Analisis Respon Ekspresi terhadap Cekaman pada

Kedelai: Kelimpahan Cahaya pada Gen-gen Pengatur Jalur

Metabolisme

KELOMPOK IKELOMPOK I

(No. Absen 1-17) (No. Absen 1-17)

INTRODUCTION

• Kedelai [Glycine max (L.) Merr.], tanaman legum yang paling penting yang tumbuh di bumi merupakan sumber penting dari minyak, protein, makronutrien dan mineral.

• Kehilangan pada produksi kedelai diperkirakan lebih dari seperlima dari jumlah tanaman pangan secara global. Kebanyakan dari kehilangan ini disebabkan oleh faktor-faktor biotik sebesar 69% dibandingkan dengan kapasitas panen (Bray et al., 2000).

• Untuk menanggulangi kecaman kekeringan, tanaman memiliki adaptasi dan respon secara morfologi, biokimia, fisiologi, dan molekuler.

• Akumulasi osmolit dalam sel tanaman menghasilkan penurunan dalam potensial osmotik, penyerapan air, dan tekanan turgor sel, yang mengkontribusi pada pemeliharaan proses-proses fisiologis seperti pembukaan stomata, fotosintesis, dan pertumbuhan tanaman.

…INTRODUCTION

• Dalam penelitian ini, kami meneliti beberapa jalur metabolik yang berpotensi berasosiasi dengan kekurangan air pada kedelai (G. max). Untuk tujuan ini, kami menggunakan strategi berbeda, mengkombinasikan pendekatan in silico dan analisis ekspresi gen menggunakan qPCR. Analisa ekspresi gen dilakukan dengan menanam kedelai dibawah kondisi Hsys dan Psys, sehingga dapat dibandingkan dengan pengaruh dan respon terhadap perbedaan dalam aklimatisasi.

Material and Methods• Material Tanaman, Kondisi Pertumbuhan dan Perlakuan:Kedelai kultivar BR 16 dan Embrapa 48 menunjukkan bahwa keduanya memiliki respon yang berbeda terhadap defisit air; BR 16 sangat sensitif terhadap kekeringan dan Embrapa 48 menunjukkan toleransi yang tinggi terhadap cekaman kekeringan (Casagrande et al., 2001; Texeira et al., 2008).

Digunakan dua perlakuan defisit air, sistem berbasis pot (Psys), dimana tanaman ditumbuhkan dalam media pasir dan sistem hidroponik (Hsys), dimana tanaman ditumbuhkan dalam larutan unsur hara.

Tanaman yang ditanam pada Psys dipelihara dalam greenhouse pada suhu 30 °C - 50 °C dan kelembaban relatif 60%-20%. Kultivar BR16 dan Embrapa 48 dikecambahkan dalam pasir selama 10 hari.

Untuk pengolahan dalam sistem hidroponik, benih di pra-kecambahkan di atas kertas filter yang lembab dalam kondisi gelap 25 °C dan kelembaban relatif 65%. Kemudian planlet diletakkan dalam wadah polystryrene sehingga akar kecambah sepenuhnya terendam dalam larutan.

Material and MethodsSetelah 15 hari, bibit yang ada pada fase perkembangan V4 (memiliki 4 daun

trifoliate) diletakkan pada perlakuan yang berbeda setelah dipindahkan dari larutan hidroppnik dan diletakkan pada wadah dalam kondisi gelap tanpa unsur hara atau air selama 0 min (T0, or tidak tercekam), 50 menit (T50), 100 menit (T100) and 150 menit (T150). Dua replikasi biologis dari sampel akar dari kedua kultivar didapatkan pada saat ini dan dibekukan dalam nitrogen cair, diikuti dengan penyimpanan apa suhu -80 °C untuk ekstraksi RNA posterior.

Isolasi Total RNASampel akar dari Psys diproses untuk ektraksi RNA menggunakan RNAeasy kit

(Qigen) mengikuti instruksi pembuat. Sampel dari akar yang kering dari perlakuan hidroponik diproses untuk ekstraksi RNA dengan Trizol® Reagent (Invitrogen).

Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)Primer dibentuk menggunakan Primer 3 plus software, menggunakan kriteria

amplicon dengan skala dari 80-200 bp.DIAGRAM STRATEGI PENCARIAN GEN ORTOLOG PADA KEDELAI

Results Identifikasi dan karakterisasi In silico gen kedelai yang terlibat dalam jalur yang

berbeda untuk respon terhadap kekeringan.

Jalur metabolik dari Arabidopsis yang melibatkan sintesis dan degradasi metabolit selama cekaman kekeringan dipilih melalui informasi dari literatur (Sanchez et al., 2008; Bundy et al., 2009; Urano et al., 2009; Hey et al., 2010). Prosedur ini memungkinkan kita untuk memilih 80 gen dari Arabidopsis termasuk 39 jalur metabolik yang diatur selama defisit air. Sederhananya, kelompok ini disebut “Arabidopsis Genes of the Metabolic Pathways” (AGMPs).

354 ortholog kedelai yang diduga dari 80 gen Arabidopsis diidentifikasi menggunakan Blastp search pada website Phytozome. Langkah ini memungkinkan kita untuk memeriksa apakah ekspresi gen-gen ini dipengaruhi selama cekaman kekeringan. Dalam penelitian ini difokuskan pada deksripsi 3 jalur , antara lain: degradasi lisin, biosistesa putrescine, dan biosintesa stachyose.

Results Continued...

Untuk mengidentifikasi kandidat genom kedelai terbaik untuk AGMPs, dilakukan analisis dendogram. Ini meliputi GmaxLKR/SDH-like1, GmaxLKR/SDH-like2 dan GmaxADC2-like1 (Figure 3) dan juga GmaxGOLS2-like1, GmaxGOLS2-like2, dan GmaxGOLS2-like3. Gen-gen ini merupakan bagian dari jalur metabolisme dari degradasi lisin II, biosintesa putrescine I, dan biosintesa stachiyose (Figure 2).

Gen Arabidopsis AtLKR/SDH (At4g33150) dan AtGOLS2 (At1g56600) memiliki dua ortholog putatif pada genom kedelai. Untuk gen GmaxLKR/SDH, otrholog terduga adalah Glyma13g17580 dan Glyma17g0492, sementara untuk gen GmaxGOLS2, ortholog terduga adalah Glyma19g40680 (Figures 3). Analisa dendogram ADC2 menunjukkan bahwa Glyma04g00960 sebagai gen yang paling mendekati AGMP.

Results RT-qPCR

Melalui analisa in silico, diseleksi enam gen untuk validasi menggunakan qPCR sampel akar dari kultivar yang sensitif (BR 16) dan toleran (Embrapa 48) yang diberikan defisit air pada PSys dan Hsys.

Gen GmaxLKR/SDH-like1 dan GmaxLKR/SDH-like2 menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi pada Psys dibandingkan dengan Hsys. Dalam kondisi Hsys, gen GmaxLKR/SDH-like1 dan GmaxLKR/SDH-like2 menunjukkan peningkatan ekspresi pada T100 menit dan T150 menit pada kedua kultivar.

Gen GmaxGOLS2-like1 menunjukkan perbedaan ekspresi selama cekaman kekeringan pada dua sistem yang diuji ketika dibandingkan dengan dua ortholog GmaxGOLS2, GmaxGOLS2-like2 dan GmaxGOLS2-like3.

Results RT-qPCR

Untuk diketahui bahwa level ekspresi GmaxGOLS2-like1 delapan kali lebih tinggi di kultivar yang toleran pada titik waktu awal (T50 menit) di Hsys dibandingkan dengan sampel yang tidak tercekam, sementara kultivar yang sensitif menunjukkan level ekspresi empat kali lebih tinggi untuk titik waktu yang sama (T50 menit) dibandingkan dengan sampel kontrol.

Pada Psys, kultivar yang toleran menunjukkan peningkatan level ekspresi yang kecil pada GmaxGOLS2-like1 dibawah cekaman sedang (-1,5 Mpa) dibandingkan dengan kontrol, sementara kultivar yang sensitif menunjukkan penekanan yang ringan dibawah level cekaman yang sama.

Results345 putatif ortholog pada genom kedelai dapat diidentifikasi dalam 39 jalur

metabolik. Digunakan pustaka substraktif pada jaringan akar kedelai yang didapatkan dari GENOSOJA.

Melalui analisis in silico, dipilih enam gen kedelai dari tiga jalur metabolik untuk validasi qPCR. Ekspresi tersebut diuji pada akar tanaman dibawah kondisi defisit air melalui 2 cara:

(i)PSys, laju kehilangan air lebih lambat, dan membiarkan tanaman beradaptasi pada lingkungan yang tidak menguntungkan, dan

(ii)HSys, laju kehilangan air sangat cepat, tidak memberikan waktu bagi tanaman untuk beradaptasi terhadap kondisi cekaman.

ResultsJika respon independen GOLS2 ABA diawetkan dalam tiga homolog kedelai,

hasil menunjukkan bahwa respon independen ABA diaktifkan dalam kedua sistem yang diuji (PSys and HSys). Diantara gen yang diharapkan untuk terlibat dalam jalur dependen ABA pada kedelai, GmaxLKR/SDHlike1, GmaxLKR/SDH-like2 dan GmaxADC2-like1 menunjukkan dinamika ekspresi yang berbeda melalui kehilangan air.

Gen GmaxADC2- like1 menunjukkan level ekspresi yang lebih tinggi pada kondisi Hsys. Pada lain pihak, gen yang termasuk jalur ABA independen menunjukkan pola ekspresi gen yang jelas seperti yang ditunjukkan oleh GmaxGOLS2- like1, GmaxGOLS2-like2 and GmaxGOLS2-like3.

ResultsLisin dikatabolis dalam tanaman dari saccharopine menjadi asam glutamat dan

acetyl CoA. Katabolisme enzim secara luas diatur oleh dua enzim, lysin-ketoglutarate reductase (LKR) dan saccharopine dehydrogenase (SDH). Keduanya dihubungkan satu sama lain oleh satu protein tunggal bi-fungsional yang disandikan oleh gen LKR/SDH tunggal.

Respon ekspresi gen LKR/SDH terhadap ABA termasuk cekaman biotik dan abiotik (Moulin et al., 2000) secara tidak langsung menyatakan bahwa jalur katabolisme lisin mengambil bagian dalam jaringan metabolik yang membantu tanaman bertahan terhadap cekaman .

Arginine decarboxylase (ADC) adalah key enzim yang mengubah arginine menjadi putrescine, sebuah mediator penting untuk toleran terhadap cekaman abiotik.

Over ekspresi ADC2 pada tanaman Arabidopsis transgenik menunjukkan bahwa semakin tinggi peningkatan level putrscine maka tanaman semakin toleran terhadap cekaman kekeringan.

Gen GmaxADC2-like1 mencapai puncak ekspresi pada keadaan defisit air -1.5 Mpa pada kondisi Psys dan titik waktu T100 pada kondisi Hsys untuk kedua kultivar. Menariknya, tidak seperti gen GmaxLKR/SDH-like1 dan GmaxLKR/SDH-like2, level ekspresi GmaxADC2-like1 lebih rendah dalam kondisi Psys ketika dibandingkan pada kondisi Hsys.

ResultsAnalisis pada kondisi Hsys menunjukkan bahwa GmaxGOLS2-like1

menunjukkan level ekspresi gen yang lebih tinggi pada fase awal (T50) pada kultivar yang toleran (Embrapa 48), sementara kultivar yang sensitif (BR 16) menunjukkan respon yang lebih rendah terhadap defisit air.

Ekspresi yang sama didapatkan pada Psys, tetapi level ekspresinya sangat rendah dibanding pada kondisi Hsys.

Kontras dengan hal tersebut, GmaxGOLS2-like2 dan GmaxGOLS2-like3 dipengaruhi secara eksklusif pada kondisi Psys. Lebih lanjut, level ekspresi pada kultivar yang toleran secara dramatis lebih tinggi dibawah cekaman yang tinggi.

Hasil tersebut mengindikasikan bahwa ekspresi GmaxGOLS2-like2 dan GmaxGOLS2-like3 tidak terjadi selama defisit air yang tiba-tiba yang dilakukan pada perlakuan Hsys, tetapi kemungkinan pokok selama adaptasi lambat terhadap kekeringan pada kondisi Psys.

Pengaturan ekspresi gen GmaxGOLS2 yang nyata kemungkinan penting bagi tanaman kedelai untuk mengatur ekspresi gen GOLS2 dibawah kondisi lingkungan yang berbeda-beda.

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text

• Click to add Text