1

1

Penurunan produksi enzim eksoprotease aeromonas hydrophila oleh ekstrak

buah tomat

(lycopersicon esculentum mill.)

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna mencapai derajat Sarjana Sains

Oleh :

Nur Aini

NIM. M.0402040

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2006

2

2

PENGESAHAN

SKRIPSI PENURUNAN PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE

Aeromonas hydrophila OLEH EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.)

Oleh :

Nur Aini NIM. M0402040

telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 24 Agustus 2006

dan dinyatakan telah memenuhi syarat

Surakarta,

Penguji III/Pembimbing I Penguji I Prof. Drs. Sutarno, M.Sc.Ph.D Dra. Ratna Setyaningsih, M. Si. NIP. 131 649 948 NIP. 132 240 377 Penguji IV/Pembimbing II Penguji II Ari Susilowati, M. Si. Solichatun, M. Si. NIP. 132 169 255 NIP. 132 162 554

Mengesahkan : Dekan F MIPA Ketua Jurusan Biologi Drs. Marsusi, M. S. Drs. Wiryanto, M. Si. NIP. 130 906 776 NIP. 131 124 613

3

3

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri

dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar

kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat

yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis

diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila di kemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar

kesarjanaan yang diperoleh dapat ditinjau dan atau dicabut.

Surakarta, Agustus 2006

Nur Aini NIM. M0402040

4

4

ABSTRAK

Nur Aini. 2006. PENURUNAN PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE Aeromonas hydrophila OLEH EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.). Jurusan Biologi. F.MIPA. UNS Aeromonas hydrophila bersifat patogen pada ikan. Salah satu faktor virulensinya adalah enzim eksoprotease. Produksi enzim eksoprotease diatur oleh sistem quorum sensing. Sistem quorum sensing ini merupakan sistem komunikasi interseluler bakteri dengan menggunakan molekul sinyal C4-HSL. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat dihambat dengan menggunakan senyawa penghambat sistem quorum sensing. Penghambatan quorum sensing A. hydrophila dapat dilakukan oleh senyawa yang analog dengan molekul sinyal C4-HSL. Pada penelitian ini, senyawa yang diduga mampu menghambat quorum sensing sebagai analog molekul sinyal C4-HSL adalah senyawa furanon dari buah tomat. Penghambatan quorum sensing dapat diketahui dengan menurunnya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah perlakuan ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6% dan 8%. Hasil pengujian produksi enzim eksoprotease secara kualitatif menunjukkan bahwa ektrak n-hexan buah tomat tidak menghambat pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% menghambat produksi enzim eksoprotease tetapi mempengaruhi pertumbuhannya. Sedangkan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% menghambat produksi enzim eksoprotease tanpa mempengaruhi pertumbuhannya. Secara kuantitatif ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% mampu menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila sebesar 71,68% tanpa menghambat pertumbuhannya. Kata Kunci : penurunan, produksi enzim eksoprotease, Aeromonas hydrophila,

quorum sensing, buah tomat

5

5

ABSTRACT

Nur Aini. 2006. REDUCTION OF EXOPROTEASE PRODUCTION IN Aeromonas hydrophila by TOMATO FRUITS EXTRACT (Lycopersicon esculentum Mill.). Department of Biology. Faculty of Mathematic and Natural Science. Sebelas Maret University Aeromonas hydrophila is pathogenic bacteria in fish. One of it’s virulence factors is exoprotease. The production of exoprotease is controlled by quorum sensing system. Quorum sensing is an intercelluler communication of bacteria that use signal molecules C4-HSL. The A. hydrophila exoprotease production can be blocked using quorum sensing inhibitors. The inhibition of A. hydrophila quorum sensing can be done by C4-HSL analogs molecules. In this research, molecules that was predicted as quorum sensing inhibitors that act as C4-HSL analog molecules was furanon from tomato fruits. The inhibition of A. hydrophila quorum sensing could be shown by reduction of exoprotease production. The aim of this research was to know the reduction of A. hydrophila exoprotease production by extract n heksan, etil asetat, and metanol of tomato fruits with concentration 0%, 2%, 4%, 6%, and 8% respectively. The qualitative exoprotease assay result showed that the n-hexan extract of tomato had no effect on growth and exoprotease production of A. hydrophila. 4% ethyl acetate extract of tomato could inhibit exoprotease production, but affecting A. hydrophilla growth. While 4% methanol extract of tomato could inhibit exoprotease production, without affecting A. hydrophilla growth. Quantitative exoprotease assay showed that the 4% of methanol extract could inhibit exoprotease production 71,68% without affect growth of A. hydrophila. Keywords : reduction, exoprotease production, Aeromonas hydrophila,

quorum sensing, tomato fruits

6

6

MOTTO

“Jarak antara masalah dan solusi adalah sejauh jarak antara lutut dengan lantai untuk bersujud”

****

“Perhatikanlah orang yang mendapat nikmat lebih rendah daripada selalu memperhatikan orang

yang mendapat nikmat lebih tinggi dari kalian, maka demikian itu sungguh akan membuat kalian

tidak meremehkan karunia nikmat Alloh atas kalian” (Hadists)

****

PERSEMBAHAN

Karya ini kupersembahkan kepada :

7

7

v Kedua orang tuaku, hanyalah Alloh yang mampu membalas semua

pengorbananmu

v Adik beserta keluargaku

v Teman dan Saudara yang selalu menyertai langkah-langkahku

v Almamaterku

KATA PENGANTAR

8

8

Aeromonas hydrophila menyebabkan penyakit Motile Aeromonads

Septicemia (MAS) pada ikan. Pada umumnya penanggulangan penyakit MAS ini

masih bertumpu pada penggunaan antibiotik yang akan membunuh bakteri A.

hydrophila, namun ternyata timbul dampak negatif yaitu meluasnya resistensi

bakteri terhadap senyawa antibiotik, sehingga penggunaan antibiotik ini menjadi

kurang efektif.

Adanya penemuan bahwa faktor virulensi bakteri ternyata diatur oleh

sistem quorum sensing memberikan alternatif baru untuk mengatasi penyakit

infeksi bakteri yaitu dengan cara menghambat sistem quorum sensing bakteri ini.

Faktor virulensi A. hydrophila yang berupa produksi enzim eksoprotease juga

diatur oleh quorum sensing dengan molekul sinyal C4-HSL (N-Butanoyl-L-

Homoserine Lactones), sehingga penghambatan produksi enzim eksoprotease

dapat dilakukan dengan menghambat sistem quorum sensing_nya.

Penghambatan sistem quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa yang

analog dengan molekul sinyal C4-HSL. Salah satunya adalah senyawa furanon

dalam buah tomat. Penelitian ini berjudul Penurunan Produksi Enzim

Eksoprotease Aeromonas hydrophila Oleh Ekstrak Buah Tomat (L. esculentum

Mill.). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya penurunan

produksi enzim eksoprotease A. hydrophila oleh ekstrak buah tomat.

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN ....................................................................... ii

9

9

HALAMAN PERNYATAAN ....................................................................... iii

ABSTRAK ..................................................................................................... iv

ABSTRACT ................................................................................................... v

MOTTO ......................................................................................................... vi

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... vii

KATA PENGANTAR ................................................................................... viii

DAFTAR ISI .................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii

BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................. 1

A. Latar Belakang Masalah ............................................................... 1

B. Perumusan Masalah ..................................................................... 3

C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian ....................................................................... 4

BAB II. LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka .......................................................................... 5

B. Kerangka Pemikiran .................................................................... 18

C. Hipotesis ....................................................................................... 20

BAB III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian ................................................... 21

B. Alat dan Bahan .......................................................................... 21

C. Cara Kerja ................................................................................. 22

D. Analisis Data ............................................................................. 27

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Kepadatan A. hydrophila yang Memenuhi Quorum Sensing..... 28

B. Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara Kualitatif. 29

C. Pertumbuhan A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Buah Tomat

(L. esculentum Mill.) .................................................................. 43

D. Penurunan Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara

Kuantitatif .................................................................................. 45

10

10

BABV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan .................................................................................. 50

B. Saran ............................................................................................. 50

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 51

LAMPIRAN ................................................................................................... 56

HALAMAN UCAPAN TERIMA KASIH .................................................... 57

RIWAYAT HIDUP PENULIS ...................................................................... 59

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Nilai OD dan jumlah bakteri A. hydrophila pada hitungan

cawan………………………………………………………

28

11

11

Tabel 2. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak

n-heksan buah tomat (L. esculentum Mill.) …………………

33

Tabel 3. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak

etil asetat buah tomat (L. esculentum Mill.) ………………….

36

Tabel 4. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak

metanol buah tomat (L. esculentum Mill.) …………………

41

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Sistem quorum sensing oligopeptida pada bakteri gram positif ………………………………………………………….

9

12

12

Gambar 2. Sistem quorum-sensing Lux IR pada bakteri gram negatif…………………………………………………………..

10

Gambar 3. Struktur furaneol………………………………………………. 16

Gambar 4. Struktur C4-HSL………………………………………………. 17

Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7.

Struktur halogen furanon dari Delisea pulchra ……………… Kerangka pemikiran………………………………………….. Kurva standar A. hydrophila…………….………………….

17 19 29

Gambar 8.

Gambar 9.

Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan

ekstrak n heksan buah tomat (L. esculentum

Mill.)………………………………………………………….

Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan

ekstrak etil asetat buah tomat (L. esculentum

Mill.)………………………………………………………….

32

35

Gambar10. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan

ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)

39

Gambar 11. Kurva pertumbuhan A. hydrophila…………………………… 44

Gambar 12. Kurva produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ................. 47

Gambar 13.

Histogram produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada

jam ke-4……………………………………………………..

48

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Komposisi Media………………………………………….. 56

13

13

BAB I

PENDAHULUAN

14

14

A. Latar Belakang Masalah

Aeromonas hydrophila yang ditemukan paling banyak di perairan air tawar

bersifat patogen terhadap ikan, dan hampir semua ikan air tawar rentan terhadap

serangan bakteri ini (Noga, 1995). Aeromonas hydrophila menyebabkan penyakit

Motile Aeromonad Septicemia (MAS) (Fryer and Bartholomew, 1996). Di Jawa

bakteri ini secara luas menyebabkan kematian ikan budidaya, yang dilaporkan

pertama kali tahun 1980 dan mengakibatkan kerugian sangat besar dalam

perikanan air tawar (Afrianto dan Liviawati, 1992). Oleh sebab itu, perlu adanya

tindakan penanganan yang efektif untuk mengatasi patogenisitas dari A.

hydrophila.

Aeromonas hydrophila mampu menghasilkan endotoksin dan produk

ekstraseluler seperti hemolisin, sitotoksin, enterotoksin, leukosidin, dan protease

(Allan dan Stevenson, 1981). Enzim eksoprotease merupakan faktor virulensi

utama yang bersifat proteolitik, dapat mendegradasi jaringan otot, sehingga

merusak jaringan tubuh inang dan akan menimbulkan infeksi pada jaringan inang

tersebut (Secades and Guijarro, 1999).

Produksi eksoprotease A. hydrophila diatur oleh suatu molekul sinyal N-

Butanoyl-L-Homoserine Lactone (C4-HSL). Molekul sinyal ini juga berfungsi

sebagai alat komunikasi antar sel pada suatu populasi bakteri sehingga disebut

sistem quorum sensing (Swift et al., 1997). Dengan adanya molekul sinyal,

bakteri mampu mengetahui kehadiran bakteri lain di lingkungannya. Konsentrasi

molekul sinyal sebanding dengan jumlah bakteri yang ada. Semakin banyak

populasi bakteri, semakin tinggi konsentrasi C4-HSL di lingkungan, dan apabila

15

15

telah mencapai kepadatan tertentu C4-HSL ini akan mengaktifkan gen penyandi

enzim eksoprotease (Taga and Bassler, 2003). Dengan demikian sistem quorum

sensing tersebut merupakan target utama dalam upaya pengendalian infeksi A.

hydrophila, yaitu dengan merusak sistem quorum sensingnya sehingga produksi

enzim eksoprotease menurun dan patogenisitas A. hydrophila menurun tanpa

harus membunuh bakteri tersebut.

Perusakan sistem quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa kemo

terapeutik yaitu dengan menghambat molekul sinyal C4-HSL (Hentzer and

Givskov, 2003). Dengan terhambatnya C4-HSL, maka produksi enzim

eksoprotease menurun sehingga patogenisitas A. hydrophila dapat diturunkan

(Lynch, 2002).

Berdasarkan penelitian Rasmussen et al. (2000), halogen furanon yang

merupakan metabolit sekunder dari makroalga laut Delisea pulchra mampu

menghambat molekul sinyal N-Butanoyl-L–Homoserine Lactone pada Serratia

liquefaciens sehingga menghambat motilitas Serratia liquefaciens. Furanon juga

dapat menghambat Acyl Homoserine Lactone yang mengontrol produksi faktor

virulensi dan patogenisitas Pseudomonas aeruginosa (Hentzer and Givskov,

2003). Selain sebagai metabolit sekunder pada D. pulchra, senyawa furanon ini

juga terdapat secara alami sebagai senyawa cita rasa (flavour compound) pada

tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) (Martinelli et al., 2004; Buttery et al.,

2001). Hal ini menjadi dasar untuk melakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak

buah tomat terhadap produksi C4-HSL A. hydrophila. Penghambatan C4-HSL

pada A. hydrophila dapat dibuktikan dengan penurunan produksi enzim

16

16

eksoprotease yang dihasilkan. Produksi enzim eksoprotease diketahui dengan cara

mengukur aktivitasnya. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk

mengukur aktivitas enzim eksoprotease dari A. hydrophila setelah pemberian

ekstrak buah tomat dengan pelarut n heksan, etil asetat, dan metanol.

B. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai

berikut :

1. Apakah terdapat penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila

setelah pemberian ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L.

esculentum Mill.) dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6%, dan 8% ?

2. Jenis ekstrak dan konsentrasi ekstrak buah tomat (L. esculentum Mill.) mana

yang tepat untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ?

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui adanya penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila

setelah pemberian ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L.

esculentum Mill.) dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6%, dan 8%

2. Mengetahui jenis dan konsentrasi ekstrak buah tomat (L. esculentum Mill.)

yang tepat untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar penggunaan ekstrak buah tomat

(L. esculentum Mill.) sebagai pencegah infeksi pada ikan yang disebabkan bakteri

17

17

A. hydrophila dengan cara menurunkan produksi enzim eksoprotease A.

hydrophila.

BAB II

LANDASAN TEORI

18

18

A. Tinjauan Pustaka

1. Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila termasuk dalam familia Vibrionaceae. Aeromonas

hydrophila tersebar di lingkungan akuatik, bersifat positif oksidatif, fakultatif

anaerob, dapat memfermentasi glukosa, dan merupakan bakteri gram negatif

(Janda and Abbott, 1998). Aeromonas hydrophila berbentuk batang, bersifat

motil dengan diameter 0,3-1,0 µm dan panjang 1,0-3,5 µm, tidak berspora, tidak

berkapsula, tumbuh optimum pada suhu 28oC (Bottarelli and Ossiprandi, 1999).

Aeromonas hydrophila ditemukan di perairan air tawar terutama yang

mengandung bahan organik tinggi, dapat diisolasi dari air payau, perairan pantai

dan perairan terklorinasi (Alavandi et al., 1998). Aeromonas hydrophila juga

terdapat pada air minum mineral (Bottarelli and Ossiprandi, 1999). Selain itu,

Aeromonas hydrophila juga dapat diisolasi dari produk makanan dingin, produk

susu, produk ternak ruminansia, dan produk unggas (Ibrahim and Mac Rae, 1991).

Di daerah iklim sedang, bakteri ini dapat mencapai populasi tertinggi pada

akhir musim panas atau awal musim gugur saat temperatur 20-25°C dan jarang

ditemukan pada musim dingin (Gavriel et al., 1998). Pada media air laut steril

yang miskin nutrien, populasi A. hydrophila menurun 0,1 CFU/ml setelah 3-5

minggu (Maalej et al., 2004). Sedangkan pada media air destilasi steril yang

miskin nutrien, populasi A. hydrophila menurun 0,1 CFU/ml dalam jangka waktu

7 minggu pada suhu pertumbuhan 4°C (Mary et al., 2002). Berdasarkan penelitian

Sautor et al. (2003), pertumbuhan maksimum A. hydrophila terjadi pada suhu

19

19

30°C, pH 7, dan aw (water activity) 0,99, sedangkan pada suhu 10°C, pH 7, dan

aw 0,95 pertumbuhan A. hydrophila berjalan lambat.

2. Patogenisitas dan Penyakit yang Disebabkan oleh A. hydrophila

Aeromonas hydrophila yang tersebar luas di lingkungan akuatik mudah

melakukan kontak dengan hewan akuatik khususnya ikan dan amfibi. Kontak

antara bakteri dan hewan ini dapat menyebabkan infeksi bahkan dapat

mengancam kelangsungan hidup hewan akuatik (Hayes, 2000).

Aeromonas sering menyerang luka pada permukaan tubuh, umumnya

bersamaan dengan jamur air atau parasit. Penyakit ikan yang disebabkan A.

hydrophila disebut Motile Aeromonad Septicemia (MAS) atau Hemorrhagic

Septicemia yang ditandai dengan luka-luka pada permukaan tubuh, pengelupasan

sisik, pendarahan pada insang dan anus (Noga, 1995). Selain itu juga dikenal

dengan ulcer disease (borok bernanah) dan red sore disease (bercak merah).

Sedangkan Hayes (2000) menyebutkan bahwa A. hydrophila menimbulkan

penyakit infectious abdominal dropsy yang ditandai dengan adanya cairan dalam

rongga peritoneal, anemia, pembengkakan hati dan ginjal serta pendarahan pada

usus, otot, dan hati.

Ikan yang terinfeksi A. hydrophila biasanya memperlihatkan gejala-gejala

seperti warna tubuh ikan menjadi gelap, kemampuan berenang menurun, mata

rusak dan agak menonjol, sisik terkuak, seluruh siripnya rusak, insangnya rusak

dan berwarna merah keputihan, kulit menjadi kasat dan timbul pendarahan, luka

20

20

borok, perut kembung (dropsy), dan apabila dilakukan pembedahan maka akan

kelihatan pendarahan pada hati, ginjal dan limpa (Kordi, 2004).

Patogenisitas A. hydrophila ini disebabkan oleh adanya faktor virulensi

yang berupa:

a. Komponen permukaan sel berupa : pili, S-layer dan lipopolisakarida

(LPS).

b. Faktor ekstraseluler, berupa siderofor, enterotoksin, Glysero-

phospholipid Cholesterol Acetyltransferase (GCAT), hemolisin,

lipase, dan protease (Swift et al., 1999).

Berdasarkan penelitian Merino et al. (1992), A. hydrophila yang

ditumbuhkan pada suhu 20°C lebih virulen pada ikan dibandingkan suhu 37°C

karena pada suhu 20°C terjadi peningkatan aktivitas ekstraseluler. Aktivitas

hemolitik A. hydrophila maksimum pada suhu 35°C selama 30 jam, sedangkan

aktivitas proteolitiknya maksimal pada suhu 30°C dalam jangka waktu 36 jam

(Khalil, 1997).

3. Sistem Quorum Sensing

Sistem quorum sensing ditemukan pertama kali dalam mengontrol

ekspresi bioluminescen pada Vibrio fischeri (Parsek and Greenberg, 1997). Sistem

quorum sensing merupakan kemampuan bakteri untuk berkomunikasi dan

mengatur tingkah lakunya melalui molekul sinyal. Dengan sistem quorum

sensing, bakteri mampu memonitor kehadiran bakteri lain di sekitarnya dengan

memproduksi dan merespon molekul sinyal yang dikenal dengan autoinducer.

Konsentrasi autoinducer sebanding dengan jumlah bakteri yang ada. Jadi dengan

21

21

mendeteksi autoinducer, bakteri mampu mengetahui keberadaan bakteri di

sekitarnya. Autoinducer direspon melalui perubahan ekspresi gen sehingga

membentuk tingkah laku tertentu, misalnya : produksi enzim ekstraseluler pada

Pseudomonas aeruginosa dan Erwinia carotovora, bioluminescen pada Vibrio

fishceri dan Vibrio harveyi (Bassler et al., 1993), produksi antibiotik pada E.

carotovora dan pembentukan biofilm pada P. aeruginosa (Taga and Bassler,

2003). Menurut Eberl (1999) molekul sinyal Acyl Homoserine Lactone (AHL)

berfungsi ekologis yaitu untuk berinteraksi dengan populasi bakteri lain atau

dengan inang eukariotik.

Sistem quorum sensing pada bakteri dibedakan menjadi 2 macam yaitu:

gram positif oligopeptida dan gram negatif lux IR.

a. Gram positif oligopeptida

Bakteri gram positif menggunakan oligopeptida sebagai molekul

sinyalnya. Prekursor peptida disintesis, diproses dan dimodifikasi menjadi

molekul oligopeptida yang matang, kemudian dikeluarkan melalui kompleks

transport ATP binding cassette. Konsentrasi autoinducer meningkat sejalan

dengan pertambahan jumlah sel. Pada konsentrasi tinggi, autoinducer dapat

dideteksi oleh sensor kinase. Informasi ini dikirim ke dalam sel melalui

fosforilasi, dan berhenti pada perubahan yang sesuai untuk ekspresi gen (Gambar

1) ( Taga and Bassler, 2003).

22

22

dimodifikasi

Prekursor peptida Gen target

(Schauder and Bassler, 2001)

Gambar 1. Sistem quorum sensing oligopeptida pada bakteri gram positif. Prekursor spesifik oligopeptida diproduksi, lalu dimodifikasi dan diproses. ATP binding cassete (ABC) mengeluarkan autoinducer oligopeptida yang matang keluar membran sel. Bila konsentrasi autoinducer tinggi, autoinducer dapat dideteksi oleh dua komponen sinyal transduksi. Secara spesifik sensor protein kinase mengenali autoinducer dan melakukan autofosforilasi pada histidin (H) residu, lalu bergabung dengan protein regulator dan mengadakan fosforilasi pada residu aspartat (D). Protein regulator yang terfosforilasi ini berikatan dengan gen target dan menyebabkan terekspresinya gen target.

b. Gram negatif Lux IR

LuxI merupakan protein yang mengkatalis pembentukan autoinducer AHL

(Acyl Homoserine Lactone) yang tersebar ke dalam dan keluar sel. LuxR adalah

tipe protein yang berikatan dengan autoinducer yang spesifik ketika konsentrasi

autoinducer mencapai tingkat tertentu. Ikatan antara LuxR dengan AHL akan

mengenali sekuen DNA tertentu sehingga mengaktifkan transkripsi dari sekuen

gen tersebut (Gambar 2) (Taga and Bassler, 2003). Masing-masing bakteri

23

23

mempunyai molekul sinyal dan protein regulator yang spesifik (Hentzer and

Givskov, 2003). Pada bakteri gram negatif, sistem quorum sensing berkaitan

dengan asosiasinya dengan inang, termasuk metabolit sekunder dan produksi

faktor virulen (Finch et al., 1998).

Gen target

(Schauder and Bassler, 2001).

Gambar 2. Sistem quorum sensing Lux IR pada bakteri gram negatif. Protein Lux I mengkatalis pembentukan molekul autoinducer (pentagon hijau). Autoinducer berdifusi secara bebas melewati membran sel dan berakumulasi. Pada konsentrasi autoinducer tinggi, protein Lux R akan berikatan dengan autoinducer. Ikatan antara autoinducer dengan Lux R ini akan mengaktifkan transkripsi gen target.

24

24

4. Enzim Eksoprotease

Aeromonas hydrophila menghasilkan enzim eksoprotease yang merupakan

penyebab virulensi. Protease yang bersifat proteolitik mampu mengambil

persediaan nutrien dan melawan pertahanan tubuh inang sehingga berfungsi untuk

berkembangnya penyakit pada inang. Enzim protease pada suatu bakteri berperan

memecah ikatan peptida protein sehingga dihasilkan komponen asam amino

dalam bentuk bebas yang merupakan sumber nutrien bagi bakteri. Protease

mampu menghidrolisis kasein dan elastin (Cascon et al., 2000). Enzim

eksoprotease ini juga dapat merusak atau mendegradasi jaringan konektif atau

jaringan otot seperti kolagen, gelatin, dan sebagainya sehingga dapat merusak

jaringan tubuh inang. Enzim eksoprotease merupakan faktor virulensi utama

bakteri patogen, berperan dalam perusakan jaringan inang yang akan

menimbulkan infeksi pada jaringan inang tersebut (Secades and Guijarro, 1999).

Enzim eksoprotease A. hydrophila tahan terhadap pemanasan 56°C dan

pada penyimpanan 4°C atau -20°C (Nieto and Ellis, 1986). Berdasarkan penelitian

McMahon (2004), ekspresi enzim eksoprotease A. hydrophila tergantung pada

suhu inkubasi dan kondisi udara. Pada kondisi udara yang berbeda-beda, A.

hydrophila mengeluarkan enzim protease yang sama, namun aktivitasnya

bervariasi sesuai kondisinya.

Enzim eksoprotease pada A. hydrophila ada 2 macam yaitu : serin protease

dan metaloprotease. Serin protease merupakan enzim protease yang mempunyai

residu serin dalam lokasi aktifnya, sedangkan metalloprotease adalah enzim

protease yang keaktifannya tergantung pada adanya metal. Pada A. hydrophila ini,

25

25

Serin protease, memiliki berat molekul 22 kD, stabil pada suhu 56°C selama 10

menit, memiliki aktivitas sitotoksik dan memiliki nilai LD50 sebesar 50 ng/g ikan.

Sedangkan metalloprotease, memiliki berat molekul 38 kD, stabil pada suhu 56°C

selama 10 menit, tidak memiliki aktivitas sitotoksik dan memiliki nilai LD50

sebesar 150 ng/g ikan ( Rodrigues et al., 1992).

Produksi enzim serin protease dan metalloprotease A. hydrophila diatur

oleh sistem quorum sensing yang homolog dengan tipe Lux IR dengan molekul

sinyal N-Butanoyl-L-Homoserine Lactone (C4-HSL) (Swift et al., 1997). Molekul

sinyal ini juga berfungsi sebagai perantara komunikasi antar sel dalam populasi

bakteri sehingga disebut sistem quorum sensing. Sintesis C4-HSL diatur oleh

protein regulator AhyI yang diekspresikan gen AhyI. Selanjutnya molekul sinyal

ini akan disekresikan ke lingkungan. Apabila konsentrasi C4-HSL dalam

lingkungan tinggi, senyawa ini akan masuk kembali ke dalam sel dan berinteraksi

dengan reseptor protein regulator AhyR yang diekspresikan gen AhyR, kemudian

AhyR akan mengikat rangkaian promoter pada gen penyandi eksoprotease dan

mengaktifkan faktor transkripsi RNA polymerase untuk mengadakan proses

transkripsi (Swift et al., 1999).

Berdasarkan penelitian Swift et al.(1997), produksi C4-HSL A. hydrophila

terdeteksi pada nilai OD600 sebesar 1. Hal ini sebanding dengan populasi bakteri

107-108 CFU/ml (Gram et al., 1999).

26

26

5. Jumlah dan Satuan Enzim

Keaktifan suatu enzim dapat ditentukan secara kualitatif dengan reaksi

kimia yaitu dengan substrat yang dapat dikatalisis oleh enzim tersebut, dan secara

kuantitatif ditentukan dengan mengukur laju reaksi tersebut. Jumlah enzim lebih

banyak dinyatakan dalam bentuk keaktifan enzim dan dinyatakan dalam satuan

atau unit enzim. Secara umum, satuan enzim berhubungan dengan laju reaksi yang

dikatalisis. Jumlah satuan enzim dapat ditentukan dengan menentukan jumlah

satuan enzim yang mampu mendegradasi substrat pada kondisi tertentu (Winarno,

1986). Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat

menghasilkan kenaikan pengukuran absorbansi sebesar 0,01 setiap jam pada

kondisi pengukuran (Hanlon and Hodges, 1981)

6. Mekanisme Penghambatan Quorum Sensing

Banyak bakteri yang menggunakan quorum sensing dalam mengontrol

virulensinya terhadap organisme lain, sehingga quorum sensing merupakan target

baru untuk agen kemoterapeutik (Rasch et al., 2004). Menurut Keivit and

Iglewski (2000), bakteri gram negatif yang virulen dapat dijadikan nonpatogen

dengan cara menghambat sistem quorum sensingnya. Hal ini dapat dijadikan

sebagai cara pencegahan infeksi kronis yang merusak tanpa menggunakan agen

yang menghambat pertumbuhan seperti antibiotik dan desinfektan yang dapat

menyebabkan resistensi organisme.

27

27

Pada bakteri gram negatif, sistem quorum sensingnya menggunakan

molekul sinyal AHL, maka beberapa cara yang dapat mengganggu sistem quorum

sensing adalah :

a. Penghambatan Pembentukan Sinyal AHL

Pembentukan AHL dikatalis oleh protein LuxI. Prosesnya meliputi

mekanisme reaksi yang berurutan yang menggunakan S-Adenosyl Methionine

(SAM) sebagai donor asam amino untuk pembentukan cincin homoserine lactone,

dan Acyl Carrier Protein (ACP) sebagai prekursor untuk rantai acyl dari molekul

sinyal AHL. Beberapa analog SAM seperti S-adenosylhomosistein, S-

adenosylcysteine, dan sinefungin dapat digunakan sebagai inhibitor pembentukan

AHL yang dikatalis oleh protein RhlI pada Pseudomonas aeruginosa (Hentzer

and Givskov, 2003). Antibiotik yang termasuk dalam macrolide antibiotic mampu

menekan sintesis AHL pada P. aeruginosa ketika diberikan pada konsentrasi

penghambatan di bawah minimal (Hentzer and Givskov, 2003).

b. Penghambatan Penyebaran Sinyal AHL

Komunikasi antar sel bakteri dapat dihambat oleh adanya penurunan

konsentrasi molekul sinyal yang aktif di lingkungan. Kerusakan AHL dapat

terjadi secara non enzimatik, misalnya molekul sinyal AHL dapat dihidrolisis

pada pH tinggi. Beberapa bakteri mampu mendegradasi molekul sinyal AHL

secara spesifik. Dong et al. (2002) menemukan bahwa AiiA, enzim yang

diproduksi oleh bakteri Bacillus sp dapat mempercepat reaksi hidrolisis molekul

AHL. Ekspresi dari gen AiiA pada Erwinia carotovora, bakteri patogen pada

tanaman menunjukkan penurunan pelepasan sinyal AHL, menurunkan aktivitas

28

28

enzim pektolitik ekstraseluler dan melemahkan gejala infeksinya pada tanaman

(Hentzer and Givskov, 2003).

c. Penghambatan Penerimaan Sinyal AHL

Penghambatan penghantaran molekul sinyal quorum sensing dapat

dilakukan oleh molekul antagonis yang mampu bersaing atau bercampur dengan

sinyal AHL asli untuk berikatan dengan reseptor LuxR. Inhibitor kompetitif

strukturnya mirip dengan molekul sinyal AHL sehingga berikatan dan mengambil

tempat berikatan AHL tetapi gagal untuk mengaktifkan LuxR. Inhibitor

nonkompetitif mempunyai struktur kurang mirip atau tidak mirip dengan molekul

sinyal AHL, molekul ini mengikat pada sisi yang berbeda pada protein reseptor

(Hentzer and Givskov, 2003).

6. Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)

Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) termasuk famili Solanaceae

(Tjitrosoepomo, 2002). Taanaman ini merupakan tanaman perdu, berakar

tunggang dengan akar samping yang banyak dan dangkal; batang bersegi dan

berbulu halus. Bunganya berbentuk terompet kecil dengan benang sari yang

bersatu membentuk tabung, warna bunga umumnya kuning. Buahnya berbentuk

bulat, pipih, berdaging dan banyak mengandung air, tersusun dalam tandan.

Daunnya bercelah dengan tulang daun menyirip dan tersusun dalam sebuah

tangkai bersama (Sunarjono, 2004; Steenis, 1997).

Buah tomat mengandung gula (glukosa, fruktosa, sukrosa), asam organik

(asam sitrat, asam malat), mineral, volatil, asam askorbat, vitamin, dan polifenil,

29

29

protein, selulosa, hemiselulosa, dan asam amino lain (Atherton and Rudich,

1996). Buah tomat mempunyai senyawa cita rasa (flavouring compound) yang

disebut furaneol (2,5 dimetil, 4-hidroksi-3(2H)-furanon). Furaneol ini dapat larut

dalam air (Buttery et al., 2001).

(Buttery et al., 2001)

Gambar 3. Struktur furaneol

7. Senyawa furanon

Furanon terdapat di alam sebagai pheromone, flavour compound , dan

metabolit sekunder (Martinelli et al., 2004). Butenolids (2(5H)-Furanon) telah

diisolasi dari Streptomyces sp. atau dari Hortonia sp. Furanon juga diproduksi

oleh alga hijau, alga merah, dan alga coklat, sponge, fungi,dan ascidian. Pada

kecoa jantan , furanon digunakan sebagai sex pheromone. Furanon ini terdapat

secara alami pada nanas atau strawberry dan membuat senyawa cita rasa pada

keju dan wine (Martinelli et al., 2004). Pada alga laut Delisea pulchra, furanon

dihasilkan sebagai metabolit sekunder dengan nama (Z)-5(bromomethylene)

furan-2(5H)-one (furanon) (Lonn, 2005). Halogen furanon ini dapat menghambat

sistem quorum sensing (Givskov et al., 1996; Manefield et al., 1999).

30

30

Beberapa furanon mempunyai struktur kimia mirip dengan N-Acyl

Homoserine Lactone (AHL) yang merupakan molekul sinyal dalam sistem

quorum sensing bakteri gram negatif, sehingga senyawa furanon ini bersaing

dengan AHL untuk berikatan dengan reseptor LuxR. Beberapa penelitian telah

menunjukkan bahwa furanon : (1). Menghambat AHL-faktor pengatur virulensi

dan patogenisitas pada Pseudomonas aeruginosa, (2). Menghambat quorum

sensing yang mengatur luminescen dan virulensi dari Vibrio harveyi yang patogen

pada udang, dan (3). Menghambat quorum sensing yang mengontrol virulensi dari

Erwinia carotovora (Hentzer and Gisvskov, 2003).

(Hentzer and Givskov, 2003)

Gambar 4. Struktur C4-HSL

(Hentzer and Givskov, 2003)

Gambar 5. Struktur halogen furanon dari Delisea pulchra

31

31

B. Kerangka Pemikiran

Aeromonas hydrophila bersifat patogen pada ikan. Faktor patogenisitasnya

adalah enzim eksoproteasenya. Produksi enzim eksoprotease pada A. hydrophila

diatur oleh sistem quorum sensing dengan C4-HSL sebagai molekul sinyalnya. C4-

HSL ini akan disekresikan ke lingkungan, bila konsentrasi C4-HSL di lingkungan

tinggi, C4-HSL akan masuk kembali ke dalam sel dan mengaktifkan faktor

transkripsi gen penyandi enzim eksoprotease. Ekstrak buah Lycopersicon

esculentum Mill. yang mengandung furanon diharapkan akan menyebabkan

penghambatan sistem quorum sensing A. hydrophila sehingga ekspresi gen

penyandi enzim eksoprotease menurun. Penurunan ekspresi gen penyandi enzim

eksoprotease akan menyebabkan menurunnya produksi enzim eksoprotease.

Dengan menurunnya produksi enzim eksoprotease, maka patogenisitas A.

hydrophila juga menurun. Kerangka pemikiran secara skematis adalah sebagai

berikut (Gambar 6)

32

32

Gambar 6. Kerangka pemikiran

Menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila

Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila menurun

Patogenisitas A. hydrophila menurun

Aeromonas hydrophila

Enzim Eksoprotease Patogen pada ikan

Ekstrak buah L.

esculentum Mill.

Sistem quorum sensing

33

33

C. Hipotesis

1. Ada penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah pemberian

ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)

dengan variasi konsentrasi 0 %, 2 %, 4 %, 6 %, dan 8 %.

2. Ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.) dengan konsentrasi 4 %

menunjukkan penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila yang

terbesar.

34

34

BAB III

METODE PENELITAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2006 di Sub

Laboratorium Biologi, Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret,

Surakarta.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:

a. Alat untuk ekstraksi : timbangan elektrik, blender, pisau (cutter), erlenmeyer,

freezer, gelas beker, gelas ukur, alumunium foil, kertas saring, dan rotary

evaporator.

b. Alat untuk pemeliharaan kultur A. hydrophila : tabung reaksi, inkubator, hot

plate.

c. Alat untuk pengujian kualitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila :

cawan petri, jarum ose, laminar air flow, bunshen buchner, tabung reaksi,

vortek, hot plate.

d. Alat untuk pengukuran pertumbuhan, dan pengukuran aktivitas enzim

eksoprotease A. hydrophila : spektrofotometer, kuvet, shaker, mikropipet dan

tip, laminar air flow, gelas ukur, erlenmeyer, hot plate, dan sentrifus.

e. Alat sterilisasi : autoklaf

35

35

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:

a. Buah tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) var commune

b. Kultur murni A. hydrophila yang diperoleh dari Laboratorium Penyakit Ikan

(Fish disease) Jurusan Teknologi Perikanan Universitas Gajah Mada,

Yogyakarta.

c. Medium Luria Bertani (LB) Agar (Lampiran 1), Luria Bertani (LB) Broth

(Lampiran 1), azocasein (Sigma), susu skim, trichloroacetic acid (TCA),

NaOH 0,5 M, dan buffer fosfat pH 8

d. Pelarut : n heksan , etil asetat, metanol

C. Cara Kerja

1. Pembuatan ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol buah

Tomat (L. esculentum Mill.)

Buah tomat yang masak dicuci bersih, kemudian diiris tipis dan

dikeringkan dalam oven dengan suhu 80°C. Irisan yang sudah kering diblender

menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah tertutup. Serbuk dilarutkan dalam n-

heksan (100 mg serbuk/100ml n-heksan), dikocok dan dibiarkan selama 24 jam.

Ekstrak disaring dan diambil filtratnya. Filtrat dipekatkan dalam rotary

evaporator hingga diperoleh ekstrak n heksan buah tomat. Selanjutnya ampas

yang diperoleh dari penyaringan dilarutkan dalam etil asetat, dikocok dan

dibiarkan selama 24 jam. Ekstrak disaring dan diambil filtratnya. Filtrat

dipekatkan dalam rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak etil asetat buah

36

36

tomat, sedangkan ampasnya dilarutkan dalam metanol, dikocok dan dibiarkan

selama 24 jam. filtrat dipekatkan dalam rotary evaporator hingga diperoleh

ekstrak metanol buah tomat (Wardhani, 2005)

2. Pemeliharaan Kultur A. hydrophila

Kultur A. hydrophila ditumbuhkan pada agar miring NA pada suhu 30oC.

3. Penentuan Kurva Standar A. hydrophila

Penentuan kurva standar dilakukan untuk mengetahui waktu yang tepat A.

hydrophila mencapai kepadatan 107-108 CFU/ml. Penentuan kurva standar bakteri

dilakukan dengan cara memindahkan isolat bakteri berumur 24 jam ke dalam 200

ml medium LB broth, kemudian diinkubasi pada suhu 30°C, dan dikocok dengan

shaker. Pengukuran pertumbuhan bakteri dilakukan setiap 2 jam sekali mulai jam

ke-0 dan selanjutnya setiap 2 jam selama 24 jam, 10 ml suspensi bakteri diambil

dan diukur pertumbuhannya menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 600 nm sehingga diketahui nilai OD (Optical Density). Hubungan

antara nilai OD dengan jumlah bakteri per ml didapatkan melalui pembuatan

kurva standar dengan menentukan plot antara nilai OD dengan jumlah sel bakteri

per ml pada hitungan cawan. Dari kurva standar ini dapat diketahui nilai OD A.

hydrophila yang memenuhi kepadatan 107-108 CFU/ml.

37

37

4. Pengujian Kualitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease

Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease A.

hydrophila secara kualitatif setelah perlakuan ekstrak buah tomat. Medium yang

digunakan adalah Luria-Bertani (LB) agar yang ditambah dengan 2% susu skim.

Sterilisasi medium dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, sedangkan

sterilisasi susu skim pada suhu 110°C selama 30 menit. Cawan petri diisi dengan

12 ml medium dengan penambahan ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol

buah tomat dengan konsentrasi 0% (sebagai kontrol), 2%; 4%; 6% dan 8% . Isolat

A. hydrophila yang telah ditumbuhkan dalam media LB Broth diinokulasikan

pada cawan petri yang berisi medium LB agar padat dengan menggunakan metode

titik (spot plate) dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam. Masing-masing

dilakukan dengan tiga kali ulangan Aktivitas enzim eksoprotease dapat dilihat

dengan adanya zona bening pada medium (Swift et al., 1999). Luas zona bening

pada masing-masing perlakuan dihitung, kemudian dibandingkan dengan luas

zona bening pada kontrol.

Luas zona bening : π R2- π r2

Keterangan :

R : jari-jari lingkaran total (koloni bakteri + zona bening) (dalam cm)

R : jari-jari lingkaran koloni bakteri (dalam cm)

π: 3,14

Luas zona bening dalam cm2

38

38

5. Pengukuran Pertumbuhan A. hydrophila

Uji ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan A. hydrophila pada

perlakuan ekstrak buah tomat. Isolat A. hydrophila berumur 24 jam ditumbuhkan

pada 200 ml LB broth yang telah diberi ekstrak buah tomat, selanjutnya

diinkubasi pada suhu 30°C dan dikocok dengan shaker. Pengukuran pertumbuhan

bakteri dilakukan setiap 2 jam sekali mulai jam ke-0 dan selanjutnya setiap 2 jam

selama 24 jam, 10 ml suspensi bakteri diambil dan diukur pertumbuhannya

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm sehingga

diketahui nilai OD (Optical Density). Sebagai kontrol, dilakukan pengukuran

pertumbuhan A. hydrophila dalam medium LB Broth yang tidak diberi perlakuan

ekstrak buah tomat.

6. Pengujian Kuantitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease A. hydrophila

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease A.

hydrophila secara kuantitatif pada perlakuan ekstrak buah tomat. Prinsip

pengujian aktivitas enzim eksoprotease berdasarkan metode Hanlon dan Hodges

(1981) yaitu kemampuan enzim protease untuk menghidrolisis azocasein. Residu

azocasein yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim eksoprotease akan diendapkan

oleh tricloro acetic acid (TCA). Endapan dipisahkan dengan filtrat. Filtrat akan

membentuk warna bila direaksikan dengan NaOH. Intensitas warna yang

terbentuk diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 440 nm.

Pengujian secara kuantitatif hanya dilakukan pada ekstrak yang menunjukkan

pengurangan aktivitas proteolitik terbesar yang ditunjukkan dengan luas zona

39

39

bening paling kecil dibandingkan kontrol pada pengujian kualitatif aktivitas enzim

eksoprotease. Sepuluh ml suspensi bakteri yang telah diukur pertumbuhannya

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit. Filtratnya diambil

sebanyak 1 ml, lalu dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah berisi 3 ml

larutan buffer fosfat (pH 8). Campuran ini kemudian diletakkan di atas penangas

air hingga suhunya mencapai 37°C. Setelah itu, ditambahkan 2 ml azocasein yang

sebelumnya telah dipanaskan pada penangas air hingga suhunya mencapai 37°C,

lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Selanjutnya ditambahkan 4 ml

trichloro acetic acid (TCA) 10% sehingga terbentuk endapan kuning yang

dipisahkan dengan disentrifugasi. Filtrat sebanyak 5 ml diambil, lalu ditambah

dengan 5 ml larutan NaOH 0,5 M kemudian diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 440 nm. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan setiap 2 jam sekali

selama 24 jam sebanyak 3 kali ulangan. Satu unit aktivitas enzim eksoprotease

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan kenaikan

pengukuran absorbansi sebesar 0.01 setiap jam pada kondisi pengukuran. Unit

aktivitas enzim eksoprotease yang digunakan dalam penelitian ini dinyatakan

dalam U/ml, dan ditetapkan dengan rumus :

Unit aktivitas/ml sampel (U/ml) = (absorbansi : 0,01) X 2

(Hanlon and Hodges, 1981)

40

40

D. Analisis Data

Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat dilihat dari

aktivitas enzim eksoprotease secara kualitatif dan kuantitatif. Hasil pengujian

kualitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila yang dinyatakan dalam luas

zona bening (dalam cm2) pada masing-masing perlakuan dibandingkan dengan

luas zona bening pada kontrol. Perlakuan yang mempunyai luas zona bening

terkecil akan dilanjutkan pada pengujian kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease.

Hasil pengukuran aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila berupa unit

aktivitas enzim/ml sampel (U/ml) pada perlakuan yang menunjukkan aktivitas

enzim eksoprotease terendah dibandingkan dengan aktivitas enzim eksoprotease

pada kontrol dan penurunannya dinyatakan dalam persentase.

41

41

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Kepadatan A. hydrophila yang Memenuhi Quorum Sensing

Aeromonas hydrophila mempunyai faktor virulensi utama berupa produksi

enzim eksoprotease yang diatur oleh sistem quorum sensing. Dengan demikian

untuk mendeteksi adanya produksi enzim eksoprotease, sistem quorum sensing A.

hydrophila harus berjalan terlebih dahulu. Sistem quorum sensing dapat berjalan

apabila bakteri telah mencapai kepadatan tertentu. Pada A. hydrophila ini, mulai

kepadatan 107-108 CFU/ml sistem quorum sensing mulai berjalan (Gram et al.,

1999). Dengan bekerjanya sistem quorum sensing, maka A. hydrophila telah

mampu memproduksi enzim eksoprotease. Dalam penelitian ini, penentuan

kepadatan A. hydrophila yang mampu mencapai quorum dilakukan dengan cara

membuat kurva standar A. hydrophila. Suspensi A. hydrophila diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm sehingga dihasilkan nilai OD

yang kemudian dikorelasikan dengan jumlah bakteri pada hitungan cawan. Nilai

OD dan jumlah bakteri dalam hitungan cawan dapat diikuti dalam Tabel 1.

Tabel 1. Nilai OD dan jumlah bakteri A. hydrophila pada hitungan cawan

Jam ke OD Jumlah bakteri/ml Log Jml Bakteri 4 0,0697 3,1 . 105 5,49136 6 0,5310 1,6. 108 8,21085 8 0,9040 2,3. 108 8,36173 10 1,1930 9,9. 108 8,99564

42

42

Dari nilai OD dan jumlah bakteri hasil hitungan cawan dibuat kurva

standar A. hydrophila sehingga didapatkan persamaan Y=2,947X + 5,7774 yang

diperoleh melalui analisis regresi linier sederhana (Gambar 7).

Gambar 7. Kurva standar A. hydrophila

Berdasarkan kurva standar tersebut, kepadatan A. hydrophila sebesar 107-

108 CFU/ml dicapai pada nilai OD lebih besar atau sama dengan 0,415. Dari hasil

tersebut, maka inokulum yang digunakan untuk perlakuan adalah inokulum yang

mempunyai nilai OD lebih besar atau sama dengan 0,415.

B. Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara Kualitatif

Enzim eksoprotease merupakan enzim protease yang disekresikan oleh A.

hydrophila ke dalam lingkungannya. Enzim eksoprotease ini merupakan faktor

virulensi utama pada bakteri patogen sehingga perlu diturunkan produksinya.

Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dikontrol oleh suatu sistem

komunikasi bakteri yang disebut sistem quorum sensing, dengan molekul sinyal

y = 2,947x + 5,7774

R2 = 0,8493

0123456789

10

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

OD

log

Jum

lah

Bak

teri

/ml

43

43

adalah C4-HSL. Untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila

dapat dilakukan dengan cara menghambat sistem quorum sensingnya.

Dalam penelitian ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem

quorum sensing A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam buah tomat.

Senyawa furanon mempunyai struktur mirip dengan molekul sinyal C4-HSL

sehingga berperan sebagai C4-HSL analog dan mampu mengganggu quorum

sensing. Untuk mendapatkan senyawa yang terkandung dalam buah tomat, maka

dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi bertingkat buah tomat menggunakan

pelarut non polar, semi polar, dan polar yaitu : n heksan, etil asetat, dan metanol.

Uji kualitatif produksi enzim A. hydrophila dilakukan dengan metode titik

(spot plate) pada media Luria Bertani (LB) Agar yang ditambah 2% susu skim

dan pada perlakuan ditambah dengan ekstrak buah tomat dengan berbagai variasi

konsentrasi. Inokulum yang digunakan adalah inokulum A. hydrophila yang telah

mencapai kepadatan 107 dari hasil pembuatan kurva standar A. hydrophila

(Gambar 7). Media Luria Bertani digunakan dalam uji kualitatif produksi enzim

eksoprotease karena Luria Bertani ini mengandung tripton (asam amino triptofan)

sehingga bisa memacu aktivitas enzim proteolitik. Penambahan susu skim

dimaksudkan untuk menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease melalui

terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri A. hydrophila. Zona bening ini

menunjukkan adanya aktivitas enzim eksoprotease yang menghidrolisis ikatan

peptida protein susu skim menjadi asam amino (Poernomo dan Purwanto, 2005).

Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kualitatif dapat

44

44

diketahui dengan tidak adanya zona bening atau terjadinya pengurangan luas zona

bening di sekitar koloni A. hydrophila.

Apabila produksi enzim eksoprotease secara kualitatif terhambat oleh

salah satu jenis ekstrak tanpa menghambat pertumbuhan bakteri, maka akan

dilanjutkan dengan uji kuantitatif produksi enzim eksoprotease untuk mengetahui

persentase penurunan produksi enzim eksoprotease.

1). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak

n heksan Buah Tomat (L. esculentum Mill.)

n heksan merupakan pelarut non polar yang akan melarutkan senyawa non

polar dalam buah tomat. Kandungan non polar dalam buah tomat antara lain

adalah likopen yang termasuk golongan karotenoid (Sauriasari, 2006). Ekstrak n

heksan buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar dengan variasi

konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Pada semua konsentrasi masih terdapat

produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Hal ini ditunjukkan dengan adanya

zona bening di sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan adanya aktivitas

enzim eksoprotease menghidrolisis ikatan peptida susu skim. Berkurangnya zona

bening diikuti pula oleh pengurangan koloni bakteri yang tumbuh (Gambar

8a,b,c,d,e).

45

45

Gambar 8. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak n heksan buah tomat (L. esculentum Mill.)

Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening. (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)

a. Kontrol (media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 8%

a

c d

e

b

2

1

1

2

1

2

2

1

2

1

46

46

Bakteri tetap tumbuh yang ditunjukkan dengan diameter koloni A. hydrophila

yang cukup besar dan mampu memproduksi enzim eksoprotease terbukti dengan

terukurnya luas zona bening di sekitar koloni A. hydrophila. Diameter koloni A.

hydrophila dan luas zona bening setelah perlakuan dengan ekstrak n heksan buah

tomat dapat diikuti pada Tabel 2.

Tabel 2. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak n heksan tomat (L. esculentum Mill.)

Konsentrasi Rata-rata diameter

koloni (cm)

Rata-rata luas zona

bening (cm2)

Kontrol (0%) 0,467 0,429

2% 0,380 0,110

4% 0,425 0,149

6% 0,316 0,081

8% 0,250 0,077

Pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila mengalami

penurunan, namun penurunan produksi enzim eksoprotease dan pertumbuhannya

relatif kecil. Hal ini diduga karena senyawa-senyawa aktif non polar yang

terkandung dalam ekstrak buah tomat tidak mampu menghambat sistem quorum

sensing A. hydrophila. Ekstrak yang bersifat non polar menyebabkan ekstrak

tersebut kurang larut dalam media LB agar yang mempunyai pelarut air yang

bersifat polar. Dalam ekstrak n heksan buah tomat ini diduga senyawa furanon

tidak terekstrak sehingga tidak mampu menghambat sistem quorum sensing A.

hydrophila sehingga perlakuan ekstrak n heksan buah tomat ini tidak dilanjutkan

47

47

pada pengukuran pertumbuhan bakteri dan pengujian kuantitatif aktivitas enzim

eksoprotease A. hydrophila.

2). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Etil

Asetat Buah Tomat (L. esculentum Mill.)

Etil asetat merupakan pelarut semi polar yang akan melarutkan senyawa

non polar dalam buah tomat. Ekstrak etil asetat buah tomat ditambahkan pada

media Luria Bertani Agar dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%.

Produksi enzim eksoprotease setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat

ini mengalami penghambatan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak

yang diberikan. Hal ini dapat terlihat dari terbentuknya zona bening yang ada di

sekitar koloni bakteri. Demikian pula dengan pertumbuhan bakterinya, semakin

tinggi konsentrasi ekstrak, pertumbuhan A. hydrophila semakin terhambat.

Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak

etil asetat buah tomat dapat dilihat pada Gambar 9.

48

48

Gambar 9. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat (L. esculentum Mill.)

Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila) a. Kontrol (pada media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 8%

a

c d

e

b

1

2

1

2

1

1

1

49

49

Berdasarkan Gambar 9b, dilihat dari koloni bakteri yang tumbuh dan zona

bening yang ada dapat dikatakan bahwa pertumbuhan dan produksi enzim

eksoprotease pada konsentrasi 2% relatif sama dengan pertumbuhan dan produksi

enzim eksoprotease pada kontrol A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa

konsentrasi tersebut belum mampu menghambat sistem quorum sensing A.

hydrophila. Pada konsentrasi 4% (Gambar 9c) menunjukkan penghambatan

produksi enzim eksoprotease A. hydrophila yang ditunjukkan dengan tidak adanya

zona bening di sekitar koloni A. hydrophila, walaupun hanya terjadi sedikit

penurunan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sedangkan pada konsentrasi 6%

(Gambar 9d) dan 8% (Gambar 9e) tidak memperlihatkan adanya zona bening di

sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan tidak terdapatnya produksi enzim

eksoprotease.

Adanya penghambatan pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease

secara rinci dapat diketahui dari hasil pengukuran diameter koloni dan luas zona

bening yang dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak etil asetat buah Tomat (L. esculentum Mill.)

Konsentrasi Rata-rata diameter

koloni (cm)

Rata-rata luas zona

bening (cm2)

Kontrol (0%) 0,467 0,429

2% 0,483 0,322

4% 0,320 -

6% 0,233 -

8% 0,225 -

Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri

50

50

Pada Tabel 3 terlihat bahwa pada kontrol dan perlakuan ekstrak etil asetat

buah tomat sebesar 2%, diameter koloni cukup besar yaitu 0,467 dan 0,483

dengan diameter zona bening yang cukup besar pula. Lain halnya pada

konsentrasi 4%, meskipun diameter koloninya relatif besar ternyata tidak terdapat

zona bening di sekitar koloni bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etil

asetat buah tomat sebesar 4% mampu menghambat produksi enzim eksoprotease

A. hydrophila. Terhambatnya produksi enzim eksoprotease pada pemberian

ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% ini diduga disebabkan oleh kandungan

semi polar buah tomat mampu menghambat quorum sensing A. hydrophila.

Semakin besar konsentrasi ekstrak, semakin kecil diameter bakteri yang terbentuk.

Hal ini terlihat pada konsentrasi ekstrak 6% dan 8% yang mempunyai diameter

relatif kecil. Diameter koloni yang kecil ini menunjukkan adanya penghambatan

pertumbuhan A. hydrophila. Dengan demikian terjadinya penurunan produksi

enzim eksoprotease disebabkan oleh adanya penghambatan pertumbuhan A.

hydrophila. Senyawa semi polar buah tomat diduga bersifat sebagai antibakteri

yang mampu menghambat pertumbuhan A. hydrophila sehingga menghambat

produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat

buah tomat ini, yang dilanjutkan pada uji pertumbuhan bakteri A. hydrophila

adalah ekstrak etil asetat buah tomat dengan konsentrasi 4%.

51

51

3). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Metanol

Buah Tomat (L. esculentum Mill.)

Metanol merupakan pelarut polar, sehingga mampu melarutkan senyawa

furanon dalam tomat. Ekstrak metanol buah tomat diduga mengandung senyawa

furanon yang mempunyai aktivitas sebagai penghambat sistem quorum sensing

(quorum sensing inhibitor) sehingga mampu menghambat produksi enzim

eksoprotease yang merupakan faktor virulensi A. hydrophila.

Ekstrak metanol buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar

dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini juga

menunjukkan adanya penurunan. Semakin besar konsentrasi ekstrak yang

ditambahkan, semakin kecil produksi enzim eksoproteasenya. Adapun produksi

enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak metanol buah

tomat dapat dilihat pada Gambar 10.

52

52

Gambar 10. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)

Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)

a. Kontrol (media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 8%

a

c d

e

b

1

1 1

1

1

2

2

2

53

53

Pada Gambar 10a tampak bahwa pada kontrol terjadi produksi enzim

eksoprotease yang cukup besar yang terlihat dari zona bening yang ada di sekitar

koloni A. hydrophila. Pada konsentrasi 2% (Gambar 10b) masih menunjukkan

adanya produksi enzim eksoprotease terlihat dengan adanya zona bening di sekitar

koloni A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi tersebut belum

mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada konsentrasi

ekstrak 4% (Gambar 10c) memang masih menunjukkan produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila, namun hanya kecil sekali apabila dibandingkan

dengan kontrol. Pada konsentrasi ini tidak tampak adanya penghambatan

pertumbuhan bakteri. Sedangkan pada konsentrasi 6% (Gambar 10d) dan 8%

(Gambar 10e) tidak terlihat adanya zona bening di sekitar koloni bakteri yang

menunjukkan tidak terjadi produksi enzim eksoprotease. Koloni bakteri yang

tumbuh relatif kecil yang menunjukkan terjadinya penghambatan pertumbuhan A.

hydrophila.

Berdasarkan hasil pengukuran diameter koloni bakteri dan luas zona

bening yang tersaji pada Tabel 4, dapat dilihat bahwa pada konsentrasi 4%,

produksi enzim eksoproteasenya memang relatif kecil yaitu sebesar 0,048 cm2

apabila dibandingkan dengan kontrol yang mempunyai luas zona bening 0,429

cm2. Adanya penurunan produksi enzim eksoprotease ini tidak disertai

penghambatan pertumbuhan, terlihat dari dimeter zona bening yang relatif besar.

Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi ini mampu menghambat sistem quorum

sensing A. hydrophila.

54

54

Tabel 4. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)

Konsentrasi Rata-rata diameter

koloni (cm)

Rata-rata luas zona

bening (cm2)

Kontrol (0%) 0,467 0,429

2% 0,367 0,264

4% 0,308 0,048

6% 0,236 -

8% 0,216 -

Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri

Pada Tabel 4 juga menunjukkan bahwa pada konsentrasi 6% dan 8% tidak

menunjukan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, namun disertai

penghambatan pertumbuhan A. hydrophila terlihat dari diameter koloni A.

hydrophila yang kecil, sehingga terjadinya penghambatan produksi enzim diduga

disebakan oleh terhambatnya pertumbuhan bakteri A. hydrophila.

Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ini disebabkan oleh

adanya penghambatan sistem quorum sensing A. hydrophila. Berdasarkan

penelitian Swift et al. (1999) penghambatan quorum sensing dapat dilakukan

dengan menambahkan senyawa analog C4-HSL pada kultur A. hydrophila.

Penghambatan quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa yang mirip dengan

molekul sinyal sebagai quorum sensing inhibitors (QSI). Pada perlakuan ekstrak

metanol buah tomat ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem

quorum sensing A. hydrophila sehingga mampu menghambat produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam ekstrak buah tomat.

55

55

Dalam buah tomat ini, furanon terdapat dalam bentuk furaneol (2,5 dimetil, 4-

hidroksi-3(2H)-furanon) (Buttery et al., 2001). Berdasarkan penelitian Rasmussen

et al. (2000), halogen furanon yang merupakan metabolit sekunder dari makroalga

laut Delisea pulchra mampu menghambat molekul sinyal N-Butanoyl-L–

Homoserine Lactone pada Serratia liquefaciens sehingga menghambat motilitas

Serratia liquefaciens.

Senyawa yang bertindak sebagai QSI mampu menghambat quorum sensing

dalam konsentrasi yang relatif kecil (Hentzer and Givskov, 1999). Apabila

diberikan dalam konsentrasi yang lebih besar, senyawa QSI akan bersifat sebagai

antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri (Rasch et al., 2004). Dalam

penelitian ini terbukti bahwa pada konsentrasi 4%, senyawa dalam ekstrak

metanol buah tomat mampu menurunkan produksi enzim eksoprotease tanpa

menghambat pertumbuhan A. hydrophila. Pada saat ekstrak metanol buah tomat

diberikan pada konsentrasi lebih besar yaitu 6% dan 8% terjadi penghambatan

produksi enzim eksoprotease, namun disertai penghambatan pertumbuhan A.

hydrophila, sehingga berdasarkan prinsip quorum sensing inhibitors (QSI) yang

mampu menghambat faktor virulensi bakteri (dalam penelitian ini adalah produksi

enzim eksoprotease A. hydrophila) tanpa menghambat pertumbuhan bakteri itu

sendiri maka yang dilanjutkan ke tahap pengujian produksi enzim eksoprotease A.

hydrophila secara kuantitatif adalah ekstrak metanol buah tomat dengan

konsentrasi 4%. Penelitian ini terfokus pada senyawa QSI bukan pada antibakteri

karena pada umumnya senyawa antibakteri mempunyai dampak negatif yaitu

56

56

munculnya resistensi bakteri dan timbulnya strain bakteri yang baru sehingga

penggunaan senyawa antibakteri menjadi kurang efektif.

C. Pertumbuhan A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Buah Tomat

(L. esculentum Mill.)

Pertumbuhan bakteri A. hydrophila setelah pemberian ekstrak buah tomat

diketahui dengan membuat kurva pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan

digunakan untuk mengetahui bahwa penghambatan produksi enzim eksoprotease

A. hydrophila tidak disebabkan oleh terhambatnya pertumbuhan A. hydrophila,

namun disebabkan oleh terhambatnya sistem quorum sensing yang mengontrol

sintesis enzim eksoprotease tersebut. Pengukuran pertumbuhan A. hydrophila

hanya dilakukan pada perlakuan yang menunjukkan penurunan produksi enzim

eksoprotease secara kualitatif tanpa terhambat pertumbuhannya yaitu pada

perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat tomat

sebesar 4%.

Gambar 11 menunjukkan pertumbuhan A. hydrophila setelah perlakuan

ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar

4%. Selain itu, dilakukan pula pengukuran pertumbuhan A. hydrophila dengan

penambahan pelarut etil asetat dan metanol dalam media LB cair untuk

mengetahui pengaruh pelarut yang digunakan untuk mengekstrak buah tomat

terhadap pertumbuhan A. hydrophila. Secara umum kurva pertumbuhan

menunjukkan pertumbuhan bakteri yang terdiri dari fase lag, fase eksponensial,

dan fase stasioner.

57

57

Gambar 11. Kurva pertumbuhan A. hydrophila

Keterangan : A : Kontrol negatif (media LB broth) B : Kontrol positif (media LB broth + pelarut etil asetat 4%) C : Kontrol positif (media LB broth + pelarut metanol 4%) D : Media LB broth + ekstrak etil asetat buah tomat 4% E : Media LB broth + ekstrak metanol buah tomat 4%

Berdasarkan Gambar 11, fase lag tidak begitu kelihatan. Hal ini diduga

disebabkan bakteri sudah mampu beradaptasi dengan media cair yang digunakan.

Pada fase lag, sel bakteri mengalami perubahan dalam komposisi kimiawi dan

bertambah ukurannya, namun belum ada penambahan populasi bakteri (Pelzar and

Chan, 1992). Pada fase eksponensial terjadi penambahan massa sel dengan cepat

(Pelzar and Chan, 1992). Fase eksponensial A. hydrophila pada penelitian ini

berlangsung pada jam ke-0 sampai jam ke-10. Pada fase stasioner, terjadi

penumpukan produk beracun dan terjadi kekurangan nutrien sehingga beberapa

sel mati sedangkan yang lain tetap tumbuh sehingga jumlah sel hidup menjadi

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Waktu pengukuran (jam)

nila

i OD

A B C D E

58

58

tetap (Pelzar and Chan, 1992). Pada penelitian ini fase stasioner berlangsung pada

jam ke-12 sampai jam ke-24.

Pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan kontrol positif

yang ditambah pelarut metanol, pertumbuhan A. hydrophila berlangsung dengan

normal, tidak terjadi penghambatan pertumbuhan A. hydrophila, terlihat dengan

nilai Optical density (OD) yang relatif sama dengan kontrol. Sedangkan pada

kontrol yang ditambah pelarut etil asetat, menunjukkan penghambatan

pertumbuhan A. hydrophila. Etil asetat mengandung asam asetat. Asam mampu

menyebabkan denaturasi protein sel bakteri, sehingga terjadi koagulasi protein sel

bakteri dan akhirnya bakteri mati kemudian sel bakteri menjadi menggumpal dan

cenderung turun ke bawah dasar erlenmeyer saat pengukuran pertumbuhan A.

hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% terjadi

penghambatan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Hal ini dimungkinkan akibat

adanya kandungan senyawa semi polar dalam tomat yang mampu menghambat

pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sehubungan dengan terhambatnya

pertumbuhan A. hydrophila setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat

sebesar 4%, maka perlakuan ini tidak dilanjutkan pada tahap uji kuantitatif

aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila.

D. Penurunan Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara

Kuantitatif

Di dalam sel, jumlah enzim yang ada hanya kecil sehingga pengukuran

kadar enzim dalam ekstrak jaringan akan menjadi sangat sulit. Oleh karena itu,

59

59

pengukuran produksi enzim dalam sebuah ekstrak jaringan atau cairan biologik

lain dilakukan dengan mengukur aktivitas katalisis enzim. Jumlah molekul atau

massa enzim yang ada sukar ditentukan sehingga hasil pengukurannya

dinyatakan dalam bentuk unit aktivitas enzim (Murray et al., 1996).

Pengukuran produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kuantitatif

hanya dilakukan pada perlakuan yang menunjukkan penurunan aktivitas

proteolitik pada uji kualitatif dan yang tidak menghambat pertumbuhan A.

hydrophila. Hal ini sesuai dengan prinsip quorum sensing inhibitors yang mampu

menghambat ekspresi gen penyandi faktor virulen, tanpa menghambat

pertumbuhan dari bakteri itu sendiri. Pada penelitian ini, hanya ekstrak metanol

buah tomat sebesar 4 % yang diuji kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease.

Uji aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila secara kuantitatif dilakukan

dengan menggunakan azocasein sebagai substratnya. Azocasein akan dihidrolisis

oleh enzim eksoprotease menjadi peptida dan asam amino yang akan membentuk

warna apabila ditambah dengan NaOH. Intensitas warna yang terbentuk dapat

diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 440

nm.

Produksi enzim eksoprotease setelah pemberian ekstrak metanol buah

tomat sebesar 4% dibandingkan dengan kontrol untuk mengetahui persentase

penurunan produksi enzim eksoprotease. Untuk memastikan bahwa penurunan

produksi enzim eksoprotease itu disebabkan oleh senyawa dalam tomat dan bukan

pelarut metanolnya, maka dilakukan pula uji aktivitas enzim eksoprotease

kuantitatif pada media LB broth dengan penambahan pelarut metanol sebesar 4%.

60

60

Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila selama 24 jam dapat dilihat

pada Gambar 12.

Gambar 12 . Kurva produksi enzim eksoprotease A. hydrophila

Keterangan : A : Kontrol ditambah pelarut metanol sebesar 4% B : Perlakuan dengan penambahan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% C : Kontrol

Berdasarkan Gambar 12. produksi enzim eksoprotease sudah terdeteksi

sejak jam ke-0. Hal ini terjadi karena kepadatan bakteri pada jam ini telah

memenuhi quorum untuk berjalannya quorum sensing A. hydrophila (Gambar 11)

Produksi enzim eksoprotease cenderung stabil setelah jam ke-12 (pada fase

stasioner). Pada kontrol yang ditambah pelarut metanol tidak menunjukkan

adanya penghambatan produksi enzim eksoprotease. Pelarut metanol tidak

menghambat produksi enzim eksoprotease A. hydrophila karena metanol tidak

0

2

4

6

8

10

12

14

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

WAKTU (JAM)

unit

aktiv

itas

enzi

m/m

l

A B C

61

61

mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada penelitian

Rasmussen et al. (2005) pelarut metanol memang tidak menunjukkan aktivitas

sebagai quorum sensing inhibitors.

Pada pemberian ekstrak metanol buah tomat menunjukkan adanya

penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila (Gambar 12). Produksi

enzim eksoprotease pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini dibandingkan

dengan kontrol untuk memperoleh persentase penurunan produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila. Pada kontrol, produksi enzim eksoprotease terbesar

terjadi pada jam ke-4 dan ini dianggap 100%, sehingga penurunan produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila dihitung dengan membandingkan produksi enzim

eksoprotease setelah pemberian ekstrak metanol buah tomat dengan kontrol pada

jam ke-4. Histogram persentase produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat

dilihat pada Gambar 13.

Gambar 13. Histogram produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada jam Ke-4

Keterangan :

A : Perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% B : Kontrol

020406080

100

% p

rodu

ksi e

nzim

ek

sopr

otea

se

A B

perlakuan

62

62

Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada pemberian

ekstrak metanol buah tomat 4% adalah sebesar 71,68%. Adanya penurunan

produksi enzim eksoprotease ini diduga disebabkan oleh adanya aktivitas senyawa

furanon dalam ekstrak metanol buah tomat yang bertindak sebagai C4-HSL

analog. Senyawa furanon mempunyai struktur mirip dengan C4-HSL sehingga

berkompetisi dengan C4-HSL untuk berikatan dengan protein Lux R dan akhirnya

menghambat terjadinya induksi gen penyandi enzim eksoprotease (Manifield et

al., 1999). Gao et al. (2003) dan Bauer and Robinson (2002) menyebutkan bahwa

tanaman tomat mengeluarkan senyawa yang mampu menirukan aktivitas molekul

sinyal AHL pada sistem quorum sensing bakteri, dan mempunyai efek yang

spesifik terhadap quorum sensing bakteri.

63

63

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Terjadi penurunan produksi enzim eksoprotease setelah pemberian ekstrak

metanol buah tomat (L. esulentum Mill.) sebesar 4%

2. Ekstrak metanol buah tomat (L. esulentum Mill.) mampu menurunkan

produksi enzim eksoprotease A. hydrophila sebesar 71,68%, tanpa

menghambat pertumbuhan A. hydrophila.

B. Saran

Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui produksi enzim

eksoprotease A. hydrophila menggunakan senyawa furanon murni yang diisolasi

dari buah tomat (L. esculentum Mill.) beserta analisis ekspresi gen untuk

mengetahui pengaruh senyawa furanon tersebut terhadap gen penyandi enzim

eksoprotease A. hydrophila.

64

64

DAFTAR PUSTAKA

Afrianto, E.A dan Liviawaty, E. 1992. Pengendalian Hama dan Penyakit Ikan Yogyakarta : Kanisius.

Alavandi, A., S. A. Anathan., and G. Kang. 1998. Prevelance in Vitro Secretory Activity and Cytotoxicity of Aeromonas species Associated With Chilhood Gastroenterisis in Chennai (Madras) India. Jpn.J.Med.Sci.Biol (51):1-12

Allan, B.J. and R.M. Stevenson. 1981. Extracelluler Virulence Factors of A. hydrophila in Fish infection. Can J. Microbiol, 27: 1114-1122.

Atherton, J.G. and J. Rudich. 1996. The Tomato Crop. London : Chapman and Hall.

Bassler, B.L., M. Wright., R.C. Showalter., and M.R. Silverman. 1993. Intercelluler Signalling In Vibrio harveyi : Sequence and Function Of Gene Regulating Expression Of Luminescence. Mol microbiol, 2 : 773-786.

Bauer, W.D. and J.B. Robinson. 2002. Disruption of Bacterial Quorum Sensing by Other Organism. Current Opinion Biotechnology. 13 : 234-237

Bottarelli, E., and M.C. Ossiprandi. 1999. Aeromonas Infections : An Update. http://www.unipr.it/arpa/facvet/annali/1999/bottarelli2/bottarelli.htm.

Buttery, R.G., G.R. Takeda., M. Naim., H. Rabinowitch., and Y. Nam. 2001. Analysis of Furaneol in Tomato Using Dynamic headspace sampling with Sodium Sulfate. J. agric food chem, 49 : 4349-4351.

Cascon, A., J. Yugueros., A. Temprano., M. Sanchez., C. Hernanz., J.M. Luengo., and G. Maharro. 2000. A Major Secreted Elastase Is Essential for Pathogenicity Of Aeromonas hydrophila. Infect and Immun, 86(6) : 3233-3241.

Dong, Y.H., A.R. Gusti., Q. Zhang., J.L. Xu., and L.H. Zhang. 2002. Identification of Quorum Quenching N-Acyl Homoserine Lactonases from Bacillus Species. Appl and Environ Microbiol. 64 (4) : 1754-1759

Eberl, L. 1999. N-Acyl Homoserine lactone. Mediated Genes Regulation in Gram Negative Bacteria. Syst.Appl. Microbiol, 22(4) : 493-506.

Finch, R.G., D.I. Pritchard., B.W.P. Williams., and G.S.A.B. Stewart. 1998. Quorum Sensing : A Novel Target For Anti Infective Therapy. Jurnal of Antimicrob. Chemotherapy, 42 : 569-571.

65

65

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta : PT Grafinddo Persada

Fryer, J.L and J.L. Bartholomew. 1996. Established and Emerging Infectious Disease of Fish. ASM News, 62 : 592-594.

Gavriel, A.A., J.P. Landre., and A.J. Lamb. 1998. Incidence of Mesophilic Aeromonas Within A public Drinking Water Supply in North East Schotland. J. Appl. Microbiol (84) : 383-392.

Gao, M., M. Teplitski., J.B. Robinson., and W.D. Bauer. 2003. Production of Substances by Medicago truncatula That Affect Bacterial Quorum Sensing. MPMI. 16 (9) : 827-834

Givskov, M., R. de Nys., .M. Manefield, L. Gram., R. Maximilein., L. Eberl., S. Molin., P.D. Steinberg., and S. Kjelleberg. 1996. Eukaryotic Interference with Homoserine Lactone Mediated Prokariotic Signalling. J. Bacteriol . 179 : 6618-6622.

Gram, L., A.B. Christensen., L. Ravn., S . Molin., and M. Givskov. 1999. Production of Acylated Homoserine Lactones by Psichrotrophic Members of The Enterobacteriaceae Isolated From Food. Appl. And Environ. Microbiol. 65(8) : 3458-3463

Hanlon, G. and N.A. Hodges. 1981. Bacitracin and Protease Production In Relation to Sporulation During Exponensial Growth Of Bacillus licheniformis On Poorly Utilized Carbon and Nitrogen Sources. J. Bacteriol, 162(2) : 427-431.

Hayes, J. 2000. Aeromonas hydrophila. Oregon State University : Disease of Fish spring Term Project 2000 (on line). http://www.. Hmsc.orst.edu/classes/hydrophila hayes.

Hentzer, M. and M. Givskov. 2003. Pharmacological Inhibition of Quorum Sensing for The treatment of Chronic Bacterial Infection. J. Clint. Invest (112): 1300-1307.

Ibrahim, A. and I.C. Mac Rae. 1991. Incidence of Aeromonas and Listeria sp. In Red Meat and Milk Sample in Brisbane, Australia. Int.J. Food microbiol (12): 263.

Janda, J.M and S.L. Abbot. 1998. Evolving Concepts Regarding The Genus Aeromonas : An Expanding Panorama of Species, Disease Presentation and Unanswered Question. Clin.infect.Dis, 27 : 332-344.

Khalil. 1997. Toxicity of Crude Extracelluler Products of Aeromonas hydrophila in Tilapia, Tilapia nilotica. Lett. Appl.Microbiol. 25(4): 269-273

66

66

Kievit, T.R and B.H. Igleweski. 2000. Bacterial Quorum Sensing in Phatogenic Relationship. Infect and Immun. September 2000. p.4839-4849

Kordi, M.G.H. 2004. Penanggulangan Hama dan Penyakit Ikan . Jakarta : Rineka Cipta dan Bina Aksara.

Lonn, J. 2005. May We Fight Bacteria by Inhibitting Cell-Cell Signaling UsingFuranon?. Institute of Oral Biology. Dental Faculty, Universitas Of Oslo Norway. www.odont.uio.no/forsking/uldanning

Lynch, M.J. 2002. The Regulation of Biofilm Development by Quorum Sensing in Aeromonas hydrophila. Environ Microbiol, 4: 18-28.

Maalej, S., M. Denis., and S. Dukan. 2004. Temperature and Growth Phase Effect on Aeromonas hydrophila Survival in Natural Sea Water Microcosm : Role of Protein Synthesis and Nucleic Acid Content on Viable But Temporarily non Culturable response. Microbiol, 150 : 181-187.

Manefield, M., R. de Nys., N. Kumar, R. Read., M. Givskov., P. Steinberg., and S. Kjelleberg,. 1999. Evidence That Halogenated Furanones From Delisea Pulchra Inhibit Acylated Homoserine Lactone (AHL) Mediated Gene Expression By Displacing the AHL Signal From Its Receptor Protein. Microibol. 145 : 283-291.

Martinelli, D., G.U. Sequin., H. Brandl., R. Bachosen. 2004. Effect of Natural and Chemichally Synthesised Furanones on Quorum sensing in Chromobacterium violaceum. BMC Microbiol. 4:25.

Mary, P., N.E. Chihib., O. Charafeddine., C. Defives., and J.P. Hornez. 2002. Starvation Survival and Viables But Nonculturable States in Aeromonas hydrophila. Microb. Ecology, 43(2) : 250-258.

McMahon, M.A.S. 2004. The Effect of Modified Atmosphere on Growth and Extracelluler Protein Production in Aeromonas hydrophila. www.science.ulst.ac.uk/food/Aeromonas.htm

Merino, S., S. Camprubi., and J.M. Thomas. 1992. The Effect of Growth Temperature on Outer Membrane Components and Virulence of Aeromonas hydrophila Strain of Serotype 0 : 34. Infect Immun, 60 (10) : 4343-4349.

Murray, R.K., D.k. Granner., P.A. Mayes., and V.W. Rodwell. 1996. Biokimia Harper.edisi 24. Jakarta : EGC : 68

Nieto, T.P. and A.E. Ellis. 1986. Characterisation Of Extracelluler Metallo and Serine Proteases Of Aeromonas hydrophila Strain B51. J.Gen Microbiol. 132(70 ; 1975-1979.

67

67

Noga, E.J. 1995. Fish Desease : Diagnosis and Treatment. The C.V Mosbi Company Missoury.

Parsek, M.R., and E.P. Greenberg. 1997. Acyl Homoserine Lactone Quorum Sensing In Gram Negative Bacteria : A Signalling Mechanism Involved Association With Higher Organism: http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/16/8789=fn152.

Pelzar, J.M. and E.C.S. Chan. 1992. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press

Purnomo, A.T. dan Purwanto, D.A. 2001. Karakterisasi Enzim Proteolitik Bacillus Subtilis FNCC 0059. Surabaya : Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

Rasch, M., C. Buch., B. Austin., W.J. Slierendrecht., K.S. Ekmann., J.L.Larsen., C. Johansen., K. Riedel., L. Eberl., M. Givskov., and L. Gram. 2004. An Inhibitor Of Bacterial Quorum Sensing Reduces Mortality Caused By Vibriosis in Rainbow Trout ( Oncorhynchus mykiss, wal baum). Systematic and Appl microb, 24(3) : 350-359.

Rasmussen, T.B., M. Manefield., J.B. Anderson., L. Eberl., U. Anthoni., C. Christophersen., P. Steinberg., S. Kjelleberg., and M. Givskov. 2000. How Delisea pulchra Furanones Affect Quorum Sensing and Swarming Motility in Serratia liquefaciens MGJ. Microbiol (146) : 3237-3244.

Rasmussen, T.B; T. Bjarnsholt; M.E. Skindersoe; M. Hentzer; P. Kristoffersen.; M. Kote; J. Nielson; L. Eberl; and M. Givskov. 2005. Screening for Quorum Sensing Inhibitors by Use of A Novel Genetic System The Quorum Sensing Selector. J. Bacteriol. 185(5): 1755-1814

Rodrigues, L.A., A.E. Ellis and T.P. Nieto. 1992. Purification and Characterization of an Extracellular Metalloprotease, Serine Protease, and Hemolisin of Aeromonas hydrophila I strain B32: All are lethal for Fish. Microbpathogen (13) : 17-24.

Sautor, M., P. Mary., N.E. Chihib., and J.P. Hornez. 2003. The Effect Of Temperature, Water Activity and pH on The Growth of Aeromonas hydrophila and on its Subsequent Survival in Microscosm Water. Appl.microbiol. 95(4) : 807-813.

Sauriasari, R. 2006. Mengenaal dan Menangkal Radikal Bebas. Berita iptek. 22 Januari 2006.www.beritaiptek.com.

Schauder, S.,and B.L.Bassler. 2001. The Language Of Bacteria. J. Microbiol. 15(12) : 1468-1480.

68

68

Secades, D. and J.A. Guijarro. 1999. Purification and Characterization of an Extracelluler Proteases from Fish Pathogen Yersinia ruckeri and Effect of Cultures Condition and Production. Applied and Environmental Microbiol. 65 (9), : 3969-3975.

Steenis, C.G.G.J.V. 1997. Flora Untuk Sekolah di Indonesia. Jakarta : PT. Pradnya Paramita.

Sunarjono, H. 2004. Bertanam 30 Jenis Sayur. Jakarta : Penerbit Swadaya.

Swift, S., A.V. Karlyshev., L. Fish., El Durant., M.K Winson., S.R. Chhabra., P. Williams., S. Macintyre., and G.S. Stewart. 1997. Quorum Sensing In Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida Identification Of The LuxRI Homologs and Asa RI and Their Cognate N-acylhomoserine Lactone Signal Molecules. J.Bacteriol. 179(17) : 5271-5281.

Swift, S., M.J. Lynch., L. Fish., D.F. Leink., J.M. Thomas., C.J. A.B. Stewart., P. Williams. 1999. Quorum Sensing –Dependent Regulation and Blokade of Eksoprotease Production in Aeromonas hydrophila . Infection and imunity. 4 : 18-28.

Taga, M.E. and B.L. Bassler. 2003. Chemical Communication among Bacteria. Pnas Vol. 100 (2) : 14549-14554

Tjitrosoepomo, G. 2002. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Wardhani, S.Z. 2005. Pemantauan Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Secara Kromatografi Lapis Tipis Pada Lalapan. [Tesis]. Departemen farmasi JBPTPTBFA.

Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. Jakarta : PT Gramedia : 11

69

69

Lampiran 1. Komposisi Medium

1. Nutrient Agar dalam 1 liter aquades (Fardiaz, 1993)

Agar…………………………………………………………………. 15,0 g

Pepton……………………………………………………………… 5,0 g

NaCl………………………………………………………………. 5,0 g

Yeast Extract……………………………………………………… 2,0 g

Beef Extract……………………………………………………… 1,0 g

2. Luria Bertani (LB) Agar dalam 1 liter aquades

Tryptone…………………………………………………………… 10,0 g

Yeast Extract………………………………………………………. 5,0 g

NaCl……………………………………………………………….. 10,0 g

Agar……………………………………………………………….. 15,0 g

3. Luria Bertani (LB) Broth dalam 1 liter aquades

Tryptone…………………………………………………………… 10,0 g

Yeast Extract………………………………………………………. 5,0 g

NaCl……………………………………………………………….. 10,0 g

Glukosa…………………………………………………………… 5,0 g

70

70

UCAPAN TERIMA KASIH Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi yang berjudul “PENURUNAN

PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE Aeromonas hydrophila OLEH

EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill. )”. Penyusunan

naskah skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, oleh karena itu

penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak dan Ibu serta keluarga di rumah yang telah memberikan seluruh

kasih sayang kepada penulis.

2. Bapak Drs. Marsusi, M. S selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Bapak Drs. Wiryanto, M. Si selaku Ketua Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret

Surakarta.

4. Bapak Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing I yang telah

membimbing dan mengarahkan dalam pelaksanaan penelitian dan

penyusunan skripsi.

5. Ibu Ari Susilowati, M. Si selaku pembimbing II yang telah membimbing

dan mengarahkan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi.

6. Ibu Dra. Ratna Setyaningsih M. Si, selaku penguji I yang telah

memberikan masukan pada skripsi ini

7. Ibu Solichatun, M. Si selaku penguji II yang telah memberikan masukan

pada skripsi ini.

71

71

8. Ibu Artini Pangastuti, M. Si atas segala masukan dan bantuan pada skripsi

ini

9. Bapak Tjahjadi Purwoko, M.Si selaku pembimbing akademik yang telah

mengarahkan selama menempuh studi.

10. Kepala Sub Laboratorium Biologi, Laboratorium Pusat MIPA Universitas

Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin penelitian, beserta

seluruh staff yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian di

laboratorium.

11. Umi Lestari, S.Si atas semua ilmu yang ditularkan padaku, atas semua

bantuan dan dorongannya mulai dari awal pembuatan proposal sampai

tersusunnya naskah skripsi ini .

12. Dian Ratnasih, Irmawati, Wiwin Undari, Slamet Mardiyanto, Feri Lina,

Isnaini N.H, Sevi Sawestri, Ana Fitri, Ana N.C dan teman-teman biologi

angkatan 2002 atas bantuan dan dorongan semangat selama penelitian

13. Teman-teman Kost Bu Husein atas persaudaraan dan persahabatan yang

kita jalin dan support yang diberikan.

14. Teman-teman seperjuangan di sub Lab. Biologi terima kasih atas segala

kerjasamanya

15. Rekan-rekan Biologi angkatan 2001, 2003, dan 2004.

16. Teman-teman remaja masjid Sabilarrosyad Sekarpace

17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.

72

72

RIWAYAT HIDUP PENULIS

Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 22 Mei 1984. Tahun 1996

penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Gondangsari II. Selanjutnya,

penulis menyelesaikan pendidikan menengah di SLTPN I Juwiring pada tahun

1999 dan SMUN 1 Wonosari Klaten pada tahun 2002. Penulis diterima sebagai

mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA UNS melalui jalur UMPTN pada tahun

2002.

Selama menempuh pendidikan di Jurusan Biologi FMIPA UNS, penulis

pernah Magang di Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan

Biodiversitas Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) UNS,

pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Mikrobiologi, Genetika, Biologi

Molekuler, Limnologi, Struktur Perkembangan Tumbuhan I, II, dan III,

Taksonomi Tumbuhan I, dan Biologi umum. Tahun 2006 Penulis menjadi juara

pertama pada Lomba Karya Tulis mahasiswa tingkat Universitas Sebelas Maret,

dan termasuk sepuluh besar dalam Lomba Karya Tulis Mahasiswa tingkat

Wilayah B dengan judul karya tulis “ Penghambatan Faktor Virulensi Aeromonas

hydrophila Oleh Bawang Putih (Allium sativum Linn.) Sebagai Upaya

Pencegahan Penyakit Motile Aeromonads Septicemia Pada Ikan”. Pada tahun

yang sama Penulis juga terpilih sebagai Mahasiswa Berprestasi Tingkat Jurusan

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, serta juara kedua

lomba Mahasiswa Berprestasi Tingkat Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Penulis pernah menjabat sebagai staff Bidang Kaderisasi dan

73

73

Pengembangan Organisasi HIMABIO pada periode 2003/2004, staff Bidang

Kaderisasi dan Pengembangan Organisasi HIMABIO pada periode 2004/2005,

staf Departemen Kemuslimahan SKI FMIPA pada periode 2003/2004,

Koordinator Keilmiahan Kelompok Studi Jamur dan Tanaman Obat (MUTANT),

serta Dewan Perwakilan Angkatan HIMABIO pada periode 2005/2006.