Download - SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI - core.ac.uk · SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI (Cyperus rotundus L ... 12. Teman-teman kelas B angkatan 2003, khususnya kelompok praktikum

i

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI

(Cyperus rotundus L.) FP20, FP40, FP60, DAN FP80

TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Milana Fedelia

NIM: 038114090

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI

(Cyperus rotundus L.) FP20, FP40, FP60, DAN FP80

TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Milana Fedelia

NIM: 038114090

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

ii

Ukuran utama seorang manusia bukanlah ditentukan

ketika ia bertahan pada saat-saat yang baik dan

menyenangkan, namun ketika ia bertahan pada saat-

saat yang penuh tantangan dan persengketaan

(Martin Luther King)

Kupersembahkan karya ini untuk

Allah Bapa, Yesus Kristus, dan Bunda Maria

Papa dan Mama yang selalu mendukung dalam doa dan cinta,

Adik-adikku Filan, Sieling, dan Ilan yang kusayangi,

serta almamaterku

v

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Bapa yang Maha Kuasa atas

segala karunia, kemudahan, dan kebaikan-Nya sehingga skripsi dengan judul

“Sitotoksisitas Fraksi Protein Umbi Teki (Cyperus rotundus L.) FP20, FP40, FP60,

dan FP80 terhadap Kultur Sel Myeloma” dapat terselesaikan. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

pada Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak

bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini

penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi USD.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah

meluangkan waktu, tenaga, dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji atas pengarahan dan kesediannya

menguji.

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas pengarahan dan

kesediannya menguji.

5. Ign. Y. Kristio B., M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam

identifikasi dan determinasi tumbuhan serta atas diskusi-diskusinya.

6. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

7. Mbak Istini, Mbak Heni, Anton KG, dan segenap karyawan Laboratorium

Hayati UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.

vi

8. Papa, Mama, serta adik-adikku tercinta, Filan, Sieling, dan Ilan atas segala

dukungan, doa restu, dan cinta kasih yang berlimpah selama ini.

9. Torimaru, si kura-kura, yang menghadirkan kembali semangat dan keceriaan

tersendiri di saat-saat terberat.

10. Agnes, Ratih, dan Wati atas kerjasama, canda tawa, keluh kesah, dan

semangat selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

11. Teman-teman kosku, Yeyen, Mbak Ika, Ci Novi, Mbak Uun, Mbak Enny,

Marlin, Melon, Avi, Ica, Shinta, Vita, dan Mbak Desy.

12. Teman-teman kelas B angkatan 2003, khususnya kelompok praktikum D atas

kebersamaan dan suka-dukanya selama menjalani tahun-tahun kuliah di

Farmasi .

13. Arry, Robby, dan Candra atas semua diskusi dan bantuannya.

14. Teman-teman kerjaku, Iqbal, Putra, Ignas, dan Ady atas semua pengertian dan

kegembiraan yang dibagikan.

15. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang tak

dapat disebutkan satu-persatu.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan skripsi ini tak lepas dari

segala keterbatasan dan kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk penyempurnaan skripsi

ini. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan

dalam perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

vii

INTISARI

Kanker menempati urutan kedua penyebab kematian di Amerika Serikat setelah penyakit kardiovaskular. Saat ini, penelitian yang ada cenderung mengembangkan obat-obat antikanker yang berasal dari tanaman. Salah satu tanaman yang akan digunakan untuk terapi antikanker adalah rumput teki (Cyperus rotundus L.). Di negara Cina penggunaan rumput teki sebagai salah satu alternatif terapi antikanker sudah mulai dilakukan.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) FP20, FP40, FP60, dan FP80 terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero. Protein umbi teki diendapkan dengan penambahan amonium sulfat dalam konsentrasi yang berbeda. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT {3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida}. Hasil uji berupa persentase kematian sel dianalisis secara statistik dan harga LC50 dihitung menggunakan analisis probit. Harga LC50 kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan uji t-independent.

Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero. Nilai LC50 dari FP20, FP40, FP60, dan FP80 untuk kultur sel myeloma berturut-turut adalah 72,15 μg/ml, 144,77 μg/ml, 150,19 μg/ml, dan 168,69 μg/ml. Sedangkan LC50 untuk sel Vero adalah 35,1 μg/ml, 27,4 μg/ml, 14,7 μg/ml, dan 16,4 μg/ml. Fraksi protein umbi teki mempunyai efek sitotoksik yang lebih besar terhadap sel Vero dibandingkan terhadap sel myeloma.

Kata kunci: umbi teki, fraksi protein, aktivitas sitotoksik, sel myeloma, sel Vero

ix

Cytotoxicity of Nutgrass Tuber (Cyperus rotundus L.) Protein Fraction : PF20,

PF40, PF60, and PF80 against Myeloma Cell Culture

ABSTRACT

Cancer is the second only to cardiovascular disease to cause of mortality in USA. Nowadays, the current research develops anticancer agents from plants. One of these plants that can be used as an anticancer agent is nutgrass (Cyperus rotundus L.). In China, nutgrass has been used as an alternative for cancer treatments.

This research is an experimental research with one way pattern complete random design. This research is aimed to determine the cytotoxic activity of nutgrass tuber protein fraction : PF20, PF40, PF60, and PF80 against myeloma and Vero cell culture. The protein fraction of nutgrass tuber was precipitated by adding ammonium sulfate in various concentration. The cytotoxic activity was determined using the MTT method {3-(4,5-dimethyl-thiazole-2-yl)-2,5-dipheniltetrazolium bromide} method. The results which were in percentage of death were analyzed statistically. The values of LC50 were calculated using probit analysis. The values of LC50 were then analyzed using t-independent test.

The results of cytotoxicity test determined that nutgrass tuber protein fractions had cytotoxicity activities against myeloma and Vero cell culture. The values of LC50 of PF20, PF40, PF60, and PF80 for myeloma cell culture respectively are 72,15 µg/ml, 144,77 µg/ml, 150,19 µg/ml, and 168,69 µg/ml. While for Vero cell culture respectively are 35,1 µg/ml¸ 27,4 µg/ml¸ 14,7 µg/ml¸ and 16,4 µg/ml. The nutgrass tuber protein fraction has the bigger cytotoxic activity against Vero cell culture than myeloma cell culture.

Keywords : nutgrass tuber, protein fraction, cytotoxic activity, myeloma cell

culture, Vero cell culture

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN............................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... v

PRAKATA............................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................... viii

INTISARI .............................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................ x

DAFTAR ISI.......................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................. xv

DAFTAR GAMBAR............................................................................. xvii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................... xviii

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING .................................... xx

BAB I PENGANTAR............................................................................ 1

A. Latar Belakang ................................................................................... 1

1. Permasalahan .............................................................................. 2

2. Keaslian Penelitian...................................................................... 3

3. Manfaat Penelitian ...................................................................... 3

B. Tujuan Penelitian................................................................................ 3

1. Tujuan Umum ............................................................................... 3

xi

2. Tujuan Khusus .............................................................................. 3

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .................................................. 5

A. Rumput Teki (Cyperus rotundus L.) ................................................. 5

1. Keterangan botani ........................................................................ 5

2. Nama daerah................................................................................. 5

3. Deskripsi umbi teki ...................................................................... 5

4. Habitat .......................................................................................... 6

5. Kandungan kimia .......................................................................... 6

6. Khasiat dan penggunaan .............................................................. 6

7. Penelitian mengenai rumput teki.................................................. 7

` B. Kanker ............................................................................................... 7

C. Protein ............................................................................................... 9

D. Sel Myeloma ..................................................................................... 10

E. Sel Vero............................................................................................. 11

F. Uji Sitotoksisitas ............................................................................... 12

G. Keterangan Empiris........................................................................... 13

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .......................................... 14

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................... 14

B. Variabel dan Definisi Operasional ..................................................... 14

C. Bahan atau Materi Penelitian ............................................................. 15

D. Alat-alat Penelitian............................................................................. 16

xii

E. Tatacara Penelitian.............................................................................. 16

1. Determinasi tanaman..................................................................... 16

2. Pengumpulan umbi teki ................................................................ 17

3. Sterilisasi alat ................................................................................ 17

4. Pembuatan fraksi protein .............................................................. 17

5. Pengukuran kadar protein dengan metode spektrofotometri UV.. 19

6. Uji sitotoksisitas sel myeloma....................................................... 19

7. Uji sitotoksisitas sel Vero ............................................................. 21

F. Analisis Hasil ...................................................................................... 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................. 24

A. Determinasi Tumbuhan...................................................................... 24

B. Pengumpulan Umbi Teki.................................................................... 24

C. Sterilisasi Alat .................................................................................... 24

D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Teki ...................................... 25

E. Pengukuran Kadar Protein dengan Spektrofotometer UV.................. 27

F. Uji Sitotoksisitas ................................................................................. 28

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................ 37

A. Kesimpulan ........................................................................................ 37

B. Saran................................................................................................... 37

xiii

DAFTAR PUSTAKA............................................................................ 39

LAMPIRAN........................................................................................... 42

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................... 82

xiv

DAFTAR TABEL Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel

Myeloma ............................................................................ 31

Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel

Vero.................................................................................... 33

Tabel III. LC50 hasil interpolasi analisis probit untuk sel myeloma

dan sel Vero ....................................................................... 35

Tabel IV. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP20 terhadap

kultur sel myeloma............................................................. 43

Tabel V. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP40 terhadap


Tabel VI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP60 terhadap


Tabel VII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP80 terhadap


Tabel VIII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP20 terhadap

kultur sel Vero.................................................................... 45

Tabel IX. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP40 terhadap

kultur sel Vero.................................................................... 45

Tabel X. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP60 terhadap

kultur sel Vero.................................................................... 45

Tabel XI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP80 terhadap

kultur sel Vero.................................................................... 46

xv

Tabel XII. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode

spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260

nm.....................................................................................47

xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Sel myeloma dan sel Vero sehat ..................................... 30

Gambar 2. Kurva hubungan antara fraksi protein umbi teki dengan

persen kematian sel myeloma ......................................... 31

Gambar 3. Morfologi sel myeloma dengan perlakuan (a) FP20, (b) FP40,

(c) FP60, (d) FP8030 ......................................................... 32

Gambar 4. Kurva hubungan antara fraksi protein umbi teki dengan

persen kematian sel Vero ................................................ 33

Gambar 5. Morfologi sel Vero dengan perlakuan (a) FP20, (b) FP40,

(c) FP60, (d) FP80 ............................................................................................. 34

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat FP20, FP40, FP60,

dan FP80.................................................................................................................. 42

Lampiran 2. Absorbansi sel dengan metode MTT............................... 43

Lampiran 3. Cara perhitungan kadar protein ....................................... 47

Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus

rotundus L.) terhadap kultur sel myeloma dengan metode

MTT ................................................................................ 48

Lampiran 5. Uji distribusi data sel myeloma dengan Kolmogorov-

Smirnov........................................................................... 58

Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus

rotundus L.) terhadap kultur sel Vero dengan metode

MTT ................................................................................ 60

Lampiran 7. Uji distribusi data sel Vero dengan Kolmogorov-

Smirnov........................................................................... 71

Lampiran 8. Perhitungan nilai korelasi LC50 sel myeloma dan sel

Vero pada taraf kepercayaan 90%................................... 73

Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC50 antara sel myeloma dan sel

Vero dengan analisis statistik.......................................... 75

Lampiran 10. Foto Sentrifuge K PLC Series......................................... 77

Lampiran 11. Foto Spektrofotometer UV CECIL Series 2 ................... 77

Lampiran 12. Foto Inkubator Memmer ................................................. 78

Lampiran 13. Foto ELISA reader SLT 340 ATC ................................. 78

xviii

Lampiran 14. Foto seluruh bagian tumbuhan Cyperus rotundus L. ...... 79

Lampiran 15. Foto umbi Cyperus rotundus L. ...................................... 79

Lampiran 16. Foto tumbuhan rumput teki (Cyperus rotundus L.) ........ 80

Lampiran 17. Hasil determinasi rumput teki (Cyperus rotundus L.) .... 81

xix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

continuous cell lines : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus-

menerus

FBS : Foetal Bovine Serum

FP (PF) : Fraksi Protein (Protein Fraction)

haemocytometer : alat yang digunakan untuk membantu menghitung jumlah

sel

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida )

reagen stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

leher bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat

menanam sel pada uji sitotoksisitas

xx

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker menempati urutan kedua penyebab kematian di Amerika Serikat

setelah penyakit kardiovaskular. Sampai saat ini pengobatan kanker dilakukan

dengan cara pembedahan, penyinaran (radiasi), kemoterapi, dan imunoterapi

(DiPiro et al, 2005). Pada umumnya obat-obat antikanker menekan pertumbuhan

atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat pembelahan

sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang, epitel

germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit

(Nafrialdi dan Sulistia, 1995). Selain itu, obat-obat antikanker ini justru malah

menekan respon sistem imun yang timbul serendah mungkin (Bowman dan Rand,

1980). Faktor keterbatasan biaya dan peralatan untuk terapi kanker pun turut

mendorong peneliti untuk mengembangkan obat-obat antikanker dari tanaman

yang ada.

Di Indonesia, teki (Cyperus rotundus L.) telah dikenal sebagai obat

tradisional yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat. Bagian tumbuhan yang

biasa digunakan sebagai obat adalah umbi atau akar. Teki berkhasiat

menormalkan siklus haid, analgesik, sedatif. Selain itu, bermanfaat untuk

mengatasi gangguan sakit dada, sakit gigi, gangguan fungsi pencernaan seperti

mual, muntah, nyeri lambung, dan sakit perut, diare, haid tidak teratur, sakit

waktu haid, keputihan, menyuburkan kandungan (Wijayakusuma, 2005).

2

Ada dugaan sementara bahwa protein yang terkandung dalam tanaman

mempunyai potensi untuk diteliti sebagai antikanker. Di Cina, rumput teki

digunakan dalam pengobatan kanker (Hanks, 2000). Rumput teki merupakan

salah satu tumbuhan obat yang dapat merangsang produksi interferon, yakni suatu

protein terlarut yang dihasilkan dari sel saat terinfeksi DNA atau RNA yang

mengandung virus. Interferon juga bersifat sebagai stimulan makrofag dan

mempunyai aktivitas membunuh sel (Hoffman, 2006).

Dalam penelitian ini, umbi teki diujikan pada sel kanker dan juga pada sel

normal (Vero cell line). Namun, sampai saat ini belum ada laporan penelitian

resmi yang menyatakan keefektifan rumput teki dalam terapi pengobatan

myeloma. Atas dasar tersebut maka perlu diadakan penelitian untuk mengetahui

efek sitotoksik rumput teki terhadap sel myeloma. Dengan demikian akan

diperoleh gambaran yang lebih jelas mengenai potensi rumput teki untuk

dikembangkan sebagai alternatif pengobatan multiple myeloma.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan

permasalahan sebagai berikut:

a. apakah fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 memiliki efek

sitotoksik terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero?

b. seberapa besar nilai LC50 fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan

FP80 terhadap sel myeloma dan sel Vero ?

c. apakah fraksi protein umbi teki mempunyai daya sitotoksik lebih besar

terhadap sel myeloma daripada sel Vero?

3

2. Keaslian penelitian

Sejauh yang diketahui penulis belum pernah dilakukan penelitian

mengenai sitotoksisitas fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) FP20, FP40,

FP60, dan FP80 terhadap kultur sel myeloma.

3. Manfaat penelitian

Penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein umbi teki ini diharapkan

memiliki beberapa manfaat antara lain:

a. Manfaat teoretis

Penelitian ini dapat memberikan informasi penting dalam dunia kefarmasian

tentang efek sitotoksik umbi teki terhadap sel myeloma dan sel Vero.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif baru obat antikanker

dari umbi teki.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan umum :

untuk mengetahui apakah fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80

berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

Tujuan khusus :

1. untuk mengetahui efek sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel

myeloma dan sel Vero.

4

2. untuk mengetahui seberapa besar nilai LC50 fraksi protein umbi teki FP20,

FP40, FP60, dan FP80 terhadap sel myeloma dan sel Vero.

3. untuk mengetahui apakah LC50 fraksi protein umbi teki terhadap sel myeloma

lebih besar daripada sel Vero.

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Rumput Teki (Cyperus rotundus L.)

1. Keterangan botani

Rumput teki dapat diklasifikasikan ke dalam famili Cyperaceae, genus

Cyperus dan spesies Cyperus rotundus L. (Backer dan Bakhuizen van den Brink,

1968). Rumput teki yang digunakan juga dikenal dengan nama purple nutsedge.

2. Nama daerah

Nama daerah: Jawa: Teki, tekan (Jawa), motta (Madura). Sulawesi:

Rukut teki wuta (Minahasa). Bulih manggasa buai (Buol), Nusatenggara: Kareha

wai (Sumba). Maluku: Rukut teki wuta (Alfuru) (Anonim, 1980).

3. Deskripsi umbi teki

Umbi Cyperus rotundus L. berbau khas aromatik, rasa agak pedas dan

pahit, menimbulkan rasa tebal di lidah. Umbi rumput teki utuh berbentuk jorong

atau bulat panjang sampai bulat telur memanjang, bagian pangkal dan ujung

umumnya meruncing seperti beras, sukar dipatahkan; panjang 1 - 5,5 cm, garis

tengah 7 mm – 1,5 cm; warna coklat muda sampai coklat kehitaman, kadang-

kadang berbintik-bintik putih, permukaan beruas-ruas, jarak antara tiap ruas

sampai lebih kurang 4 mm. Pada permukaan rimpang terdapat tunas-tunas,

pangkal akar, sisa pelepah daun yang telah koyak; sisa pelepah daun berupa

lembaran-lembaran tipis berbentuk tidak beraturan berwarna coklat muda, coklat

sampai kehitaman, terdapat terutama di bagian pertengahan sampai bagian ujung

6

umbi. Bagian patahan tidak rata, warna putih kotor. Batas antara korteks dan

silinder pusat jelas (Anonim, 1980).

4. Habitat

Rumput teki tumbuh di dataran rendah sampai ketinggian 1000 meter di

atas permukaan laut. Tumbuhan ini banyak tumbuh liar di Afrika Selatan, Korea,

Cina, Jepang, Taiwan, Malaysia, Indonesia dan kawasan Asia Tenggara pada

umumnya. Tumbuhan ini umumnya tumbuh di lahan pertanian yang tidak terlalu

kering (tanahnya tidak berbencah-bencah), di ladang dan kebun (Sudarsono,

1996).

5. Kandungan kimia

Terdapat banyak zat kimia yang terkandung dalam rumput teki. Rimpang dan

umbi teki mengandung 4alpha, 5alpha-oxidoeudesm-11-en-3-alpha-ol, beta-

cyperone, kalsium, tembaga, cyperolone, besi, isocyperol, isokobusone, kobusone,

asam linoleat, asam linolenat, magnesium, mangan, asam miristat, asam oleanolat,

oleanolic-acid-3-o-neohesperidoside, kalium, natrium,asam oleat, patchoulenone,

asam stearat, sugetriol, sugenol, sugeonol, seng (Duke, 2001).

6. Khasiat dan penggunaan

Khasiat rumput teki, yakni untuk diuretik, stomakik (Anonim, 1980),

analgesik, anti inflamasi, sedatif, diaforetik, karminatif. Kegunaannya untuk

busung air, haid tidak teratur, mencret, nyeri haid, pencernaan tidak baik, rematik,

sakit perut (Soedibyo, 1998). Kegunaan lainnya adalah anthelmintik, antibakteria,

antibiotik, antimalaria, anti tumor (tumor payudara, kanker leher rahim) (Anonim,

2006a).

7

7. Penelitian mengenai rumput teki

Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya antara lain adalah efek

anthelmintik dari umbi teki (Rahayu, 1989) yang hasilnya menunjukkan

kemungkinan adanya senyawa terpen, fenol, dan fenolat yang berkhasiat

anthelmintik. Penelitian lainnya adalah isolasi dan identifikasi flavonoid dari umbi

teki (Rahardjo, 1990) yang berhasil menemukan paling sedikit tiga senyawa

flavonoid golongan auron. Penelitian ketiga adalah identifikasi mikroskopis umbi

teki serta efek anti inflamasi ekstrak etanolnya (Hartini, 1993) yang menyatakan

bahwa umbi teki memberikan efek antiinflamasi pada tikus. Penelitian keempat

adalah khasiat anti radang dari ekstrak etanol umbi teki (Rahardja, 1994) yang

menyatakan bahwa umbi teki memberikan daya antiinflamasi secara per oral dan

intraperitoneal. Sedangkan penelitian lainnya adalah daya melarutkan minyak

atsiri dan infus umbi teki terhadap batu ginjal kalsium secara in vitro

(Suhartiningsih, 1996) yang hasilnya menunjukkan kemampuan melarutkan batu

ginjal tersebut. Penelitian ini memiliki persamaan objek uji dengan penelitian-

penelitian yang sudah disebutkan di atas. Hal yang membedakan penelitian ini

dengan penelitian-penelitian sebelumnya adalah pada subjek uji yang digunakan.

Subjek uji yang digunakan untuk penelitian ini adalah kultur sel myeloma.

B. Kanker

Kanker didefinisikan sebagai penyakit yang berasal dari kerusakan

genetik dan menyebabkan distorsi ekspresi atau fungsi biokimia gen. Tumor

terbagi menjadi dua jenis yaitu benigna dan malignan (kanker). Benigna adalah

8

tumor yang terbungkus kapsula, berproliferasi secara lokal, morfologi selnya

mirip dengan morfologi sel asalnya, dan kecepatan pertumbuhannya lambat.

Sedangkan tumor malignan (kanker) tidak terbungkus kapsula, pertumbuhannya

sangat cepat dan bersifat sangat invasif serta relatif resisten terhadap pengobatan.

Sel-sel tumor malignan ini cenderung mengalami metastasis dan dapat muncul

kembali walaupun tumor utama telah dibuang (DiPiro et al, 2005).

Patologi kanker disebabkan oleh akumulasi mutasi DNA yang berefek

negatif berupa pembentukan protein supresor tumor atau menghasilkan efek

positif berupa pembentukan protein pengendali siklus sel. Zat yang menyebabkan

mutasi dikenal sebagai mutagen. Sedangkan mutagen yang menyebabkan kanker

disebut karsinogen (Anonim, 2006b).

Mekanisme terjadinya kanker atau karsinogenesis tidak dapat dipahami

sepenuhnya. Namun proses terjadinya kanker dapat disederhanakan menjadi tiga

tahap. Tahap-tahap tersebut adalah tahap inisiasi, promosi, dan progresi. Tahap

inisiasi menandakan adanya paparan karsinogen yang merusak sel-sel normal

secara genetis. Tahap kedua adalah promosi yang memungkinkan perubahan

lingkungan untuk mendukung perkembangan sel yang bermutasi. Tahap promosi

adalah tahap yang ireversibel sehingga sering dijadikan sebagai target strategi

kemopreventif. Tahap terakhir karsinogenesis adalah progresi. Tahap progresi

meliputi perubahan genetik lebih lanjut yang meningkatkan proliferasi sel

neoplastik. Titik kritis tahap ini adalah invasi tumor ke jaringan sekitarnya dan

perkembangan metastasis (DiPiro et al, 2005).

9

C. Protein

Protein adalah makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-

asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein memiliki bobot

molekul yang tinggi, mulai dari 5000 sampai berjuta-juta (Girindra, 1993).

Protein dalam tanaman terbagi menjadi dua yaitu protein biji dan protein

daun. Beberapa protein biji memiliki sifat sebagai protein racun. Protein beracun

lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang disebabkan

oleh virus. Jenis cara kerja yang dipilih untuk mengisolasi protein dari tanaman

harus memenuhi kondisi tertentu yang tidak menyebabkan denaturasi protein.

Oleh karena itu, dianjurkan untuk bekerja pada suhu rendah dan menghindari

perubahan pH yang ekstrem. Pemilihan dapar basa sebagai pelarut mampu

mengekstraksi lebih banyak protein dalam bentuk terlarut dan membantu

penetralan cairan yang bersifat asam (Robinson, 1991).

Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan

amonium sulfat. Cara ini dilakukan terutama bila diinginkan satu macam protein

saja, sedangkan protein lain tidak diperlukan. Pemurnian protein dengan amonium

sulfat dapat dilakukan secara bertingkat (fraksinasi). Fraksinasi protein

dimaksudkan agar diperoleh pemisahan protein murni yang diinginkan ada dalam

fraksi tertentu. Pengendapan dengan amonium sulfat dapat terjadi karena

penurunan kelarutan protein akibat garam yang ditambahkan pada konsentrasi

tinggi disebut peristiwa salting out (Poedjiadi, 1994).

Proses salting out digunakan untuk memisahkan dan memurnikan

protein. Garam yang digunakan umumnya adalah amonium sulfat karena

10

kelarutannya tinggi, relatif murah, dan dapat menstabilkan protein (Anonim,

2006c).

D. Sel Myeloma

Multiple myeloma (juga dikenal sebagai myeloma atau myeloma

sel plasma) adalah penyakit hematologi yang progresif. Multiple myeloma sendiri

dikategorikan sebagai kanker sel plasma. Multiple myeloma ditandai dengan

jumlah sel plasma yang berlebihan pada sumsum tulang atau kelebihan produksi

imunoglobulin monoklonal (IgG, IgA, IgD, atau IgE) atau protein Bence-Jones.

Manifestasi klinis yang umum ditemui pada penderita multiple myeloma adalah

hiperkalsemia, anemia, kerusakan ginjal, rentan terkena infeksi bakteri, dan

kurangnya jumlah imunoglobulin yang diproduksi (Anonim, 2006d).

Usia rata-rata pasien didiagnosis menderita multiple myeloma adalah 66

tahun. Langkah awal yang penting dilakukan untuk menentukan pilihan terapi

terbaik adalah menentukan jumlah dan stadium kanker di dalam tubuh melalui

serangkaian uji. Uji-uji ini meliputi pengambilan sumsum tulang dan biopsi, uji

urin dan darah untuk mengukur protein yang abnormal (Anonim, 2006e).

Ada tiga tahap perkembangan penyakit multiple myeloma. Tahap-tahap

ini ditentukan secara spesifik dengan kadar protein M dan protein Bence-Jones.

Tahap pertama menunjukkan adanya tumor dalam jumlah kecil. Tahap kedua

merupakan perkembangan menengah tumor. Sedangkan tahap ketiga

menunjukkan adanya tumor dalam jumlah besar. Pada tahap ketiga ini ditemukan

11

protein M dan protein Bence-Jones dalam jumlah besar. Selain itu, juga

ditemukan tiga atau lebih lesi pada tulang (Anonim, 2006f).

Morfologi sel myeloma adalah berupa lymphoblast yang menghasilkan

IgM. Sel myeloma ditumbuhkan dalam continuous culture dengan bentuk

suspensi. Medium yang digunakan untuk pertumbuhan sel myeloma adalah

medium RPMI 1640 ditambah dengan 10% FBS, 2mM L-glutamin. Ke dalam

medium pertumbuhan dialirkan 5% gas CO2 dan suhu optimum untuk

pertumbuhan sel adalah 37OC (Anonim, 2006g).

RPMI 1640 mengandung 20 asam amino misalnya : asparagin, glutamin,

histidin, metionin, dan serin; 11 vitamin antara lain biotin, tiamin HCl, inositol,

riboflavin, dan vitamin B12; 6 garam anorganik misalnya; NaCl, KCl, NaHCO3,

dan MgSO4; serta komponen-komponen lain antara lain glukosa, glutation, fenol

merah, dan natrium piruvat (Anonim, 2006h).

E. Sel Vero

Sel Vero ditemukan pertama pada tahun 1962 oleh Yasumura dan

Kawakita di Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel Vero diambil dari ginjal kera

dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat. Sel Vero juga sering digunakan

untuk mendeteksi verotoksin dan memproduksi vaksin. Saat ini, sel Vero telah

banyak digunakan untuk mengembangkan pengobatan berbagai macam penyakit,

salah satu diantaranya yaitu diabetes (Anonim, 2006i).

12

F. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas merupakan perkembangan untuk mengidentifikasi obat

sitotoksik baru atau deteksi obat dengan aktivitas antitumor. Sistem uji

sitotoksisitas berdasarkan pada hubungan antara dosis dan respon berupa kematian

sel kanker. Sitotoksisitas merupakan syarat aktivitas antikanker (Snell and

Mullock, 1958; cit Hariadi, 2006).

Viabilitas sel pada uji sitotoksisitas dapat ditentukan dengan metode

MTT. Metode ini didasarkan pada perubahan garam MTT {3-(4,5-dimetil-tiazol-

2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida} menjadi formazan oleh enzim reduktase

suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam mitokondria sel. Konsentrasi dari

formazan yang berwarna merah dapat ditentukan secara spektrofotometri visibel,

dan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup. Metode MTT ini dikenal aman,

dan merupakan alternatif uji sitotoksisitas yang akurat (Anonim, 2006j).

Reaksi reduksi MTT menjadi formazan dapat digambarkan sebagai

berikut :

NN

NN

S

N

CH3

CH3NH

N

NN

S

N

CH3

CH3

NADH

NAD+

MTT Formazan

Br

13

Uji sitotoksisitas pada umumnya menggunakan parameter nilai LC50.

Nilai LC50 adalah besaran konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian 50%

pada subjek uji. Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antikanker

bila memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991;

cit Hariadi, 2006).

G. Keterangan Empiris

Penelitian ini bersifat trial dan error yang diharapkan dapat mengetahui

hubungan empiris antara pengaruh pemberian fraksi protein umbi teki FP20, FP40,

FP60 dan FP80 terhadap sel myeloma dan sel Vero.

14

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian efek sitotoksik fraksi protein umbi teki terhadap kultur sel

myeloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak

lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas ialah konsentrasi fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan

FP80 dengan seri kadar 125µg/ml ; 250µg/ml ; 500 µg/ml ; 1000 µg/ml ; 2000

µg/ml dan 4000 µg/ml.

b. Variabel tergantung ialah persentase kematian sel myeloma dan sel Vero.

c. Variabel pengacau terkendali

1) Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640 yang mengandung FBS 10% untuk sel myeloma dan medium M199

untuk sel Vero.

2) Tempat tumbuh dan waktu pemanenan umbi teki dikendalikan dengan

mengambil umbi pada waktu dan tempat yang sama.

3) pH serta suhu pembuatan dan penyimpanan fraksi protein, dikendalikan

pada pH 7,2 dan suhu ± 4OC.

15

d. Variabel pengacau tidak terkendali ialah kematian sel myeloma dan sel Vero

secara alami, serta umur tanaman rumput teki.

2. Definisi operasional

a. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur sel

myeloma yang diberi perlakuan dengan fraksi-fraksi protein.

b. FP adalah bagian tanaman yang berisi protein yang didapat dengan cara

menambahkan amonium sulfat untuk mencapai derajat kejenuhan tertentu.

c. LC50 adalah konsentrasi fraksi protein umbi teki yang dapat mengakibatkan

kematian 50% sel myeloma yang dinyatakan dalam µg/ml.

C. Bahan atau Materi Penelitian

1. Umbi teki yang diambil di daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi

Sungai Progo) pada bulan Juli 2006.

2. Kultur sel myeloma dan sel Vero dari stok Laboratorium Ilmu Hayati

Universitas Gadjah Mada.

3. Pereaksi untuk isolasi dan penetapan konsentrasi protein dari umbi teki:

a. Larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2

b. Larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl

c. Amonium sulfat

4. Pereaksi untuk uji sitotoksisitas pada sel myeloma

a. Medium pencuci : RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes

b. Medium penumbuh : RPMI 1640, FBS 10%, Penisilin-Streptomisin 1%

(Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco)

16

c. Reagen stopper : SDS dalam HCl 0,01 N (Merck)

d. Larutan MTT dalam media RPMI 1640 untuk sel myeloma dan media

M199 untuk sel Vero (Sigma)

e. Bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,25%

D. Alat-Alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: timbangan

analitik (AND ER-400 H), magnetic stirrer, tabung conical, kain monel, gloves,

masker, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge (PLC), inkubator

Memmer, mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin, freezer, cell

counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-292),

ELISA Reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus

IMT-2), haemocytometer (Nebauer), dan alat-alat gelas lainnya.

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu umbi teki

(Cyperus rotundus L.). Umbi teki ini telah diidentifikasi dan determinasi terlebih

dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta. Umbi teki ini dipastikan juga kebenarannya

menggunakan acuan baku determinasi (Backer dan Bakhuizen van den Brink,

1968)

17

2. Pengumpulan umbi teki

Umbi teki yang digunakan diambil dari Sumberarum, Moyudan, Sleman

(tepi Sungai Progo), pada bulan Juli 2006.

3. Sterilisasi alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan dulu

untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan

sabun dan dikeringkan. Setelah itu dibungkus dengan aluminium foil dan

disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121OC (Anonim, 1995).

4. Pembuatan fraksi protein

Umbi tanaman rumput teki dikumpulkan segar, diseleksi lalu dicuci

bersih dengan air mengalir. Umbi dan sisiknya dipotong kecil-kecil lalu ditimbang

sebanyak 400 g, dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan dalam freezer. Bahan

ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5

mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu 4ºC. Bahan diperas

dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril.

Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 2010 x G selama 20 menit. Supernatan

dikumpulkan dalam beaker glass 1000 ml dan diendapkan proteinnya dengan

menambahkan amonium sulfat sebanyak 79,8 g, aduk dengan pengaduk magnetik

selama semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu

4°C. Supernatan (1) ditampung dalam beaker glass 1000 ml, sedangkan pelet

yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat

5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis dengan tubing dialisis dalam larutan dapar

natrium fosfat 5 mM pH 7,2 selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 x G

18

selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet kemudian dibuang dan supernatan diambil.

Supernatan ini merupakan sampel FP20.

Supernatan (1) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan

amonium sulfat sebanyak 74,2 g, aduk dengan pengaduk magnetik semalam.

Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4OC. Supernatan

(2) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin

larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam.

Hasil dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4OC. Pelet dibuang

dan supernatan merupakan sampel FP40.




(3) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin

larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam.

Hasil dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4OC. Pelet dibuang

dan supernatan merupakan sampel FP60.




ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan

dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam. Hasil

dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4OC. Pelet dibuang dan

supernatan merupakan sampel FP80.

19

5. Pengukuran kadar protein dengan metode spektrofotometri UV

Fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80, masing-masing

sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan

dapar natrium fosfat 5 mM. Ukur serapan menggunakan spektrofotometer UV

pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm dengan blanko larutan dapar

natrium fosfat.

Konsentrasi = [1,55E9280]] – [0.76E(260)] mg ml-1

(Layne, 1957; cit Richterich, 1957)

6. Uji Sitotoksisitas sel myeloma

a. Propagasi sel myeloma

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas

penangas air 37°C. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dibuka. Sel

kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI

1640. Suspensi sel disentrifus 2010 x G selama 5 menit, supernatan yang didapat

dibuang, kemudian medium RPMI diganti baru, disuspensikan secara perlahan-

lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 5 menit. Pencucian

diulang sekali lagi, supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml

medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Disuspensikan perlahan hingga

homogen, kemudian sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup

untuk penelitian.

b. Panen sel myeloma

Setelah jumlah sel cukup, medium RPMI diganti dengan medium RPMI

baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan

20

menggunakan pipet Pasteur. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical

steril, ditambah medium RPMI 1640 sampai volume 10 ml dan kemudian

disentrifus 2010 x G selama 5 menit. Supernatan yang didapat dibuang, sedang

pelet diresuspensi perlahan dengan 1 ml media. Jumlah sel dihitung menggunakan

haemocytometer. Suspensi sel ditambahkan sejumlah medium sehingga diperoleh

konsentrasi sel sebesar 3 x 104 sel / 100µl yang akan digunakan untuk penelitian.

c. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT

Sebanyak 100µl suspensi sel myeloma dengan konsentrasi 3 x 104 sel /

100µl dimasukkan ke dalam sumuran–sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi

bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi 3 kali dengan

perlakuan yang sama terhadap 3 kolom sumuran. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi

sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar

natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Sedangkan untuk perlakuan tanpa sel, 100 µl sampel

ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar

natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator

dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37°C. Pada akhir inkubasi, pada masing-masing

sumuran ditambahkan 10 µl MTT 2,5µg/ml, dan diinkubasi lagi semalam pada

suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kompleks

warna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan 100μl reagent stopper,

diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca

dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.

21

7. Uji sitotoksisitas sel Vero

a. Propagasi sel Vero

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel normal dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi

medium M199. Suspensi sel disentrifus 2010 x G selama 5 menit, supernatan

dibuang, diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan

perlahan. Suspensi sel lalu disentrifus kembali selama 5 menit kemudian dicuci

ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh

yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan perlahan sampai homogen,

kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan

dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,

medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya

cukup untuk penelitian.

b. Panen sel Vero

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci

dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,

diberi tripsin 0,25% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril

yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan

FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang

sama dan disentrifus 2010 x G selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin,

sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet

ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah

22

sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah

medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3 x 104/100 μl dan siap

dipakai untuk penelitian.

c. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT

Seratus µl suspensi sel normal dengan konsentrasi 3 x 104 sel/100 µl

dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi

bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan 3 kali

dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 6 baris sumuran. Sebagai

kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium

M199 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. selanjutnya sel diinkubasikan dalam

inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37OC. pada akhir inkubasi, masing-

masing sumuran ditambah dengan 10 µl MTT 2,5µg/ml, dan diinkubasi lagi

semalam pada suhu 37OC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk

kompleks warna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper lalu

diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca

dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.

F. Analisis Hasil

Hasil dari metode MTT berupa absorbansi, didapat dari ELISA reader

mencerminkan jumlah sel yang hidup. Persen kematian sel dapat dihitung dengan

rumus :

% Kematian = 100% x A

C)(BA −−

(Meyer et al, 1982; cit Hariadi, 2006 )

23

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

Metode perhitungan statistik untuk mengetahui harga LC50 dilakukan

dengan menggunakan analisis probit. Analisis statistik kemudian dilanjutkan

dengan menggunakan uji t-independent untuk melihat perbedaan nilai LC50 sel

myeloma dan sel Vero.

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tumbuhan

Penelitian ini menggunakan umbi teki sebagai bahan utama. Langkah

kerja awal yang harus dilakukan adalah mendeterminasi bahan yang didapatkan

dari tumbuhan asal. Determinasi ini penting dilakukan untuk memastikan

kebenaran tumbuhan yang akan diteliti. Determinasi dilakukan dengan

menggunakan acuan baku (Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1968).

Determinasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Hasil determinasi

menyatakan bahwa tumbuhan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah

benar Cyperus rotundus L.

B. Pengumpulan Umbi Teki

Umbi teki yang akan digunakan sebagai bahan utama dalam penelitian

ini diambil dari daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi Sungai Progo), pada

bulan Juli 2006. Umbi teki dikumpulkan kira-kira sebanyak satu kilogram dalam

keadaan segar.

C. Sterilisasi Alat

Sterilisasi dilakukan di awal penelitian untuk semua alat-alat gelas yang

akan digunakan. Tujuan sterilisasi alat ini adalah untuk meminimalisasikan

25

kontaminan berupa mikroorganisme supaya tidak mengganggu hasil penelitian.

Metode sterilisasi yang digunakan adalah metode uap panas bertekanan dengan

autoklaf. Prinsip kerja autoklaf yakni dengan menggunakan uap panas bertekanan

pada suhu 121OC selama 15 menit. Sterilisasi dengan metode uap panas

bertekanan ini membunuh mikroorganisme dengan mekanisme mengkoagulasikan

protein-protein mikroorganisme secara ireversibel. Oleh karena itu sterilisasi

dengan metode panas uap bertekanan akan lebih efektif dibanding metode

sterilisasi konvensional.

D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Teki

Senyawa uji atau sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah

fraksi protein yang diisolasi dari umbi teki. Proses isolasi fraksi protein umbi teki

ini melalui tahap-tahap pembuatan ekstrak gubal dengan penambahan amonium

sulfat, dialisis fraksi protein umbi teki, dan pengukuran kadar protein yang

terkandung dengan spektrofotometer UV.

Umbi teki yang disimpan dalam freezer ditimbang sebanyak 400 g,

dipotong kecil-kecil, kemudian digerus dalam mortir steril pada suhu 4OC sampai

halus. Selama penggerusan ditambahkan larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH

7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl sedikit-demi sedikit. Suhu 4OC dipertahankan

tetap stabil selama penggerusan untuk menghindari denaturasi protein. Sedangkan

larutan dapar natrium fosfat yang mengandung NaCl digunakan untuk

mempermudah kelarutan protein. Larutan dapar yang mengandung fraksi protein

kemudian diperas dengan kain monel dan disentrifus.

26

Amonium sulfat ditambahkan secara bertahap ke dalam supernatan

sampai diperoleh FP20, FP40, FP60, FP80. Penambahan amonium sulfat dilakukan

berdasarkan metode salting out. Metode ini memanfaatkan sifat garam amonium

sulfat yang dapat menarik air dari larutan sehingga menurunkan kelarutan protein

dan menyebabkan agregasi protein. Amonium sulfat ini ditambahkan sedikit demi

sedikit dan bertahap untuk mencegah pembentukan daerah tertentu pada endapan

yang memiliki konsentrasi yang lebih tinggi dari yang diinginkan.

Supernatan yang diperoleh sebanyak 700 ml kemudian diendapkan

dengan penambahan amonium sulfat sebanyak g untuk memperoleh FP20.

Amonium sulfat sebanyak g kemudian ditambahkan untuk memperoleh

FP40. Untuk memperoleh FP60 dan FP80, maka diperlukan penambahan amonium

sulfat masing-masing sebanyak 87,22 gram dan 98,80 g (lampiran 1).

60,74

40,79

Larutan yang sudah ditambah dengan amonium sulfat diaduk dengan

pengaduk magnetik semalam dalam lemari pendingin dan disentrifus. Supernatan

(1) yang diperoleh ditambah dengan amonium sulfat untuk mendapatkan FP40,

sedangkan endapan yang diperoleh dimasukkan ke dalam tubing dialisis dan

didialisis dalam larutan dapar fosfat 5 mM pH 7,2 tanpa NaCl selama semalam

untuk menghilangkan amonium sulfat. Larutan ini tidak mengandung NaCl karena

tidak digunakan untuk melarutkan protein. Prinsip dari dialisis adalah difusi pasif

yang memanfaatkan perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar tubing dialisis.

Molekul protein yang berukuran besar akan tetap tertinggal di dalam tubing

dialisis, sementara molekul amonium sulfat yang berukuran lebih kecil akan

27

keluar dari tubing dialisis. Proses dialisis ini juga dapat menghilangkan protein

berukuran kecil dan alkaloid.

Proses dialisis berjalan mengikuti aturan difusi pasif karena konsentrasi

amonium sulfat di dalam tubing dialisis lebih besar daripada konsentrasi amonium

sulfat di luar tubing. Tubing dialisis yang bersifat semipermeabel akan

mempermudah terjadinya proses ini. Proses dialisis akan terhenti jika konsentrasi

amonium sulfat di dalam dan di luar tubing dialisis sama. Oleh karena itu, perlu

dilakukan penggantian larutan dapar dengan larutan dapar yang baru setelah

digunakan untuk dialisis selama beberapa jam. Penggantian ini dimaksudkan

untuk menjaga agar perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar tubing tetap besar,

sehingga proses dialisis dapat terus berlangsung sampai amonium sulfat

sepenuhnya keluar dari tubing.

Larutan yang diperoleh dari dialisis ini disentrifus dan supernatan yang

didapatkan merupakan FP20. Dengan proses yang sama, akan diperoleh FP40, FP60,

dan FP80.

E. Pengukuran Kadar Protein Dengan Spektrofotometer UV

Sampel fraksi-fraksi protein umbi teki yang diperoleh diukur kadar

proteinnya menggunakan metode spektrofotometri UV. Panjang gelombang yang

digunakan untuk pengukuran kadar yaitu 280 nm dan 260 nm. Pemilihan metode

ini berdasarkan kemampuan asam amino dalam larutan protein terutama triptofan,

fenilalanin, dan tirosin untuk memberikan absorbansi terhadap sinar UV pada

daerah sekitar panjang gelombang 280 nm. Hasil pengukuran dengan metode

28

spektrofotometri UV dapat terganggu dengan adanya asam nukleat dan

komponennya serta senyawa yang mengandung gugus purin dan pirimidin.

Senyawa-senyawa yang menganggu ini mampu memberikan absorbansi terhadap

sinar UV pada panjang gelombang 260 nm. Oleh karena itu, juga diperlukan

pengukuran absorbansi sampel fraksi protein pada panjang gelombang 260 nm.

Pemilihan penggunaan metode spektrofotometri UV didasarkan pada

kelebihan-kelebihannya. Kelebihan penggunaan metode UV adalah waktu

pengukuran relatif singkat, tidak menggunakan reagen dan tidak merusak protein.

Hasil yang diperoleh dari pengukuran menggunakan spektrofotometer

UV ini ialah absorbansi fraksi protein umbi teki (tabel XII). Kadar protein

kemudian dihitung berdasarkan perhitungan kadar protein dari (Layne, 1957; cit

Richterich, 1957) .

F. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas digunakan untuk mengetahui potensi senyawa baru

yang akan dikembangkan menjadi obat antikanker. Metode uji sitotoksisitas yang

dilakukan dalam penelitian ini menggunakan metode MTT secara in vitro. Metode

MTT dipilih dengan pertimbangan bahwa metode ini akurat, cepat, dan relatif

aman dibanding metode radioaktif (Anonim, 2006j).

Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberikan perlakuan fraksi protein

umbi teki terhadap kultur sel kanker dan sel normal. Kultur sel yang digunakan

adalah sel myeloma dan sel Vero dari Laboratorium Ilmu Hayati Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta. Sel Vero merupakan sel normal dan digunakan sebagai

29

kontrol. Konsentrasi seri kadar yang digunakan adalah sebanyak enam

konsentrasi. Konsentrasi tertinggi adalah 4000 µg/ml dan konsentrasi terendah

125 µg/ml untuk masing-masing FP20, FP40, FP60, dan FP80.

Pengukuran absorbansi dengan ELISA reader dilakukan terhadap sel

myeloma dan sel Vero yang diberi perlakuan, perlakuan tanpa sel, dan kontrol.

Perlakuan untuk sel myeloma dan sel Vero dengan pemberian fraksi protein umbi

teki. Kontrol adalah sel myeloma dan sel Vero yang tidak diberikan fraksi protein

umbi teki. Perlakuan tanpa sel diperlukan untuk memperoleh faktor koreksi

terhadap perlakuan. Sedangkan perlakuan dengan sel Vero dimaksudkan untuk

mengetahui efek sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel normal.

Sel myeloma yang sehat dan hidup tampak berbentuk bulat, berkoloni

dan transparan. Sel myeloma yang mati akan memiliki warna atau bintik hitam di

dalam selnya (gambar 1a). Sel Vero yang sehat berbentuk filamen dan mengendap

di dinding atau dasar plate (gambar 1b).

30

(a) (b) Gambar 1. Sel myeloma dan sel Vero

(a) sel myeloma yang sehat (b) sel Vero yang sehat

Metode MTT termasuk dalam kolorimetri. Prinsip dasar metode MTT

adalah reduksi garam tetrazolium MTT {3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil

tetrazolium bromida} menjadi formazan yang tak larut dan berwarna ungu oleh

enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam mitokondria sel.

Jumlah formazan yang terbentuk kemudian akan bereaksi dengan sel hidup.

Intensitas warna ungu yang terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang hidup.

Pada plate kemudian ditambahkan reagen stopper untuk menghentikan reaksi

reduksi yang berlangsung secara enzimatis. Komposisi reagen stopper adalah

sodium dodesil sulfat 10% dan HCl 0,01 N. Reagen stopper digunakan untuk

melisiskan sel dan melarutkan formazan. Plate diinkubasikan semalam pada suhu

kamar untuk menyempurnakan reaksi. Intensitas warna ungu yang terbentuk

31

diukur absorbansinya dengan menggunakan ELISA reader pada panjang

gelombang 550 nm.

Untuk mengetahui hasil uji sitotoksisitas ini, dilakukan perhitungan

persen kematian untuk tiap-tiap derajat kejenuhan fraksi protein dengan

menggunakan rumus Abbot (lampiran 2).

Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap kultur sel myeloma Kadar (μg/ml) % kematian

perlakuan FP20

% kematian perlakuan

FP40


FP60


FP80

4000 106,13 101,44 103,02 105,46 2000 101,98 100,99 86,63 79,90 1000 81,43 97,12 67,81 63,02 500 67,18 73,40 57,56 57,00 250 63,21 60,14 53,95 52,00 125 49,792 51,94 54,44 53,00

Kurva Hubungan Konsentrasi Fraksi Protein Umbi Teki vs Persen Kematian Sel Myeloma

020406080

100120

125 250 500 1000 2000 4000

Konsentrasi Fraksi Protein (µg/ml)

Pers

en K

emat

ian

Sel

FP20FP40FP60FP80

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi fraksi protein umbi teki vs persen kematian sel

myeloma

Semakin tinggi konsentrasi seri kadar fraksi protein maka semakin

tinggi pula persen kematian sel myeloma (tabel I dan gambar 2). Persen kematian

sel myeloma yang tertinggi diperoleh dari perlakuan FP40. Persen kematian sel

32

yang terendah diperoleh pada perlakuan FP80. Hasil uji sitotoksisitas ini didukung

dengan morfologi sel myeloma secara mikroskopis setelah memperoleh perlakuan

dengan fraksi protein (gambar 3).

ii---

i---

(a) (b)

(c) (d) Gambar 3. Morfologi sel myeloma dengan perlakuan

(a) FP20 (c) FP60 (b) FP40 (d) FP80

(i) sel hidup (ii) sel mati

33

Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap kultur sel Vero

Kadar (μg/ml) % kematian perlakuan

FP20


FP40


FP60


FP80 4000 96,57 111,06 100,30 95,01 2000 87,94 90,44 92,22 91,76 1000 81,23 85,72 82,92 81,18 500 74,45 78,52 77,02 76,87 250 70,09 71,31 75,28 74,23 125 71,16 70,52 73,17 76,19

Kurva Hubungan Konsentrasi Fraksi Protein Umbi Teki vs Persen Kematian Sel Vero

0204060

80100120

125 250 500 1000 2000 4000

Konsentrasi Fraksi Protein (µg/ml )

Per

sen

Kem

atia

n S

el

FP20FP40FP60FP80

Gambar 4. Kurva hubungan konsentrasi fraksi protein umbi teki vs persen kematian sel

Vero

Semakin tinggi konsentrasi seri kadar fraksi protein maka semakin tinggi

pula persen kematian sel Vero (tabel II dan gambar 4). Persen kematian sel Vero

yang tertinggi diperoleh dari perlakuan FP40. Persen kematian sel yang terendah

diperoleh pada perlakuan FP80. Hasil uji sitotoksisitas ini didukung dengan

morfologi sel Vero secara mikroskopis setelah memperoleh perlakuan dengan

fraksi protein (gambar 5).

34

i---ii---

(a) (b)

(c) (d) Gambar 5. Tampilan mikroskopis sel Vero dengan perlakuan

(a) FP20 (c) FP60 (b) FP40 (d) FP80

(i) sel hidup (ii) sel mati

Sel myeloma dan sel Vero mempunyai persen kematian tertinggi pada

FP40. Hasil ini menunjukkan aktivitas sitotoksik fraksi protein umbi teki tidak

selektif terhadap sel myeloma saja. Kemungkinan protein yang mempunyai

aktivitas sitotoksik terbesar mengendap pada FP40 umbi teki. Pada FP80, protein

yang mengendap adalah protein dengan bobot molekul yang kecil dengan

aktivitas sitotoksik yang relatif lebih rendah.

35

LC50 untuk tiap-tiap fraksi protein terhadap sel myeloma dapat dihitung

dengan menggunakan analisis probit pada SPSS 13. Nilai LC50 yang didapat

untuk FP20 adalah sebesar 72,15 µg/ml dan untuk FP40 adalah sebesar 144,77

µg/ml. Sedangkan Nilai LC50 untuk FP60 sebesar 150,19 µg/ml dan untuk FP80

adalah sebesar 168,69 µg/ml (lampiran 4). Nilai LC50 yang diperoleh merupakan

nilai LC50 secara intrapolasi.

Tabel III. LC50 hasil interpolasi analisis probit untuk sel myeloma dan sel Vero.

Sel myeloma Sel Vero Fraksi Protein Umbi Teki

LC50 (µg/ml)

t hitung

t tabel

LC50 (µg/ml)

t hitung

t tabel

FP20 72,15 3,642 2,920 35,09 4,514 2,132 FP40 144,77 3,352 2,920 27,36 6,983 2,353 FP60 150,19 6,540 2,353 14,73 3,785 2,353 FP80 168,69 7,332 2,353 16,43 4,358 2,132

Nilai LC50 untuk sel myeloma dan sel Vero pada setiap fraksi perlakuan

adalah signifikan dengan taraf kepercayaan 90%. Hal ini ditunjukkan oleh nilai t

hitung yang lebih besar dari nilai t tabel (lampiran 8).

Nilai LC50 terhadap sel myeloma yang diperoleh lebih besar daripada

LC50 terhadap sel Vero (tabel III). Perbedaan nilai LC50 tersebut secara kasar

menunjukkan bahwa fraksi protein umbi teki lebih toksik terhadap sel Vero

dibandingkan terhadap sel myeloma. Untuk dapat menimbulkan kematian pada

50% populasi sel Vero hanya diperlukan konsentrasi fraksi protein umbi teki yang

relatif kecil (<40 µg/ml). Sementara untuk menimbulkan kematian pada 50%

populasi sel myeloma diperlukan konsentrasi fraksi protein umbi teki yang lebih

besar (> 150 µg/ml).

36

Distribusi data persen kematian sel myeloma dan sel Vero yang diperoleh

dianalisis dengan uji Kolmogorov-Smirnov. Uji Kolmogorov-Smirnov

memberikan hasil bahwa data persen kematian untuk setiap fraksi adalah normal.

Hasilnya menunjukkan bahwa data yang diuji adalah homogen pada semua fraksi

protein untuk sel myeloma dan sel Vero.

Signifikansi data LC50 tersebut diuji dengan uji t-independent. Uji ini

digunakan untuk melihat adanya variansi antara LC50 sel myeloma dan sel Vero.

Dari hasil uji diperoleh nilai signifikansi dua sisi (sig. 2-tailed) untuk FP20, FP40,

FP60, dan FP80 < 0,1. Nilai signifikansi menunjukkan bahwa ada perbedaan

bermakna antara dua rataan LC50 sel myeloma dan sel Vero untuk masing-masing

fraksi protein. Menurut hasil uji t-independent, maka keempat fraksi protein ini

memberikan perbedaan hasil jika diberikan pada sel myeloma dan sel Vero.

Senyawa dengan potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker

(Suffness dan Pezzuto cit Hariadi, 2006) adalah senyawa yang memiliki nilai LC50

lebih kecil dari 20 µg/ml. Nilai LC50 yang diperoleh untuk masing-masing fraksi

protein terhadap sel myeloma lebih besar dari 20 µg/ml. Oleh karena itu, keempat

fraksi protein umbi teki ini tidak dapat dikembangkan menjadi senyawa

antikanker. Secara umum nilai LC50 yang diperoleh hanya menunjukkan bahwa

fraksi protein umbi teki mempunyai efek sitotoksik terhadap sel myeloma dan

mampu menginhibisi pertumbuhan sel myeloma.

37

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan

Dari hasil percobaan dan analisis data dapat disimpulkan bahwa :

1. Fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 memiliki efek sitotoksik

terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero.

2. Nilai LC50 dari fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 untuk sel

myeloma berturut-turut adalah 72,15 µg/ml, 144,77 µg/ml, 150,19 µg/ml,

168,69 µg/ml, sementara untuk sel Vero berturut-turut adalah 35,1 µg/ml, 27,4

µg/ml, 14,7 µg/ml, 16,4 µg/ml.

3. Fraksi protein umbi teki bersifat lebih toksik terhadap sel Vero daripada

terhadap sel myeloma.

2. Saran

Hal-hal yang dapat disarankan dari hasil penelitian ini adalah :

1. Perlu dilakukan pengamatan kematian sel dengan waktu inkubasi lebih dari 24

jam.

2. Perlu dilakukan pengujian efek sitotoksik protein yang diisolasi dari bagian

lain rumput teki, yang diharapkan memiliki efek sitotoksik yang lebih besar

terhadap sel myeloma dan lebih kecil terhadap sel Vero.

38

3. Perlu dilakukan pengujian sitotoksisitas fraksi protein umbi teki dengan

metode yang lain.

39

DAFTAR PUSTAKA

Anonim,1980, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, 46-48, Dep.Kes R.I., Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 1112, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2006a, Herb Information : Cyperus rotundus L.,

http://www.holisticonline.com. Diakses pada 5 Febuari 2006. Anonim, 2006b, Cancer, http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer. Diakses pada 15

Oktober 2006. Anonim, 2006c , Enzym Purification by Salt (Ammonium Sulfate) Precipitation,

http://www.glue.umd.edu/~NSW/ench485/lab6a.htm. Diakses pada 20 September 2006.

Anonim, 2006d, Overview Multiple Myeloma,

http://www.westclinic.com/content.aspx?section=typesofcancer&id=830. Diakses pada 20 Februari 2006.

Anonim, 2006e, Multiple Myeloma,

http://www.multiplemyeloma.org/about_myeloma. Diakses pada 20 Februari 2006

Anonim, 2006f, Treatment of Multiple Myeloma at Mayoclinic,

http://www.mayoclinic.org/multiple-myeloma/treatment.htm. Diakses pada 20 Februari 2006.

Anonim, 2006g, NS 0/1, http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/cl3735.html.

Diakses pada 15 Oktober 2006. Anonim, 2006i , Normal African Green Monkey Kidney Epithelial Cells (Vero

line), http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/Vero/Verocells.html. Diakses pada 5 Februari 2006.

Anonim, 2006j, Cell Proliferation Kit I (MTT),

http://www.ub.es/biocel/wbc/prac/pdf/MTTassay03.pdf. Diakses pada 10 Oktober 2006.

Anonim, 20006k, Methods for Concentrating Protein Solutions, Protein

Concentration, http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Concentration.html. Diakses pada Juli 2006.

http://www.holisticonline.com/

http://www.glue.umd.edu/%7ENSW/ench485/lab6a.htm

http://www.westclinic.com/content.aspx?section=typesofcancer&id=830

http://www.multiplemyeloma.org/about_myeloma

http://www.mayoclinic.org/multiple-myeloma/treatment.htm

http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/cl3735.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/Vero/Verocells.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/Vero/Verocells.html

http://www.ub.es/biocel/wbc/prac/pdf/MTTassay03.pdf

http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Concentration.html

40

Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1968, Flora of Java, Vol.3, 451-479, N.V.P. Noordhoof, Groningen.

Bowman, W.C., dan Rand, M.J., 1980, Textbook of Pharmacology, 2nd Edition,

38.16., Blackwell Scientific Publication, London. DiPiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., Posey, L.M.,

2005, Pharmacotherapy : a Patophysiologic Approach, 6th Edition, 2280, 2281, 2285, Mc-Graw Hill Companies Inc., New York.

Duke, James A., 2001, Handbook of Phytochemical Constituent of GRAS herbs

and other Economic Plants, 220, CRC Press, New York. Girindra, A., 1993, Biokimia I, 79, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Hanks, Amy K., 2000, Cancer and Traditional Chinese Medicine,

http//www.eastlandpress.com/upload/_pdf_20040706145633_2/AmyHanks.pdf. Diakses pada Maret 2006.

Hariadi, Arry, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, dan 100% Jenuh terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Hartini, Yustina Sri, 1993, Identifikasi Mikroskopik Umbi Cyperus rotundus L.

serta Daya Anti Inflamasi Ekstrak Etanolnya, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Hoffman, David L., 2006, More Semantics! Cytotoxic, Anti-Cancer and Anti-

Tumor, http://www.healthy.net/scr/Article.asp?Id=1583. Diakses pada 18 Oktober 2006.

Nafrialdi dan Sulistia, G., 1995, Antikanker, dalam Ganiswarna, Sulistia G.,

(Ed.), Farmakologi dan Terapi, Ed. ke-4, 687, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Ostle, B., 1954, Statistics in Research : Basic Concepts and Techniques for

Research Workers, The IOWA State College Press, Ames, IOWA, 174-201, 450-451.

Poedjiadi, A.,1994, Dasar-Dasar Biokimia, 123-124, Penerbit Universitas

Indonesia, Jakarta. Rahardjo, B., 1990, Isolasi dan Identifikasi Flavonoid dari Umbi Cyperus

rotundus L., Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

http://www.healthy.net/scr/Article.asp?Id=1583

http://www.healthy.net/scr/articles.%20Diakses%20pada%20Februari%202006

http://www.healthy.net/scr/articles.%20Diakses%20pada%20Februari%202006

41

Rahardja, V., 1994, Profil Kromatografi Umbi Cyperus rotundus L. serta Khasiat Anti Radang dari Ekstrak Etanolnya, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Rahayu, B., 1989, Efek Anthelmintik dari Umbi Cyperus rotundus Linn serta

Profil Kromatografinya, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Richterich, R., and Colombo, J.P., 1957, Clinical Chemistry : Theory, Practice,

and Interpretation, 408, John Willey & Sons, Chichester. Robinson, T.,1991, Kandungan Kimia Organik Tumbuhan Tinggi, 247, 250,

diterjemahkan oleh Kosasih Panduwinata, Penerbit ITB, Bandung. Sudarsono, 1996, Tumbuhan Obat Hasil Penelitian, Sifat-Sifat dan Penggunaan,

Pusat Penelitian Obat Tradisional UGM (PPOT UGM), Yogyakarta Soedibyo, Mooryati, 1998, Alam Sumber Kesehatan Manfaat dan Kegunaan, 360-

361, Balai Pustaka, Jakarta. Suhartiningsih, R., 1996, Daya Melarutkan Minyak Atsiri dan Infus Umbi Teki

(Cyperus rotundus L.) terhadap Batu Ginjal Kalsium secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Wijayakusuma, H. M. H., 2005, Sehat Dengan Teki, http://www.trubus-

online.com/bacaartikel.php?. Diakses pada 8 Februari 2006.

http://www.trubus-online.com/bacaartikel.php

http://www.trubus-online.com/bacaartikel.php

42

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat FP20, FP40, FP60, dan FP80 Jumlah penambahan amonium sulfat juga dapat dihitung dengan rumus:

G = ( )S1 0,3-100)1S(S2335

×−×

(Anonim, 2006k)

Keterangan:

G = gram amonium sulfat yang ditambahkan per liter larutan

S1 = persen kejenuhan larutan mula-mula

S2 = persen kejenuhan larutan akhir

Diasumsikan bahwa percobaan dilakukan pada suhu 4OC • Fraksi protein umbi teki FP20

G = ( ) 6,106100

106600 0,3-100

)0(20335==

×−× g

Supernatan 700 ml 60,746,1061000700

=× g

• Fraksi protein umbi teki FP40

G = ( ) 40,11394

1066020 0,3-100

)20(40335==

×−× g

Supernatan 700 ml 40,79404,1131000700

=× g


G = ( ) 14,12188

1066040 0,3-100

)40(60335==

×−× g

Supernatan 720 ml =× 136,1211000720 87,22 g


G = ( ) 00,13082

1066060 0,3-100

)60(80335==

×−× g

Supernatan 760 ml 80,981301000760

=× g

43

Lampiran 2. Absorbansi sel dengan metode MTT Tabel IV. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP20 terhadap kultur sel myeloma

Absorbansi

Perlakuan (B) Perlakuan tanpa sel (C)

Konsentrasi Fraksi Protein (µg/ml) I II III Rata-

rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 1,114 1,084 1,111 1.103 1.186 1.156 1.171 1,113 2000 0,929 0,888 0,918 0.912 0.932 0.936 0.934 1,069 1000 0,973 0,945 0,954 0.957 0.734 0.768 0.751 1,096 500 0,988 0,985 1,018 0.997 0.637 0.629 0.633 1,136 250 0,929 0,969 0,960 0.953 0.535 0.554 0.545 1,164 125 0,966 0,990 0,972 0.976 0.522 0.515 0.513 1,087

Rata-rata 1,111

Tabel V. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP40 terhadap kultur sel myeloma

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 0,821 0,844 0,784 0,816 0,932 0,933 0,933 1,113 2000 0,753 0,764 0,728 0,748 0,839 0,825 0,832 1,069 1000 0,920 1,004 0,970 0,965 0,723 0,795 0,759 1,096 500 0,924 0,959 0,921 0,935 0,637 0,643 0,640 1,136 250 1,024 1,016 1,012 1,017 0,572 0,577 0,575 1,164 125 1,047 1,013 1,036 1,032 0,505 0,492 0,499 1,087

Rata-rata

Tabel VI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP60 terhadap kultur sel myeloma

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 0,947 0,951 0,926 0,941 0,966 0,977 0,972 1,035 2000 0,958 0,935 0,948 0,947 0,811 0,808 0,810 1,002 1000 1,033 1,028 1,026 1,029 0,686 0,712 0,699 1,052 500 1,039 1,066 1,061 1,055 0,626 0,613 0,620 1,057 250 1,044 1,042 1,038 1,041 0,565 0,573 0,569 0,992 125 0,925 1,050 1,052 1,009 0,545 0,539 0,542 1,020

Rata-rata 1,026

44

Tabel VII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP80 terhadap kultur sel myeloma

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 0,975 0,953 0,960 0,963 1,008 1,029 1,019 1,035 2000 1,028 1,028 1,033 1,030 0,826 0,822 0,824 1,002 1000 1,072 1,044 1,043 1,053 0,660 0,688 0,674 1,052 500 1,063 1,060 0,994 1,039 0,565 0,613 0,589 1,057 250 1,016 1,022 1,007 1,015 0,501 0,544 0,523 0,992 125 1,011 0,986 1,029 1,009 0,505 0,530 0,518 1,020

Rata-rata 1,026

Keterangan tabel I, II, III, IV:

A = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

myeloma tanpa perlakuan fraksi protein umbi teki.

B = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

myeloma dengan perlakuan fraksi protein umbi teki.

C = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan fraksi

protein umbi teki tanpa adanya sel myeloma.

Persen kematian sel dihitung dengan rumus:


C)(BA −−

Keterangan rumus:




45

Tabel VIII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP20 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 1,497 1,482 1,428 1,469 1,412 1,430 1,421 1,421 2000 1,422 1,453 1,436 1,437 1,249 1,286 1,268 1,376 1000 1,470 1,422 1,419 1,437 1,150 1,197 1,174 1,412 500 1,440 1,398 1,400 1,413 1,115 0,995 1,055 1,396 250 1,420 1,381 1,406 1,402 0,991 0,975 0,983 1,381 125 1,407 1,386 1,409 1,401 0,977 1,017 0,997 1,420

Rata-rata 1,401

Tabel IX. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP40 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 1,104 1,050 1,234 1,129 1,280 1,287 1,284 1,421 2000 1,315 1,354 1,316 1,328 1,218 1,169 1,194 1,376 1000 1,361 1,379 1,380 1,373 1,172 1,173 1,173 1,412 500 1,368 1,389 1,368 1,375 1,074 1,073 1,074 1,396 250 1,388 1,392 1,398 1,393 0,974 1,008 0,991 1,381 125 1,419 1,384 1,398 1,400 0,985 0,989 0,987 1,420

Rata-rata 1,401

Tabel X. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP60 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 1,358 1,362 1,329 1,350 1,349 1,359 1,354 1,333 2000 1,316 1,303 1,280 1,300 1,188 1,206 1,197 1,300 1000 1,351 1,345 1,327 1,341 1,105 1,125 1,115 1,259 500 1,329 1,331 1,323 1,328 1,037 1,011 1,024 1,343 250 1,294 1,296 1,287 1,292 0,960 0,970 0,965 1,306 125 1,286 1,342 1,294 1,307 0,952 0,952 0,952 1,398

Rata-rata 1,323

46

Tabel XI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP80 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi



rata I II Rata-rata

Kontrol (A)

4000 1,406 1,363 1,410 1,393 1,333 1,320 1,327 1,333 2000 1,279 1,277 1,302 1,286 1,170 1,184 1,177 1,300 1000 1,323 1,335 1,340 1,333 1,068 1,099 1,084 1,259 500 1,340 1,326 1,293 1,320 0,997 1,030 1,014 1,343 250 1,311 1,271 1,320 1,300 0,959 0,959 0,959 1,306 125 1,265 1,296 1,276 1,279 0,956 0,971 0,964 1,398

Rata-rata 1,323

Keterangan tabel I, II, III, IV:

A = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

Vero tanpa perlakuan fraksi protein umbi teki.

B = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

Vero dengan perlakuan fraksi protein umbi teki.

C = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan fraksi

protein umbi teki tanpa adanya sel Vero.

Persen kematian sel dihitung dengan rumus:


C)(BA −−

Keterangan rumus dan tabel:




47

Lampiran 3. Cara perhitungan kadar protein

Rumus perhitungan kadar protein :

Konsentrasi = [1,55E(280)]-[0,76E(260)] mg ml-1

(Layne, 1957; cit Richterich, 1957)

Konsentrasi yang diperoleh kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran

sebesar 100 kali.

Tabel XII. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm

Fraksi protein umbi teki Absorbansi pada λ 280 nm

Absorbansi pada λ 260 nm

FP20 0,466 0,609

FP40 0,208 0,245

FP60 0,442 0,461

FP80 0,499 0,486 FP20

Konsentrasi protein = [(1,55 X 0,466) – (0,76 X 0,609)] X 100

= 25,95 mg/ml

FP40


= 13,62 mg/ml

FP60


= 33,47 mg/ml

FP80


= 40,41 mg/ml

48

Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) terhadap kultur sel myeloma dengan metode MTT

PROBIT MYELOMA FP20 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 4 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .68157 .19809 3.44069 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1.26651 .50367 -2.51457 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 1.889 DF = 2 P = .389 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies

49

Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 2.10 100.0 58.8 56.462 2.330 .56462 2.40 100.0 63.2 64.351 -1.141 .64351 2.70 100.0 67.2 71.669 -4.491 .71669 3.00 100.0 81.4 78.178 3.247 .78178 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .02786 .00000 .85484 .02 .06998 .00000 1.54002 .03 .12552 .00000 2.23781 .04 .19481 .00001 2.96468 .05 .27854 .00002 3.72727 .06 .37762 .00005 4.52946 .07 .49311 .00009 5.37413 .08 .62618 .00015 6.26371 .09 .77815 .00025 7.20046 .10 .95045 .00040 8.18661 .15 2.17553 .00271 13.93919 .20 4.20140 .01245 21.30455 .25 7.38939 .04599 30.69791 .30 12.26928 .14843 42.68325 .35 19.62804 .43870 58.04868 .40 30.65547 1.22327 77.93603 .45 47.18981 3.28499 104.08857 .50 72.14700 8.62136 139.39339 .55 110.30324 22.30927 189.32751 .60 169.79641 56.72697 267.04524 .65 265.19143 135.66693 418.02422 .70 424.24564 270.23566 843.53994 .75 704.41394 442.28800 2312.81387 .80 1238.91879 681.21258 7990.85675 .85 2392.60359 1075.81558 35515.26054 .90 5476.55593 1866.82588 237606.60704 .91 6689.14651 2128.64139 376741.60760 .92 8312.57843 2453.56274 621933.78259 .93 10555.89795 2866.89065 1079792.26336 .94 13784.09341 3409.58491 2000577.12060 .95 18687.16441 4152.77781 4044191.41918 .96 26719.01877 5232.40008 9251508.65937 .97 41468.08298 6946.97557 25604331.2537 .98 74382.97559 10117.21421 99169353.9212 .99 186822.88205 18272.29600 839137539.195

50

Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.0 2.82.62.42.22.0

Log of konsentrasi

0.9

0.8

0.7 0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

Probit

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.869

PROBIT MYELOMA FP40 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 4 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 12 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E.

51

konsentr 1.62501 .22513 7.21806 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -3.51112 .55868 -6.28469 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 10.363 DF = 2 P = .006 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 2.10 100.0 51.9 45.873 6.066 .45873 2.40 100.0 60.1 65.009 -4.865 .65009 2.70 100.0 73.4 80.914 -7.514 .80914 3.00 100.0 97.1 91.370 5.745 .91370 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 5.35902 . . .02 7.88566 . . .03 10.07562 . . .04 12.11539 . . .05 14.07553 . . .06 15.99184 . . .07 17.88558 . . .08 19.77072 . . .09 21.65717 . . .10 23.55236 . . .15 33.33311 . . .20 43.92985 . . .25 55.66849 . .

52

.30 68.86074 . . .35 83.86081 . . .40 101.10511 . . .45 121.15703 . . .50 144.76993 . . .55 172.98487 . . .60 207.29253 . . .65 249.91810 . . .70 304.35826 . . .75 376.48470 . . .80 477.08642 . . .85 628.75432 . . .90 889.86132 . . .91 967.73196 . . .92 1060.06947 . . .93 1171.80090 . . .94 1310.56416 . . .95 1488.99051 . . .96 1729.89334 . . .97 2080.10463 . . .98 2657.77852 . . .99 3910.85146 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.0 2.82.62.42.2 2.0 Log of konsentrasi

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.849

PROBIT MYELOMA

53

FP60 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .72655 .14055 5.16931 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1.58142 .37819 -4.18154 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 8.743 DF = 3 P = .033 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 2.10 100.0 54.4 47.691 6.748 .47691

54

2.40 100.0 54.0 56.387 -2.436 .56387 2.70 100.0 57.6 64.784 -7.223 .64784 3.00 100.0 67.8 72.515 -4.710 .72515 3.30 100.0 86.6 79.302 7.332 .79302 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .09434 . . .02 .22382 . . .03 .38722 . . .04 .58483 . . .05 .81789 . . .06 1.08813 . . .07 1.39762 . . .08 1.74875 . . .09 2.14413 . . .10 2.58664 . . .15 5.62484 . . .20 10.42904 . . .25 17.71248 . . .30 28.50086 . . .35 44.28777 . . .40 67.28656 . . .45 100.84896 . . .50 150.18557 . . .55 223.65829 . . .60 335.21862 . . .65 509.29874 . . .70 791.40449 . . .75 1273.43612 . . .80 2162.77975 . . .85 4010.01809 . . .90 8720.07415 . . .91 10519.76859 . . .92 12898.21662 . . .93 16138.60443 . . .94 20728.85848 . . .95 27577.76331 . . .96 38567.71199 . . .97 58250.58264 . . .98 100774.61460 . . .99 239083.04816 . . Abbreviated Extended Name Name

55

konsentr konsentrasi

PROBIT MYELOMA

3.4 3.23.02.82.62.42.2 2.0 Log of konsentrasi

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.768

FP80 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .59117 .13688 4.31901 Intercept Standard Error Intercept/S.E.

56

-1.31660 .37056 -3.55298 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 5.172 DF = 3 P = .160 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 2.10 100.0 52.1 46.933 5.165 .46933 2.40 100.0 52.0 54.023 -2.023 .54023 2.70 100.0 56.1 60.986 -4.888 .60986 3.00 100.0 63.0 67.614 -4.590 .67614 3.30 100.0 79.9 73.725 6.177 .73725 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .01959 .00000 .46674 .02 .05663 .00003 .97123 .03 .11108 .00010 1.54660 .04 .18438 .00026 2.19517 .05 .27844 .00056 2.91912 .06 .39547 .00106 3.72109 .07 .53791 .00187 4.60418 .08 .70850 .00309 5.57192 .09 .91019 .00488 6.62825 .10 1.14625 .00743 7.77749 .15 2.97789 .04241 15.09636 .20 6.35980 .16893 25.62498 .25 12.19425 .55160 40.43904

57

.30 21.87957 1.59179 61.09398 .35 37.60970 4.23282 89.90992 .40 62.88392 10.64122 130.53340 .45 103.40146 25.69172 189.20304 .50 168.69000 59.94281 278.20641 .55 275.20228 133.74930 427.75561 .60 452.52137 273.31176 732.54950 .65 756.62184 487.80230 1498.05225 .70 1300.58869 791.11766 3614.79282 .75 2333.58536 1251.82498 9959.54439 .80 4474.40460 2025.03932 31726.12942 .85 9555.86718 3488.54665 124510.97011 .90 24825.62526 6837.45142 703541.03836 .91 31264.09980 8035.57408 1070051.04690 .92 40164.34275 9573.13654 1688065.01628 .93 52901.29547 11601.59542 2787581.66931 .94 71956.39703 14374.21135 4882792.87375 .95 102198.48314 18347.07445 9257069.44743 .96 154335.38552 24428.94208 19635285.0244 .97 256182.31674 34717.65450 49512812.7612 .98 502472.15660 55358.68546 169419028.813 .99 1452871.70993 115370.09744 1178877696.54 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.4 3.23.02.82.62.42.22.0 Log of konsentrasi

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.79

Lampiran 5. Uji distribusi data sel myeloma dengan Kolmogorov-Smirnov

58

NPar Tests MYELOMA FP20

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

374.5264

15.86975.188.181

-.188.325

1.000

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

LC 50

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.



3117.169216.39921

.175

.175-.174.303

1.000

NMeanStd. Deviation





LC 50




59


3149.112051.74351

.372

.270-.372.644.801

NMeanStd. Deviation





LC 50





3167.948610.74114

.289

.289-.210.501.964

NMeanStd. Deviation





LC 50



60

Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) terhadap kultur sel Vero dengan metode MTT

PROBIT VERO

FP20 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 6 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 11 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .69418 .12340 5.62557 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1.07266 .34157 -3.14036 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 6.484 DF = 4 P = .166 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob

61

3.60 100.0 96.6 92.333 4.237 .92333 3.30 100.0 87.9 88.855 -.915 .88855 3.00 100.0 81.2 84.372 -3.142 .84372 2.70 100.0 74.5 78.841 -4.391 .78841 2.40 100.0 70.1 72.305 -2.215 .72305 2.10 100.0 71.2 64.913 6.247 .64913 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .01563 .00006 .23648 .02 .03861 .00023 .46333 .03 .06852 .00056 .71006 .04 .10550 .00108 .97911 .05 .14987 .00185 1.27166 .06 .20206 .00292 1.58870 .07 .26258 .00436 1.93123 .08 .33200 .00624 2.30028 .09 .41095 .00865 2.69694 .10 .50012 .01168 3.12241 .15 1.12767 .04053 5.72972 .20 2.15190 .10881 9.29040 .25 3.74614 .25368 14.07566 .30 6.16306 .54204 20.45923 .35 9.77572 1.09433 28.96256 .40 15.14482 2.12883 40.32806 .45 23.13146 4.04629 55.64099 .50 35.09340 7.59651 76.54260 .55 53.24121 14.21695 105.62733 .60 81.31799 26.74433 147.24968 .65 125.98009 50.94853 209.37161 .70 199.82729 98.80493 308.55898 .75 328.75098 194.53461 486.73020 .80 572.30779 380.55978 878.85072 .85 1092.11373 727.39645 2001.65548 .90 2462.49196 1455.28313 6367.91994 .91 2996.82134 1704.51475 8501.24752 .92 3709.47578 2019.20792 11662.92051 .93 4690.16408 2427.50624 16547.38147 .94 6094.90591 2975.84955 24506.20474 .95 8217.36387 3746.63786 38426.70996 .96 11673.20988 4901.28288 65314.24413 .97 17972.88308 6804.91673 125643.43715 .98 31898.47320 10499.87660 300558.18448

62

.99 78788.80580 20723.27466 1192760.28975 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.53.02.52.0 Log of konsentrasi

2.00

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

Probit


R Sq Linear = 0.836

PROBIT VERO

FP40 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found.

63

Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .68381 .15660 4.36651 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.98271 .41527 -2.36643 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 1.444 DF = 3 P = .695 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 3.30 100.0 90.4 89.877 .563 .89877 3.00 100.0 87.2 85.740 1.480 .85740 2.70 100.0 78.5 80.590 -2.070 .80590 2.40 100.0 71.3 74.442 -3.132 .74442 2.10 100.0 70.5 67.407 3.113 .67407 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .01084 .00000 .29083 .02 .02715 .00001 .54902 .03 .04860 .00003 .82176 .04 .07532 .00007 1.11316 .05 .10757 .00013 1.42501 .06 .14568 .00022 1.75851 .07 .19007 .00035 2.11469

64

.08 .24118 .00054 2.49455 .09 .29950 .00080 2.89908 .10 .36557 .00115 3.32935 .15 .83451 .00513 5.90770 .20 1.60814 .01680 9.32626 .25 2.82316 .04645 13.80900 .30 4.67978 .11569 19.66090 .35 7.47508 .26922 27.30328 .40 11.65771 .59931 37.33021 .45 17.92011 1.29786 50.60227 .50 27.35946 2.77042 68.41044 .55 41.77094 5.89482 92.78323 .60 64.20983 12.63013 127.12135 .65 100.13802 27.49869 177.70748 .70 159.95184 61.17648 258.13966 .75 265.14247 137.65437 406.81332 .80 465.47022 295.38519 776.18393 .85 896.98386 571.36283 2074.90475 .90 2047.59819 1108.49131 8452.69557 .91 2499.33065 1287.34323 11991.76939 .92 3103.70200 1510.93477 17575.59728 .93 3938.21988 1798.03723 26815.62752 .94 5138.11518 2179.34221 43068.33479 .95 6958.83617 2708.77165 74072.28004 .96 9938.15282 3490.78452 140329.02311 .97 15401.90902 4758.59786 308424.33421 .98 27574.26114 7167.00301 880622.31831 .99 69048.11301 13620.10770 4617645.23852 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

65

3.43.23.02.82.62.42.22.0

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

Probit


R Sq Linear = 0.942

FP60 Probit VERO � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .56908 .15647 3.63705

66

Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.66484 .41670 -1.59547 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 2.965 DF = 3 P = .397 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 3.30 100.0 92.2 88.757 3.453 .88757 3.00 100.0 82.9 85.139 -2.219 .85139 2.70 100.0 77.0 80.815 -3.795 .80815 2.40 100.0 75.3 75.797 -.517 .75797 2.10 100.0 73.2 70.142 3.028 .70142 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00120 3.84803E-010 .10773 .02 .00363 4.20050E-009 .22101 .03 .00730 .00000 .34872 .04 .01236 .00000 .49151 .05 .01896 .00000 .64984 .06 .02730 .00000 .82427 .07 .03758 .00000 1.01539 .08 .05003 .00000 1.22389 .09 .06490 .00000 1.45054 .10 .08247 .00000 1.69617 .15 .22234 .00003 3.24327 .20 .48905 .00017 5.43322 .25 .96170 .00074 8.46495 .30 1.76513 .00276 12.61573

67

.35 3.09864 .00931 18.27687 .40 5.28538 .02948 26.01175 .45 8.86029 .08973 36.65337 .50 14.73201 .26782 51.47600 .55 24.49492 .79683 72.51882 .60 41.06268 2.40048 103.25592 .65 70.04109 7.43345 150.19524 .70 122.95507 23.95310 227.67532 .75 225.67607 79.69721 378.95839 .80 443.78384 244.60556 830.48437 .85 976.10906 570.36212 3284.77894 .90 2631.62318 1223.90942 25056.50717 .91 3343.92811 1450.10822 41542.27933 .92 4337.85373 1738.29644 72162.50597 .93 5774.89671 2116.19166 132781.45716 .94 7949.38589 2629.96262 262981.39707 .95 11445.20493 3362.45374 574597.34464 .96 17562.80757 4478.11577 1442407.44448 .97 29731.77736 6354.96120 4481904.14180 .98 59860.52782 10094.40589 20281583.4086 .99 180366.36712 20855.61391 219825738.243 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.43.23.02.82.62.4 2.22.0

Log of konsentrasi

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

Probit


R Sq Linear = 0.827

68

PROBIT VERO

FP80 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 6 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .59996 .12532 4.78761 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.72939 .34781 -2.09706 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 6.486 DF = 4 P = .166 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob 3.60 100.0 95.0 92.389 2.621 .92389

69

3.30 100.0 91.8 89.455 2.305 .89455 3.00 100.0 81.2 85.780 -4.600 .85780 2.70 100.0 76.9 81.324 -4.454 .81324 2.40 100.0 74.2 76.093 -1.943 .76093 2.10 100.0 76.1 70.149 5.961 .70149 � * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00218 .00000 .08204 .02 .00620 .00000 .17268 .03 .01205 .00001 .27695 .04 .01985 .00002 .39517 .05 .02979 .00003 .52771 .06 .04210 .00006 .67507 .07 .05700 .00010 .83782 .08 .07478 .00015 1.01662 .09 .09572 .00023 1.21223 .10 .12013 .00034 1.42545 .15 .30777 .00168 2.78943 .20 .65002 .00593 4.75962 .25 1.23452 .01749 7.53314 .30 2.19616 .04618 11.38642 .35 3.74524 .11346 16.71176 .40 6.21512 .26594 24.07704 .45 10.14550 .60550 34.32528 .50 16.43323 1.35834 48.74865 .55 26.61781 3.03941 69.41053 .60 43.45062 6.86249 99.78912 .65 72.10512 15.81636 146.21059 .70 122.96500 37.62823 221.59121 .75 218.74937 92.96916 357.92959 .80 415.44899 233.57489 665.31984 .85 877.45754 552.22348 1696.35254 .90 2247.93334 1260.00612 7126.82033 .91 2821.38532 1508.73476 10274.26519 .92 3611.30114 1827.32173 15350.42420 .93 4737.36974 2247.61056 23956.76982 .94 6414.80708 2823.00294 39513.32503 .95 9064.14655 3650.00166 70130.99904 .96 13605.85988 4921.69390 138013.37349 .97 22417.45123 7086.09506 318183.16892 .98 43537.56540 11464.17935 969135.00957 .99 123944.08340 24352.46849 5634760.76687

70

Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

3.53.02.5 2.0

Log of konsentrasi

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

Probit


R Sq Linear = 0.826

71

Lampiran 7. Uji distribusi data sel Vero dengan Kolmogorov-Smirnov NPar Tests VERO FP20


335.5541

10.47865.176.176

-.173.305

1.000

NMeanStd. Deviation





LC50



NPar Tests VERO FP40


325.82717.66835

.250

.195-.250.433.992

NMeanStd. Deviation





LC50



72



329.2685

12.71039.176.176

-.173.305

1.000

NMeanStd. Deviation





LC50





316.53335.19898

.306

.306-.220.529.942

NMeanStd. Deviation





LC50



73

Lampiran 8. Perhitungan nilai korelasi LC50 sel myeloma dan sel Vero pada taraf kepercayaan 90%

Nilai korelasi (r) dihitung linieritasnya menggunakan nilai t yang dapat diperoleh

dengan rumus:

t = 21

)2(

r

nr

−

− (Ostle, 1954)

• Nilai korelasi FP pada sel myeloma

* FP20 r2 = 0,869 r = 0,932

t = 642,3869,01

24932,0=

−− [ t(90% , 2) = 2,920]

----- t hitung > t tabel, sehingga korelasinya linier -----

* FP40 r2 = 0,849 r = 0,921

t = 352,3849,01

24921,0=

−− [ t(90% , 2) = 2,920]


* FP60 r2 = 0,768 r = 0,876

t = 540,6768,01

25876,0=

−− [ t(90% , 3) = 2,353]


* FP80 r2 = 0,790 r = 0,889

t = 332,7790,01

25889,0=

−− [ t(90% , 3) = 2,353]


• Nilai korelasi FP pada sel Vero

* FP20 r2 = 0,836 r = 0,914

t = 514,4836,01

26914,0=

−− [ t(90% , 4) = 2,132]


* FP40 r2 = 0,942 r = 0,971

74

t = 983,6942,01

25971,0=

−− [ t(90% , 3) = 2,353]


* FP60 r2 = 0,827 r = 0,971

t = 785,3827,01

25971,0=

−− [ t(90% , 3) = 2,353]


* FP80 r2 = 0,826 r = 0,909

t = 358,4826,01

26909,0=

−− [ t(90% , 4) = 2,132]


75

Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC50 antara sel myeloma dan sel Vero dengan analisis statistik

T-Test Group Statistics Persen_LC50 Jenis sel N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

Myeloma 3 74.52642 15.869749 9.162404FP20 Vero 3 35.55405 10.478646 6.049849

Myeloma 3 117.16920 16.399210 9.468088FP40 Vero 3 25.82705 7.668353 4.427325

Myeloma 3 149.11196 51.743510 29.874130FP60 Vero 3 29.26848 12.710389 7.338347

Myeloma 3 167.94859 10.741158 6.201410FP80 Vero 3 16.53326 5.198977 3.001630

76

Independent Samples Test

Levene's Test for Equality of

Variances t-test for Equality of Means

90% Confidence Interval of the Difference

Persen LC50 F

Sig.

t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error Difference

Lower Upper

Equal variances assumed

.393 .565 3.550 4 .024 38.972370 10.979541 15.565671 62.379069

FP20 Equal variances not assumed

3.550 3.465 .030 38.972370 10.979541 14.488608 63.456132


.857 .407 8.739 4 .001 91.342147 10.452077 69.059920 113.624373


8.739 2.835 .004 91.342147 10.452077 66.148733 116.535561


8.308 .045 3.896 4 .018 119.843483 30.762232 54.263117 185.423850


3.896 2.240 .050 119.843483 30.762232 36.260064 203.426902


2.174 .214 21.977 4 .000 151.415333 6.889650 136.727655 166.103011


21.977 2.888 .000 151.415333 6.889650 134.942769 167.887897

77

Lampiran 10. Foto Sentrifuge K PLC Series

Lampiran 11. Foto spektrofotometer UV CECIL Serie 2

78

Lampiran 12. Foto inkubator Memmer

Lampiran 13. Foto ELISA reader SLT 340ATC

79

Lampiran 14. Foto seluruh bagian tumbuhan Cyperus rotundus L.

Lampiran 15. Foto umbi Cyperus rotundus L.

80

Lampiran 16. Foto tumbuhan rumput teki (Cyperus rotundus L.)

81

Lampiran 17. Hasil determinasi Cyperus rotundus

mila

Inserted Text

82

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Sitotoksisitas Fraksi

Protein Umbi Teki (Cyperus rotundus L.) FP20, FP40,

FP60, dan FP80 terhadap Kultur Sel Myeloma” bernama

lengkap Milana Fedelia. Penulis dilahirkan di

Purwokerto, Jawa Tengah pada tanggal 9 Juni 1985.

Penulis adalah putri pertama dari pasangan Sim Sit Ho

dan Kwa Gwat Gien. Penulis menyelesaikan Taman

Kanak-Kanak di TK Pius Sidareja Cilacap pada tahun

1991. Melanjutkan ke Sekolah Dasar di SD Santa Maria

Purwokerto sampai tamat pada tahun 1997. Kemudian melanjutkan ke Sekolah

Menengah Pertama di SMP Susteran Disamakan Purwokerto sampai tahun 2000.

Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan di Sekolah Menengah Umum Negeri

1 Purwokerto hingga tahun 2003. Selepas dari SMU, penulis melanjutkan studi di

jenjang S-1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada

tahun 2003. Selama kuliah, penulis pernah menjadi asisten mata praktikum

Farmasetika Dasar.

Download - SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI - core.ac.uk · SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI (Cyperus rotundus L ... 12. Teman-teman kelas B angkatan 2003, khususnya kelompok praktikum

Top Related