BAB IPENDAHULUAN

A. Latar BelakangElektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negative dan sebaliknya. Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju elektrode positifElektroforesis dengan Agarosa merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.1 Rumusan masalah1. Apa yang dimaksud dengan Elektroporesa DNA?2. Bagaimana prinsip metode Elektroporesa DNA?3. Sampel apa yang digunakan untuk Elektroporesa DNA?4. Apa fungsi metode Elektroporesa DNA?5. Bagaimana cara kerja Elektroporesa DNA?6. Apa keuntungan dan kekurangan Elektroporesa DNA?

1.2 Tujuan1. Mengetahui definisi, prinsip, fungsi dan cara kerja Elektroporesis DNA2. Mengetahui keuntungan dan kekurangan metode Elektroporesis DNA

BAB IIPEMBAHASAN

A. Definisi Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.DNA atau DeoxyriboNucleic Acid merupakan asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang genetika. DNA inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus dari manusia. DNA ini akan menjadi cetak biru (blue print) ciri khas manusia yang dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya. Sehingga dalam tubuh seorang anak komposisi DNA nya sama dengan tipe DNA yang diturunkan dari orang tuanya. Sedangkan tes DNA adalah metode untuk mengidentifikasi fragmen-fragmen dari DNA itu sendiri atau secara sederhananya adalah metode untuk mengidentifikasi, menghimpun dan menginventarisir file-file khas karakter tubuh.DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

B. Prinsip Elektroporesis DNA Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

C. Sampel Elektroforesis DNAHampir semua sampel biologis tubuh dapat digunakan untuk sampel tes DNA, tetapi yang sering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut pada pipi bagian dalam (buccal swab), dan kuku.Sampel DNA yang digunakan bisa dari inti sel maupun mitokondrianya. Namun yang paling akurat adalah inti sel karena inti sel tidak bisa berubah. Biasanya yang digunakan adalah sampel darah karena lebih gampang. Tapi sel darah yang di ambil adalah sel darah putih, bukan sel darah merah, karena sel darah merah tidak mempunyai inti sel.Untuk kasus-kasus forensik, sperma, daging, tulang, kulit, air liur atau sampel biologis apa saja yang ditemukan di tempat kejadian perkara (TKP) dapat dijadikan sampel tes DNA. Kita tidak perlu mengambil banyak. Bahkan, jika hanya ditemukan puntung rokok, maka yang diperiksa adalah DNA inti sel yang terdapat dalam epitel bibir karena ketika rokok dihisap dalam mulut, epitel dalam bibir ada yang tertinggal di puntung rokok. Epitel ini masih menggandung unsur DNA yang dapat dilacak. Hal ini karena bercak sperma, rambut, dan bercak darah bisa diisolasi DNA-nya dan bisa diperbanyak jutaan kali dan kemudian bisa diperiksa untuk identifikasi.Untuk kasus pemerkosaan, yang diperiksa spermanya tetapi yang lebih utama adalah kepala spermatozoanya yang terdapat DNA inti sel didalamnya. Sedangkan jika di TKP ditemukan satu helai rambut maka sampel ini dapat diperiksa asal ada akarnya. Namun untuk DNA mitokondria tidak harus ada akar, cukup potongan rambut karena diketahui bahwa pada ujung rambut terdapat DNA mitokondria sedangkan akar rambut terdapat DNA inti sel.DNA yang biasa digunakan dalam tes ada dua yaitu DNA mitokondria dan DNA inti sel. Perbedaan kedua DNA ini hanyalah terletak pada lokasi DNA tersebut berada dalam sel, yang satu dalam inti sel sehingga disebut DNA inti sel, sedangkan yang satu terdapat di mitokondria dan disebut DNA mitokondria. Untuk tes DNA, sebenarnya sampel DNA yang paling akurat digunakan dalam tes adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa berubah. DNA dalam mitokondria dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu yang dapat berubah seiring dengan perkawinan keturunannya. Tetapi karena keunikan dari pola pewarisan DNA mitokondria menyebabkan DNA mitokondria dapat dijadikan sebagai marka (penanda) untuk tes DNA dalam upaya mengidentifikasi hubungan kekerabatan secara maternal.

D. Fungsi Elektroforesis DNAElektroforesis berfungsi untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNAfinger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA.Elektroporesis gel memiliki komponen yang berbeda-beda fungsinya, yaitu sebagai berikut:1. Comb, digunakan untuk mwmbentuk well pada gel agarosa2. Tray, digunakan untuk setakan gel agarosa3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa4. Sumber listrik, digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesisFungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :1. Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik.2. Loading dye berfungsisebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.3. Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.4. UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.5. Aquades sebagai pelarut6. Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa7. TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH8. Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram9. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA10. Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa11. Tangki elektroforesis untuk running DNA12. Mikropipetuntuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye13. Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye14. Sarung tanganuntuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

E. Cara Kerja Elektroforesis DNA1. Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida 2mL dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengancombnya dan dibiarkan sampai mengeras.2. Gel dimasukkan kedalamelectrophoresis chamberdan ditambahkan larutanrunning bufferserta etidium bromida.3. Sampel DNA hasil PCR dicampurkan denganloading bufferkemudian dimasukkan ke dalamwellpada gel dengan menggunakan mikropipet.4. Marka DNA dimasukkan.5. Penutupelectrophoresischamberdipasang danpower supplydinyalakan.6. Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar UV.

F. Keuntungan Dan KekuranganAgarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang.

7