Download - Spektrofluorometri
![Page 1: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/1.jpg)
Spektrofluorometri
JURUSAN FARMASI FKIKUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.
(http : // www.hendriapt.wordpress.com)
![Page 2: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/2.jpg)
Tinjauan UmumPenyerapan energi oleh molekul memungkinkan terjadinya : ( Eksitasi, Fluorescensi, dan Fosforescensi)Banyak senyawa kimia memiliki sifat fotoluminensi (dapat dieksitasikan oleh cahaya dan memancarkan kembali sinar dengan panjang gelombang sma atau berbeda dengan semula).Ada dua peristiwa fotoluminensi : (Fluorosensi dan Fosforesensi)
![Page 3: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/3.jpg)
Luminescen
![Page 4: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/5.jpg)
Diagram Fotoluminisensi
![Page 6: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/7.jpg)
Deaktivasi molekul tereksitasi Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang
tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) :
Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Konversi didalam (Internal Conversion = IC) Pradisosiasi Disosiasi Konversi keluar Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Fluoresensi (F) Fosforisensi (P)
![Page 8: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/8.jpg)
Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Perpindahan energi vibrasi
dari molekul yang tereksitasi Molekul yang tereksitasi
kehilangan energi eksitasi vibrasionalnya (lewat tumbukan) menjadi keadaan vibrasional S2
Terjadi sangat cepat (10-3) detik
Dapat terjadi pada tingkat energi elektronik tereksitasi atau azas
![Page 9: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/9.jpg)
Konversi didalam (Internal Conversion = IC)
Perpindahan energi dalam 1 molekul
Elektron pindah dari tingkat energi elektronik yang lebih tinggi ke tingkat energi elektron yang lebih rendah tanpa memancarkan sinar (S2 S1 atau T2 T1)
Dapat terjadi jika kedua tingkat energi elektronik tersebut berdekatan, sehingga terjadi tumpang tindih diantara tingkat energi vibrasi
![Page 10: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/10.jpg)
Pradisosiasi Kelanjutan IC Perpindahan
electron dari suatu tingkat energi elektronik tereksitasi (mis S2) ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dari tingkat energi elektronik tereksitasi yang lebih rendah
![Page 11: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/11.jpg)
Disosiasi
Putusnya suatu ikatan dalam molekul karena menyerap energi sinar tanpa didahului peristiwa konversi kedalam
Elektron ikatan terlepas
![Page 12: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/12.jpg)
Konversi keluar
Perpindahan energi elektronik akibat antaraksi molekul yang tereksitasi dengan molekul lain
Tidak ada pemancaran sinar
Energi yang dipindahkan adalah energi elektronik
![Page 13: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/13.jpg)
Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX)
Pembalikan arah spin elektron yang tereksitasi dari tereksitasi SINGLET (S) menjadi TRIPLET (T)
dapat mudah terjadi jika tingkat energi vibrasi dari S overlapping dengan tingkat energi vibrasi dari T
Terjadi pada molekul dengan berat molekul tinggi
![Page 14: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/14.jpg)
Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Intensitas fluoresensi berkurang Terjadi akibat tabrakan-tabrakan
antar molekul sendiriAdanya pemadam akan
menginduksi deeksitasi dari suatu molekul analit yang tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang diemisikan
Contoh : Oksigen bagi senyawa poliaromatis hidrokarbon
![Page 15: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/15.jpg)
Fluoresensi (F)
Pemancaran sinar dari S1 S0
Waktunya amat singkat (10-8) detik
Jika eksitasi dihentikan,fluoresensi terhenti
Emisi foton sama nilainya dengan energi ang diserap oleh suatu molekul.
![Page 16: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/16.jpg)
Fosforesensi (P) Peroses sutu molekul
melangsungkan suatu transisi (emisi) dari tingkat triplet ke tingkat dasar.
Pemancaran sinar dari T1 S0
Waktunya lebih lama (10-4 detik)
Jika eksitasi dihentikan,fosforisensi masih dapat berlangsung
Biasanya didahului oleh L.A.S.
![Page 17: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/17.jpg)
Efesiensi Fluoresensi
Bilangan yang menyatakan perbandingan mol yang berfluoresensi dan jumlah total mol yang tereksitasi (min = 0 dan max = 1)
itereksitasyangmoltotalJumlahensiberfluoresyangmolJumlahEF
![Page 18: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/18.jpg)
DPDIXECICF
F
KKKKKKK
EF
Catatan Indeks :K = Tetapan LajuF = FluoresensiIC = Konversi didalamEC = Konversi keluarIX = Lintasan antar systemPD = PradisosiasiD = Dissosiasi
Faktor Lingkungan = KIC, KEC dan KIXFaktor Struktur Kimia = KF, KPD dan KD
![Page 19: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/19.jpg)
EF dan Jenis Transisi Elektron EF lebih mungkin terjadi pada transisi *
dari pada * n karena: Absorptivitas molar transisi * jauh lebih
besar dari absorptivitas molar transisi * n Umur eksitasi * lebih lama dari pada
umur eksitasi n * sehingga Kn * lebih besar dari pada K *
Kix pada * lebih kecil dari pada KIX pada n * , karena energi yang diperlukan untuk pembalikan arah spin pada * jauh lebih besar dari pada n *
![Page 20: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/20.jpg)
EF dan Jenis Transisi ElektronNilai absortivitas molar
merupakan kebolehjadian terjadinya transisi, makin besar makin mudah terjadi transisi makin mudah terjadi fluoresensi.
LAS lebih sulit pada *, maka * Fluoresenensi n * Fosforisensi
![Page 21: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/21.jpg)
Hubungan Intensitas Fluoresensi (PF) dengan kadar
PF adalah proporsional dengan jumlah molekul yang tereksitasi : 1............PPQPF of
dimana : PF = Intensitas fluoresensi Qf = Effisiensi fluoresensi P0 = Intensitas yang dikenakan
pada sample P = Intensitas setelah mengenai
sample
![Page 22: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/22.jpg)
Menurut Hukum Lambert-Beer
)2......(10PP bc
0
bcPP 100
bc00ff 10PPQP
)3.......(101Q bcf
Jika persamaan 3 dikembangkan dalam
suatu seri makabc0ff PQP
)4(!1n
bc........!4bc
!3bc
!2bc1
n32
![Page 23: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/23.jpg)
Jika bc kecil maka
)5........(bcPQP 0ff Qf = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap)Po = Intensitas awal (nilainya tetap)Σ = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap)b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap)
Sehingga persamaan menjadi :Pf = (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c
= Kc Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding
langsung dengan kadar
![Page 24: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/24.jpg)
Faktor-faktor yang berpengaruh pada fluoresensi
1. Temperatur (Suhu) a. EF berkurang pada suhu yang dinaikkan b. Kenaikan suhu menyebabkan tabrakan
antar mol atau dengan mol pelarut c. Energi akan dipancarkan sebagai sinar fluoresensi diubah menjadi bentuk lain
misal : EC2. Pelarut
a. Dalam pelarut polar intensitas fluoresensi bertambah,
karena dalam pelarut polar b. Jika pelarut yang digunakan
mengandung atom-atom yang berat (CBr4, C2H5I) maka intensitas
fluoresensi berkurang, sebab ada interaksi
gerakan spin dengan gerakan orbital elektron ikatan
mempercepat LAS maka intensitas menjadi berkurang
![Page 25: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/25.jpg)
3. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic Phen
olPhenolat
OHλ eks = 285 λ eks = 310 λ em = 365 λ em = 410
Int = 18 Int = 10
4. Oksigen terlarut Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang
sebab : a. Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya
dapat mengoksidasi senyawa yang diperiksa b. Oksigen mempermudah LAS
![Page 26: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/26.jpg)
5. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang tinggi
Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku
EF = 0,20FluorenBifenil
![Page 27: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/27.jpg)
Hubungan Struktur Molekul dan Fluoresensi Struktur molekul yang mempunyai ikatan
rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan planar
EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem dapatmenaikkan intensitas fluoresensi
EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi
Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi
![Page 28: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/28.jpg)
Pengaturan pH dapat merubah intensitas fluoresensi, Contoh : Phenol menjadi phenolat menaikkan fluoresensi Amina aromatik menjadi ammonium aromatik menurunkan fluoresensiHeterosiklis dengan atom N, S dan O mempunyai sifat fluoresensi
Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya asam akan menaikkan intensitas fluoresensi
![Page 29: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/29.jpg)
Komponen fluorometer
Lightsource
Excitation(prymary)
filter
Excitation filter
Sampel cell
Transmitted Light
Fluorecent(emitted)
light
Fluorecence(secondary)
filter
PhototubePhotomultiplier tube
![Page 30: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/33.jpg)
Keuntungan dari analisis fluoresensi Kepekaan yang baik karena :1.Intensitas dapat diperbesar dengan
menggunakan sumber eksitasi yang tepat
2.Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka
3.Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi
4.Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9 M
![Page 34: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/34.jpg)
kelompok analisis obat secara fluoresensi (1) Obat yang mempunyai sifat
fluoresensi alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi
Contoh : Quinine Larutan obat ini mengabsorbsi
sinar UV dan mengemisi sinar Vis
![Page 35: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/35.jpg)
kelompok analisis obat secara fluoresensi (2) . Turunan obat yang dibentuk dengan
pengikatan dengan senyawa berfluoresensi Contoh : Asam amino diikat oleh
syclorida [ 5 –(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-hloride] dansyl asam aminoyang intensitas fluoresensinya tinggi
R=CH-CO
OHNH2
+ - HCL
N(CH3)2
SO3-NH-CHR-COOH
N(CH3)2
SO23CL
![Page 36: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/36.jpg)
kelompok analisis obat secara fluoresensi (3)Membentuk molekul
berfluoresensi (a. fluorophore)H3C N
N
+NH3
CH2 N+
S
CH3
CH2-CH2OH.2CLFe(CN)6OH
----
Vitamin B1
H3C N
N
N
N
S CH2-CH2OH
CH3
ThiochromeBerfluorensi
eks = 365 nm em eks = 440 nm
![Page 37: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/37.jpg)
Spektra Eksitasi dan Emisi dari kinin-SO4 1 ppm
1.Secara teoritis spektra eksitasi identik dengan spektra absorsi u.v. Spektra ini dapat digunakan untuk menentukan spesifik yang menyebabkan timbulnya emisifluoresensi/ fosforisensi dan yang menimbulkan emisi yang maksimal disebut eksitasi
2.Spektra emisi adalah duplikat dari spektra eksitasi. Hanya timbul pada yang lebih panjang. emisi dipilih suatu yang menimbulkan intensitas maksimal
![Page 38: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/38.jpg)
Cara memperoleh Dibuat cuplikan dalam pelarut air, etanol, maupun
sikloheksan Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet
spektrofotometer Atur monokromator eksitasi pada suatu didaerah
u.v. (misal A). Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B : emisi)
Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas yang maksimum misal A’ nm (A’ nm = eksitasi)
Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang () akan diperoleh harga yang mempunyai intensitas maksimal misal : B’ nm
Maka eksitasi : A’ nm emisi : B’ nm
![Page 39: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/39.jpg)
Beberapa obat yang bersifat fosforisensi Senyawa
AspirinBennocaine Cocaine DiazepamIproniazid PapaverinePhenacetinStrychnin
PO4
Thioridazine
eks240310240290,32
5300,37
0260410290335
fos380430400400,470,51
0440480499440500
Waktu
2,13,42,70,07-1,5-1,20,07
KondisiEPAEpharm EthanolEWEWEthanolEPAEthanolEW
EW : Ethanol – water = 1 : 1EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)
![Page 40: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/40.jpg)
Latihan Soal Jelaskan penggunaan fluoresensi dan
fosforesensi dalam analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ?
Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7, intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut :
Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 !
Konsentrasi (ng/mL) 10 20 40Intensitas fluoresensi 20 42,5 85
![Page 41: Spektrofluorometri](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022061315/56816614550346895dd95dda/html5/thumbnails/41.jpg)
HATUR NUHUN PISAN ......
Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ...
Kita BISA karena BIASA ...