Download - Tugas Bioteknologi

Transcript
Page 1: Tugas Bioteknologi

TUGAS BIOTEKNOLOGI

DNA REKOMBINAN DALAM BIDANG KESEHATAN

“PEMBUATAN INSULIN”

OLEH :

NI NYOMAN ENGLANDARI MURTI 1008505011

NI MADE DWI DIANTHY MARYADHI 1008505044

ANGELIA PUTRI MOELIONO 1008505046

I DEWA AYU ADELIA VIVIANDARI 1008505047

A.A. FEBY DANUSWARI 1008505054

PUTU LITA ASTRIANI 1008505056

NI PUTU YULIA PURNAMI 1008505059

GUSTI AYU EKA PERTIWI 1008505060

PUTU IKA INDAH INDRASWARI 1008505061

NI MADE SENDI ROOSVALIN W. 1008505063

SAGUNG ARI MAHADEWI 1008505094

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2013

Page 2: Tugas Bioteknologi

I. KONSEP DNA REKOMBINAN

Prinsip teknologi rekombinasi DNA yaitu menggabungkan molekul

fragmen DNA atau gen dari organisme yang berbeda sehingga menghasilkan

kombinasi baru yang sebenarnya tidak terdapat secara alami. DNA dari

manusia, hewan, tumbuhan dan mikroorganisme dapat direkombinasi. DNA

rekombinan buatan sangat berguna dalam penelitian genetika. Teknologi DNA

rekombinan terus mengembangkan metode untuk isolasi dan menyatukan gen

menjadi kombinasi baru. Tahap awal dari rekombinasi adalah isolasi gen

target. Isolasi gen dapat dilakukan dengan 2 cara yakni pemotongan secara

langsung dan isolasi mRNA untuk persiapan cDNA. Enzim endonuklease

restriksi digunakan untuk memotong untai DNA. Sedangkan DNA ligase

berguna untuk menggabungkan fragmen-fragmen DNA. Apabila menggunakan

metode isolasi mRNA, maka harus berdasarkan prinsip reverse transcription

dan memerlukan penyusunan DNA primer. Gen yang telah diperoleh kemudian

disisipkan pada vector pembawa yang akan membawa gen ke dalam sel inang

(host). Sel inang yang telah ditransformasi kemudian diseleksi dan digunakan

ataupun dikembangkan sebagai organisme penghasil DNA rekombinan

(Nelson, 2005).

DNA ini merupakan unit terkecil yang membawa sifat keturunan (gen).

Dalam penyisipan gen diperlukan mikroorganisme biasanya bakteri, beberapa

jenis ragi, atau virus. Bakteri yang biasanya digunakan adalah Escherichia coli,

yang berfungsi sebagai pembawa gen (vektor). Sifat bakteri atau ragi yang

mengandung gen titipan itu dikendalikan oleh gen asing tadi. Jadi gen asing ini

tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada dalam sel bakteri

(Sumastri, 2005).

Penelitian dalam bidang biologi molekuler dan biologi kedokteran

mengalami kemajuan yang pesat dengan adanya perkembangan manipulasi

gen. Manipulasi gen didefinisikan sebagai pembentukan baru materi genetik

yang dapat diturunkan dengan cara menyisipkan molekul-molekul asam

nukleat ke virus atau plasmid bakteri atau organism pembawa lainnya yang

memungkinkan terjadi penggabungan ke dalam organisme dan mampu

PutuYustiantara, 06/06/13,
untuk apa DNA primer?
Page 3: Tugas Bioteknologi

mengadakan penggandaan lagi. Pemanipulasian gen secara invitro dilakukan

pada awal tahun 1970 dengan adanya perkembangan teknik transformasi pada

bakteri Escherichia coli, pemotongan dan penggabungan molekul-molekul

DNA, dan pemantauan reaksi-reaksi pemotongan dan penggabungan. Jika

pragmen DNA tidak direplikasikan, cara yang paling baik adalah

melekatkanyya ke replikon yang cocok. Replikon ini dissebut juga vector atau

tempat pengklonan. Virus yang menyerang bakteri (bakteriofag) atau plasmid

merupakan vektor yang tepat karena merupakan replikon mereka sendiri, tidak

perlu pemeliharan khusus dan DNA nya dapat dipisahkan dalam bentuk utuh.

Pada mulanya plasmid dan fag yang tepat sebagai vektor hanya dijumpai pada

bakteri Escherichia coli (Sumastri, 2005). Kemajuan di

bidang bioteknologi yang lain diantaranya adalah sintesis insulin dengan

bantuan bakteri yang biasa terdapat di usus besar, namanya Escherichia coli.

Teknologi dasar proses ini disebut dengan teknologi plasmid (Anonim, 2012).

II. DIABETES MELITUS

Penyakit diabetes mellitus (DM)-yang dikenal masyarakat sebagai

penyakit gula atau kencing manis, terjadi pada seseorang yang mengalami

peningkatan kadar gula (glukosa) dalam darah akibat kekurangan insulin atau

reseptor insulin tidak berfungsi baik. Diabetes yang timbul akibat kekurangan

insulin disebut DM tipe 1 atau Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM).

Sedang diabetes karena insulin tidak berfungsi dengan baik disebut DM tipe 2

atau Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM). Insulin adalah

hormon yang diproduksi sel beta di pankreas, sebuah kelenjar yang terletak di

belakang lambung, yang berfungsi mengatur metabolisme glukosa menjadi

energi serta mengubah kelebihan glukosa menjadi glikogen yang disimpan di

dalam hati dan otot. Tidak keluarnya insulin dari kelenjar pankreas penderita

DM tipe 1 bisa disebabkan oleh reaksi autoimun berupa serangan antibodi

terhadap sel beta pankreas. Pada penderita DM tipe 2, insulin yang ada tidak

bekerja dengan baik karena reseptor insulin pada sel berkurang atau berubah

struktur sehingga hanya sedikit glukosa yang berhasil masuk sel. Akibatnya,

Page 4: Tugas Bioteknologi

sel mengalami kekurangan glukosa, di sisi lain glukosa menumpuk dalam

darah. Kondisi ini dalam jangka panjang akan merusak pembuluh darah dan

menimbulkan berbagai komplikasi. Bagi penderita Diabetes Melitus yang

sudah bertahun-tahun minum obat modern seringkali mengalami efek yang

negatif untuk organ tubuh lain (Gustia,2012).

III. INSULIN

3.1 Sejarah Insulin

Insulin pertama kali di ekstraksi dari jaringan pankreas anjing pada

tahun 1921 oleh para ahli fisiologi asal kanada Sir Federick Glant Banting

dan Charles Hebert Best serta ahli fisiologi asal Inggris John James Richard

Macleod. Seorang ahli boikimia James Betram Collip kemudian

memproduksi dengan tingkat kemurnian yang cukup baik untuk digunakan

sebagai obat pada manusia. Pada tahun 1965 insulin manusia telah berhasil

disintesis secara kimia. Insulin merupakan protein manusia pertama yang

disintesis secara kimia. Secara tradisional, insulin untuk pengobatan pada

manusia diisolasi dari pakreas sapi atau babi. Walaupun insulin hewan secara

umum cukup memuaskan tetapi untuk penggunaan pada manusia dapat

menimbulkan dua masalah. Pertama, adanya perbedaan kecil dalam asam

amino penyusunnya yang dapat menimbulkan efek samping berupa alergi

pada beberapa penderita. Kedua, prosedur pemurnian sulit dan cemaran

berbahaya asal hewan tidak selalu dapat dihilangkan secara sempurna. Pada

tahun 1981 telah terjadi perbaikan secara berarti cara produksi insulin melalui

rekayasa genetika. Insulin yang diperoleh dengan cara ini mempunyai

struktur mirip dengan insulin manusia. Melalui teknologi DNA rekombinan,

insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. Karena

kedua hal tersebut di atas, insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek

samping yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang

diperoleh dari ekstrak pankreas hewan, tidak menimbulkan efek alergi serta

tidak mengandung kontaminan berbahaya (Gustia,2012).

Page 5: Tugas Bioteknologi

Tabel 1. Perbedaan susunan asam amino pada insulin manusia, babi, dan sapi

Insulin manusia dan insulin babi hanya beda 1 asam amino yaitu pada

B30,sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda 3 asam amino yaitu

pada A8, A10, B30, sehingga pemakain insulin babi kurang imunogenik

dibandingkan insulin sapi. Tapi masalahnya, 1 babi yang diekstraksi

insulinnya hanya cukup untuk 1 orang selam 3 hari padahal saat ini ada ± 60

juta orang didunia yang menderita diabetes tergantung insulin dan meningkat

5-6 % pertahunnya. Maka dari itu sekarang banyak dikembangkan teknologi

recombinan untuk mendapatkan insulin. Faktor-faktor ini menyebabkan

peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan memasukkan

gen insulin ke dalam uanin yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk

memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami

diproduksi. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA

rekombinan (Gustia,2012).

3.2 Struktur Insulin dan Fungsi Insulin

Insulin merupakan hormon peptide yang disekresikan oleh sel β dari

Langerhans pancreas. Fungsi insulin adalah untuk mengatur kadar normal

glukosa darah. Insulin bekerja melalui memperantarai uptake glukosa seluler,

regulasi metabolism karbohidrat, lemak, dan protein, serta mendorong

pemisahan dan pertumbuhan sel melalui efek motigenik pada insulin

(Prabawati, 2012).

Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari

51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21

lainnya yang membentuk rantai kedua. Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan

uaninee. Kode uanine untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas

lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63

PutuYustiantara, 06/06/13,
tambahkan kalimat:Perbedaan susunan asam amino pada insulin yang dihasilkan oleh manusia, babi dan sapi ditunjukkan pada tabel 1.
Page 6: Tugas Bioteknologi

dalam rantai A dan 90 dalam rantai B). DNA yang membentuk kromosom,

terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-

masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada empat basa

nitrogen yang berbeda yaitu guanine, timin, sitosin dan guanine. Sintesis

protein tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang

diulang (Gustia,2012).

Gambar 2.

Struktur Insulin

Insulin adalah suatu hormon polipeptida yang diproduksi dalam sel-

sel β kelenjar Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi

kadar gula darah (kadar gula drah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Hormon insulin

yang diproduksi oleh tubuh kita dikenal sebagai sebutan insulin endogen.

Namun, ketika kelenjar pankreas mengalami gangguan sekresi guna

memproduksi hormon insulin, disaat inilah tubuh membutuhkan hormon

insulindari luar tubuh,dapat berupa obat buatan manusia yang dikenal sebagai

sebutan insulin eksogen.Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit

seperti diabetes militus tergantung insulin(diabetes tipe 1). Insulin terdiri dari

51 asam amino. Molekul insulin disusun oleh 2 rantai polipepttida A dan B

Page 7: Tugas Bioteknologi

yang dihubungkan dengan ikatan disulfida. Rantai A terdiri dari 21 asam

amino dan rantai B terdiri dari 30 asam amino (Gustia,2012).

Insulin adalah hormon yang mengubah glukosa menjadi glikogen, dan

berfungsi mengatur kadar gula darah bersama hormon glukagon. Kekurangan

insulin karena cacat genetik pada pankreas, menyebabkan seseorang

menderita diabetes melitus (kencing manis) yang berdampak sangat luas

terhadap kesehatan, mulai kebutaan hingga impotensi. Sebelum ditemukan

teknik sintesis insulin, hormon ini hanya bisa diperoleh dari ekstraksi

pankreas babi atau sapi, dan sangat sedikit insulin bisa diperoleh. Setelah

ditemukan teknik sintesis insulin di bidang bioteknologi inilah, harga insulin

bisa ditekan dengan sangat drastis sehingga bisa membantu para penderita

diabetes melitus (Anonim, 2012).

III.3 Escherrichia coli

Gambar 1.

Bakteri Gram negatif, Escherrichia coli, penghuni alami saluran pencernaan

manusia

Escherrichia coli (E. coli) merupakan bakteri penghuni saluran

pencernaan manusia, merupakan ‘pabrik’ yang digunakan dalam rekayasa

genetika insulin. Ketika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama

dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat

mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan

cara menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini.

PutuYustiantara, 06/06/13,
Gambar 1. Foto mikroskopik dari Escherichia coliberi narasi pada diantara paragraph yang menunjukkan gambar ini perlu dilihat
Page 8: Tugas Bioteknologi

Pada E. coli, B-galaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen.

Untuk membuat bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada

enzim ini (Gustia,2012).

Gambar 2. Gambaran replikasi gen insulin pada E. coli

IV. TAHAP MANIPULASI DAN PENYISIPAN GEN PADA PEMBUATAN

INSULIN

Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama yaitu:

1. Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisikan, biasanya berupa

plasmid, yaitu lingkaran kecil DNA yang terdapat pada bakteri. Plasmid

diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing.

PutuYustiantara, 06/06/13,
beri narasi pada diantara paragraph yang menunjukkan gambar ini perlu dilihat
Page 9: Tugas Bioteknologi

2. Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh

bakteri akan mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak

plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang dicopy

sehingga terjadi cloning gen.

3. Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim in

disebut enzim endonulease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu

enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan

urutan basa nitrogen tertentu.

(Gustia,2012).

Tahap-tahap manipulasi dan penyisipan gen pada pembuatan insulin adalah

sebagai berikut :

1. Pemilihan Inang

Para peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan

memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli,

untuk memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami

diproduksi. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA

rekombinan Gen insulin manusia dari pulau Langerhans diambil,kemudian

disambungkan ke dalam pasmid bakteri,membentuk kimera (DNA

recombinasi). Kimera itu dimasukkan ke dalam sel target E.coli. Bakteri E.coli

ini dikultur,untuk dikembangkan. Karakteristik bakteri E.coli yang menjadi

organisme pilihan untuk memproduksi insulin memiliki keunggulan-

keunggulan sebagai berikut:

Memiliki rentang umur pendek

Jumlah generasi yang banyak

Susunan genetik bakteri yang lebih mudah dimodifikasi

Lingkungan luar bekteri dapat dengan mudah dimodifikasi untuk

mempengaruhi ekspresi gen.

Menghasilkan produk,hampir mendekati yang kita inginkan (menyerupai

insulin yang dihasilkan sel β-pankreas)

Lebih ekonomis

Page 10: Tugas Bioteknologi

Sudah banyak dipelajari dan digunakan oleh peneliti lainnya dalam DNA

rekombinan .

2. Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen pengkode

hormon insulin dari sel-sel pankreas manusia atau gen pengkode hormon

pertumbuhan dari kelenjar pituitary. Kromosom sel-sel pankreas dikeluarkan

dengan memecah membran plasma. Membran plasma ini dipecah dengan

diberi kejutan listrik atau dengan pemberian zat kimia yaitu polietilen glikol

atau kalsium klorida (CaCl2), sehingga kromosom dapat keluar dari sel

pankreas.

a. Mula-mula mRNA yang telah disalin dari gen penghasil insulin diekstrak

dari sel pankreas. Kemudian enzim transkriptase ditambahkan pada mRNA

bersamaan dengan nukleotida penyusun DNA.

b. Enzim ini menggunakan mRNA sebagai cetekan untuk membentuk DNA

berantai tunggal.

c. DNA ini kemudian dilepaskan dari mRNA.

d. Enzim DNA polymerase digunakan untuk melengkapi DNA rantai tunggal

menjadi ranati ganda, disebut DNA komplementer (c-DNA), yang

merupakan gen penghasil insulin.

3. Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim

restriksi endonuklease untuk melepaskan bagian DNA yang mengkode insulin

(proinsulin) dari satu kromosom organism. Dengan adanya restriction enzymes

ini, dimungkinkan untuk memotong daerah DNA yang mengkode insulin dari

satu kromosom organisme sehingga dapat diproduksi insulin. Kemudian

memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk

persiapan memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan untuk

menganalisis.

4. Mengekstraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan

cara memecah dinding sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan

menggunakan deterjen atau dengan enzim lisozim, kemudian dilisis dengan

natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA kromosom akan

PutuYustiantara, 06/06/13,
mengapa plasmid perlu diekstraksi dari sel bakteri?mengapa plasmid lebih baik disimpan dalam sel bakteri?
Page 11: Tugas Bioteknologi

menggumpal dan dinetralisir dengan natrium asetat. DNA plasmid ini akan

menggumpal membentuk jaring-jaring dan dengan mudah mengendap. Untuk

memisahkan DNA ini dilakukan sentrifugasi. Cairan yang mengandung

plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan etanol. DNA plasmid yang

dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid ynag berbentuk lingkaran itu dipotong

dengan enzim restriksi endonuklease yaitu enzim yang sama digunakan untuk

memotong DNA pankreas. Enzim ini memecah ikatan fosfodiester pada

molekul DNA. Endonuklease memecah asam nukleat pada posisi internal,

sedangkan enzim eksonuklease memecah molekul DNA dari ujung

molekulnya. Sementara itu, di dalam serangkain tabung reaksi atau cawan

petri, gen penghasil insulin manusia (dalam bentuk c- DNA disiapkan untuk

dipasangkan pada plasmid yang terbuka tersebut). Plasmid adalah salah satu

bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil.

Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. Keunikan plasmid ini adalah:

ia bisa keluar-masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering dipertukarkan antar

bakteri.

5. Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam plasmid

dengan menggunakan enzim ligase yang fungsinya menggabungkan ikatan

fosfodiester antara fragmen ujung-ujung yang terpotong tadi. Proses

penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim yang digunakan untuk

memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama jenisnya, akan menghasilkan

ujung-ujung yang lengket yang sama strukturnya, sehingga penyambungannya

akan menyatu sempurna, sehingga dihasilkan molekul DNA

recombinan/plasmid recombinan yang bagus. Suhu optimum untuk ligasi

PutuYustiantara, 06/06/13,
beri keterangan yg menunjukkan gambar
Page 12: Tugas Bioteknologi

adalah 370C, tetapi ikatannya tidak stabil. Ligasi akan berhasil jika dilakukan

pada suhu 4-1500C.

6. Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan ke

dalam sel bakteri E.coli dengan cara transformasi. Transformasi dilakukan

dengan memasukkan bakteri E.coli ke dalam larutan CaCl2 sehingga terbentuk

lubang-lubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel bakteri.

Di dalam sel bakteri ini plasmid mengadakan replikasi. Diharapkan bakteri

yang telah disisipi gen tersebut mewarisi sifat gen baru, sehingga bakteri yang

telah disisipi dengan gen pengkode insulin dapat memproduksi insulin. Gen

insulin diekspresikan sewaktu bakteri bereplikasi dengan B-galaktosidase

dalam sel mengalami mitosis.

7. Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan atau mengkultur bakteri

hasil rekayasa dalam tabung fermentasi yang berisi medium untuk

pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi

human proinsulin dalam jumlah yang banyak.

(Sumastri,2005)

PutuYustiantara, 06/06/13,
beri keterangan yg menunjukkan gambar
PutuYustiantara, 06/06/13,
symbol derajat bukan 0 yang disuperscript
Page 13: Tugas Bioteknologi

Gambar 3.

Proses pembuatan insulin DNA Rekombinan

Page 14: Tugas Bioteknologi

V. SELEKSI KLON

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya

DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel

inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara

sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan

seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen

sisipan atau gen yang diinginkan.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah

transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau

berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti

ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa

fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara

kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel

inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat

dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk

membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan

sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah

satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa

kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa

fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut

menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara

in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reaction (PCR).

Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar

isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal

tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen

pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate).

Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang

membawa fragmen yang diinginkan. Atau cara lainnya yang hampir mirip

yaitu setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA

PutuYustiantara, 06/06/13,
seleksi DNA:DNA berhasil di ligasi secara in vitro dalam plasmid kemudian dilacak dengan elektroforesis melalui ukuran (bp) atau uji restriksi yg menghasilkan fragmen2 dan kemudian di deteksi dgn elektroforesisSeleksi klon: hanya e coli yg mengandung plasmid yg tersisip yg dapat hidup. bila pada gambar 3 seleksi yg digunakan adalah gen resisten antibiotik. jadi bila e coli ditumbuhkan pada media yang mengandung antibiotik, hanya klon yg membawa plasmid berisi gen target saja yang masuk
Page 15: Tugas Bioteknologi

rekombinan diidentifikasi menggunakan probe. Probe adalah rantai RNA atau

rantai tunggal DNA yang diberi label bahan radioaktif atau bahan fluorescent

dan dapat berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan.

Pada langkah pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah ARNd dari

gen pengkode insulin pankreas manusia. Untuk memilih koloni bakteri mana

yang mengandung DNA rekombinan, caranya adalah menempatkan bakteri

pada kertas filter lalu disinari dengan ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA

rekombinan dan telah diberi probe akan tampak bersinar. Nah, bakteri yang

bersinar inilah yang kemudian diisolasi untuk membuat strain murni DNA

rekombinan. Dalam metabolismenya, bakteri ini akan memproduksi hormon

insulin (Anonim, 2012).

DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :

1. Produk PCR.

2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi

(Gaffar, 2007)

VI. PEMURNIAN INSULIN

Bakteri E.coli yang telah dikultur pada media dan telah

berkembangbiak dan mengandung proinsulin dalam jumlah besar kemudian

diinaktifkan untuk pengambilan proinsulin. Proses inaktifasi dilakukan

dengan cara heat sterilization. Setelah proinsulin diambil kemudian dilakukan

pemotongan secara enzimatik untuk memperoleh human insulin.

PutuYustiantara, 06/06/13,
dgn apa motongnya?
PutuYustiantara, 06/06/13,
ekspresinya insulin di e coli bgmn?bgmn solusi prokariot yg tdk dpt membentuk ikatan disulfide, sedangan insulin punya 3 ikatan disulfide yg menentukan pembentukan struktur tersier dan aktivitasnya…
PutuYustiantara, 06/06/13,
ini metode deteksi keberadaan gen, bisa digunakan tapi tidak menseleksi klon secara langsung. umumnya e coli di seleksi dgn gen resisten antibiotik
Page 16: Tugas Bioteknologi

Setelah diperoleh human insulin, proses selanjutnya adalah pemurnian

untuk penghilangan sel-sel yang tidk diinginkan. Protein yang terbentuk,

sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A

atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-

galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai dicampur dan dihubungkan

kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulfida,

menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis) (Gustia,2012).

Pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi cair dan kristalisasi

(Muqshit, 2013). Pemurnian insulin melibatkan beberapa metode

kromatografi seperti kromatografi ion exchange, kromatografi reversed-

phase, kromatografi size exclusion serta teknik kristalisasi. Berikut skema

tahap pemurnian insulin :

Crude Insulin

Ion Exchange (menghilangkan pengotor pada proses fermentasi)

Reversed-phase (menghilangkan komponen yang menyerupai insulin)

Size exclusion (menghilangkan penggumpalan)

KristalisasiInsulin murni

PutuYustiantara, 06/06/13,
bgmn memreaksikan ikatan disulfide?proses ini tidak terjadi di dalam sel tapi memerlukan penangan khusus pasca ekspresi
Page 17: Tugas Bioteknologi

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2012. Membuat Insulin dengan Bantuan E.coli. Available at: http://biologimediacentre.com/bioteknologi-5-membuat-insulin-dengan-bantuan-e-coli/.

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Teknologi Molekul. Bandung: Jurusan Kimia Fakultas

MIPA Universitas Padjajaran.

Gustia, Riza., I Hardiyanti., Slamet. 2012. DNA Rekombinan Dalam Bidang

Kesehatan (Pembuatan Insulin). Jambi : Fakultas Keguruan dan Ilmu

Pendidikan Universitas Jambi.

Muqshit R. 2013. Rekombinasi DNA (Hormon Insulin). Jakarta: State Islamic

University

Nelson, David L, Cox, Michael M. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry 4 th Ed. New York : W.H Freeman.

Prabawati, Risma K. 2012. Mekanisme Seluler dan Molekuler Resistensi Insulin.

Malang : Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

Sumastri. 2005. Modul Rekayasa genetika. Bandung : Science Education Develompment Centre.


Top Related