial lemak tergantung pada komposisi asam lemak dalam

struktur mereka. Sebuah contoh khas dari campuran trigliserida tinggi nilai-

asimetris adalah mentega kakao. Potensi lipase 1,3-regiospecific untuk

pembuatan pengganti mentega, coklat diakui oleh Unilever dan Fuji Oil. Ulasan

komprehensif pada teknologi ini, termasuk analisis komposisi produk yang

ditemukan. Pada prinsipnya, pendekatan yang sama berlaku untuk sintesis

banyak lainnya terstruktur triglycerides properti memiliki dietic atau nutrisi

yang berharga, lemak misalnya, susu manusia. Ini trigliserida dan lemak

fungsional serupa mudah diperoleh dengan acidolysis dari fraksi minyak kelapa

sawit yang kaya 2-palmitoil gliserol dengan asam lemak tak jenuh (s).

Acidolysis, dikatalisis oleh lipase 1,3-spesifik, digunakan dalam penyusunan

produk nutrisi penting yang umumnya mengandung lemak rantai asam

menengah. Lipase sedang diselidiki secara ekstensif sehubungan dengan

modifikasi minyak bernilai tinggi asam lemak tak jenuh ganda seperti asam

arakidonat, asam eicosapentaenoic, dan asam docosahexaenoic. Pengayaan

substansial di kandungan asam lemak tak jenuh ganda fraksi mono-gliserida

telah dicapai oleh alkoholisis lipase-katalis atau hydrolysis.

5. Lipase dalam sintesis surfaktan

Poligliserol dan karbohidrat ester asam lemak banyak digunakan sebagai

detergen industri dan sebagai pengemulsi dalam berbagai besar formulasi

makanan (spread yang rendah lemak, saus, es krim, mayonnaises). Enzymic

sintesis surfaktan fungsional yang sama telah dilakukan pada suhu sedang (60-

80 ° C) dengan regioselectivity sangat baik. Adelhorst et al telah melakukan

esterifikasi pelarut-bebas dari sederhana alkil-glikosida menggunakan asam

lemak cair dan lipase amobil antarctica Candida. Fregapane et al diperoleh

mono-dan di-esters dari monosakarida dalam hasil tinggi, menggunakan asetal

gula sebagai bahan awal. Lipase dari A. terreus mensintesis biosurfaktan oleh

transesterifikasi antara minyak alami dan gula alcohol. Lipase juga dapat

mengganti phospholipases dalam produksi lysophospholipids. Lipase Miehei

Mucor telah digunakan untuk transesterifikasi fosfolipid dalam berbagai alcohol

primer dan sekunder. Lipase juga mungkin berguna dalam sintesis berbagai

macam surfaktan bio-degradable amfoter, ester asam amino yaitu berbasis, dan

amides.

6. Lipase dalam sintesis bahan-bahan untuk produk perawatan pribadi

Page 23: Enzim Lipase

Unichem Internasional baru-baru ini meluncurkan produksi palmitat

isopropyl miristat, isopropil, dan 2-ethylhexyl palmitate untuk digunakan

sebagai emolien dalam produk perawatan pribadi seperti minyak kulit dan

krim anti sinar matahari, dan sabun mandi. Ester Wax memiliki aplikasi serupa

dalam produk perawatan pribadi dan sedang diproduksi secara enzimatis,

menggunakan lipase C. cylindracea, dalam sebuah batch bioreactor.

7. Lipase di farmasi dan bahan kimia pertanian

Utilitas lipase dalam penyusunan synthons kiral baik diakui dan

didokumentasikan. Beberapa proses baru saja dikomersialkan yang telah

dijelaskan oleh Sainz-Diaz et al., dan Davis et al. Resolusi asam 2-halopropionic,

bahan awal untuk sintesis herbisida phenoxypropionate, adalah proses

berdasarkan esterifikasi selektif (S)-isomer dengan butanol, yang dikatalisis

oleh lipase pankreas babi dalam hexane anhidrat. Contoh lain yang

mengesankan dari aplikasi komersial lipase dalam resolusi campuran rasemat

adalah hidrolisis epoxyester alcohol. Produk reaksi, ester (R)-glisidil dan (R)-

glycidol dapat segera dikonversi ke (R) - dan (S)-glycidyltosylates yang

intermediet menarik bagi penyusunan optik blocker ß aktif-dan berbagai

macam produk lainnya . Sebuah teknologi yang sama telah dikomersialisasikan

untuk menghasilkan 2 (R), glycidate 3 (S)-methylmethoxyphenyl, yang

intermediate kunci dalam pembuatan obat kardiovaskular optik Diltiazem

murni.

Lipase memiliki aplikasi sebagai katalis industri untuk resolusi alkohol

rasemat dalam penyusunan beberapa prostaglandin, steroid, dan analog

nukleosida carbocyclic. Regioselective modifikasi senyawa organik

polifungsional daerah lain belum berkembang pesat aplikasi lipase, khususnya

di bidang AIDS treatment. Lipase dari A. carneus dan A. terreus menunjukkan

kemo-dan regiospecificity di hidrolisis peracetates dari farmasi penting

polifenolik compounds. Lipase juga berguna dalam sintesis dari sucralose

sweetner buatan oleh hidrolisis regioselective dari Octa-acetylsucrose.

8. Lipase dalam sintesis polimer

Stereoselektivitas lipase berguna untuk sintesis polymer optik aktif.

Polimer ini adalah reagen asimetris, dan digunakan sebagai pernyerap. Di

bidang kristal cair, monomer yang sesuai dapat dibuat dengan transesterifikasi

lipase-katalis dari alcohol, yang dengan alkohol rasemat bisa disertai dengan

resolution. Penggunaan glycidyltosylates kiral untuk persiapan crystal

Page 24: Enzim Lipase

feroelektrik cair juga telah dilaporkan. Dengan demikian, enzim ini telah

melakukan diversifikasi penggunaan komersial, baik dalam hal skala dan

proses. Lipase telah bekerja dengan sukses di industri makanan serta teknologi

tingkat tinggi dalam produksi bahan kimia dan farmasi. Selanjutnya, enzim ini

memiliki potensi di bidang baru, untuk lipase misalnya telah berhasil telah

digunakan dalam pembuatan kertas - ternyata, perlakuan pulp dengan lipase

menghasilkan produk yang berkualitas tinggi dan kebutuhan pembersihan

berkurang. Demikian pula, enzim juga telah digunakan dalam hubungan dengan

koktail mikroba untuk pengobatan limbah lemak yang kaya dari pabrik es krim.

Page 25: Enzim Lipase

BAB IV

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari pembahasan dapat ditarik kesimpulan bahwa:

1. Jenis mikroorganisme penghasil enzim lipase adalah Kelompok yeast dari

Candida rugosa, kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium

aurantiogriseum. Adapun pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan

adalah dari genera Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes,

Arthrobacter, Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas, dan

Staphyloccus.

2. Produksi enzim lipase dari bakteri diawali dengan penanaman bakteri dalam

media fermentasi yang terdiri dari komposisi gum arab 5%, pepton 1%, ,

minyak zaitun 10% dengan kondisi optimum pertumbuhan bakteri sebagai

berikut: waktu inkubasi 24 jam, suhu 35°C, pH 8.

3. Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan

fraksinasi bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat

kejenuhan (0-20%), (20-40%), (40-60%), (60-80%) dan 80-100%), dialsis

dan kromatografi kolom.

4. Enzim lipase hasil pemurnian memiliki karakteristik aktivitas optimum pada

pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit dengan nilai KM = 0,07

mg substrat/ml dan Vmaks = 1,506 mol minyak /ml enzim.menit.μ

5. Aktivitas esterifikasi enzim lipase mengalami peningkatan seiring dengan

bertambahnya kemurnian enzim yaitu dari 2,38 mmol/ml enzim.menit untuk

ekstrak kasar, menjadi 3,81 mmol/ml enzim.menit untuk fraksi amonium

sulfat, selanjutnya meningkat kembali menjadi 4,29 mmol/ml enzim.menit

untuk dialisis dan 5,24 mmol/ml enzim.menit untuk hasil kromatografi

kolom.

6.

Page 26: Enzim Lipase

DAFTAR PUSTAKA

Annisa, Y. 2006. Studi Penentuan Aktivitas Enzim Lipase dari Bakteri Proteus vulgaris Galur Lokal PP-1 dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS dan Metode Titrimetri. Skripsi Sarjana Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Basri, M., Ampon, K., Wan Yunus, W.M.Z., Razak, C.N.A., dan Saleh, A.B 1995. Enzymic Synthesis of Fatty Esters by Hydropobic Lipase Derivates Immobilized on Organic Polymer Beads. JAOCS 72(4):407-411.

Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12. Punjab University. Chandigarh.

Efendi, S. 2001. Karakterisasi Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas Esterifikasi dari Kpaang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia I. Erlangga. Jakarta.

Nuraida, L. 2000. Eksplorasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dengan aktivitas Esterifikasi Tinggi dari Kapang Indigenus. Laporan Tahunan Pertama Penelitian Hibah Bersaing VIII/I Perguruan Tinggi. FATETA-IPB. Bogor.

Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya.

Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.

Suhendra, L., Trenggono, Hidayat, C. 2004. Aktifitas Hidrolisis dan Esterifikasi Lipase Ekstrak Kecambah Biji Wijen (Sesamun Indicum). Prosiding Seminar Nasional dan Kongres Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia (PATPI). Jakarta, 17-18 Desember 2004.

Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York.