PengukuranKonsentrasidanKemurnianDNAGenomNyamukAnophelesbarbirostris
a, b aHasridaMustafa *,IndraRachmawati ,YusranUdinaBalaiLitbangP2B2Donggala,BadanLitbangKesehatan,KementerianKesehatanRI,Jl.MasitudjuNo.58LabuanPanimba,Labuan,Donggala,SulawesiTengah,IndonesiabBadanPengkajiandanPenerapanTeknologi(BPPT),JalanMH.Thamrin8,Jakarta10340
GenomicDNAConcentrationandPurityMeasurementofAnophelesbarbirostris
ThepurityandconcentrationofDNAinformationfromsomesampleareimportanttomeasurethedegreeofcontamination.AnophelesbarbirostrismosquitoessamplesfromKalukutingguVillagewasextractedtoobtainthegenomeDNAusingPureLinkGenomicDNA mini Kits. The purity and concentration of DNA Anopheles barbirostris wasmeasured by using nano spectrophotometer. The results showed that DNAconcentrationwas17,33–34,79ug/ml,andtheirpuritywere1,90average.Thepurityand concentration of theDNA from the samples showedwere not contaminated andeligibleforthenextstep,thatisDNAamplification.
ABSTRACT/ABSTRAKINFOARTIKEL
Informasi mengenai konsentrasi dan kemurnian DNA sangat diperlukan untukmengetahuiderajatkontaminasisuatusampel.TelahdilakukanekstraksigenomDNA
TMAnopheles barbirostris dengan metode PureLink Genomic DNA mini Kits untukmendapatkan DNA genom yang kemudian diukur konsentrasi dan kemurniannya.SampelnyamukAnophelesbarbirostrisyangdigunakanberasaldaridesaKalukutinggudan Palolo. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan dengan menggunakan nanospectrofotometerdandiperolehkonsentrasiDNAsekitar17.33-34.79µg/mldengantingkat kemurnian rata-rata 1,90. Hasil Konsentrasi dan kemurnian DNA An.barbirostrismenunjukkanrata-ratasampeltidakterkontaminasidanmemenuhisyaratuntukdilakukanprosesselanjutnyayaituamplifikasiDNA.
©2016JurnalVektorPenyakit.Allrightsreserved
Katakunci:PengukuranKonsentrasiDNAKemurnianDNAAnophelesbarbirostris
ArticleHistory:Received:2Dec.2015Revised:24May2016Accepted:8June2016
*AlamatKorespondensi:email:[email protected]
Keywords:MeasurementDNAConcentrationDNApurityAnophelesbarbirostris
PENDAHULUAN
Anopheles barbirostris Van der Wulpmerupakan nyamuk yang berperan sebagaivektor penyakit, diantaranya penyakit
1malaria, filariasis dan arbovirusis. An.barbirostris tersebar di wilayah Sumatera,
2Jawa, Kalimantan dan Sulawesi. An.barbirostrisjarangdijumpaimenghisapdarahorangdiSumateradanJawatetapidiSulawesidanNusaTenggaraTimur(NTT)banyakyangtertarik menghisap darah orang sehingga
3berperanbesarsebagaivektor. Pemeriksaan nyamuk secara molekuler
dapat digunakan sebagai alternatif untukmengidentifikasi nyamuk yang berperan
sebagai vektor. Mengingat ukuran nyamukyang kecil, sehingga tidak mudah untuk
4memperolehDNAtotalyangberkualitasbaik.
Ekstraksi dan pemurnian DNA padadasarnya merupakan serangkaian prosespemisahan DNA dari komponen-komponensellainnya.EkstraksiuntukmemperolehDNAyang berkualitas tinggi merupakan kaidahdasar yang harus dipenuhi dalam analisismolekuler danmerupakan salah satu faktorkeberhasilan dalam amplifikasi DNA yangakan digunakan dalam analisis karakter
5-7genetika.
Ekstraksiyangbaikdidukungolehhasilkuantitas DNA ekstrak yang diperoleh.
7
PengukuranKonsentrasi.....................(HasridaMustafa,et.al)
PengukurankuantitasDNAdilakukandenganmetode spektrofotometri menggunakanspektrofotometer pada panjang gelombang
8(λ) 260 dan 280 nm. Kemurnian DNAditentukan dengan menghitung rasioabsorbansi pada A260 dengan A280 (RatioA260:A280). Molekul DNA dikatakan murnijikarasioabsorbansinyaberkisarantara1,8–
92,0.
Informasi mengenai konsentrasi dankemurnian DNA sangat diperlukan untukmengetahui derajat kontaminasi suatusampel dan apakah sampel tersebut baikuntukdigunakanpadatahapselanjutnya.Olehkarena itu, dilakukan pengukuran terhadapkuantitas baik konsentrasi maupun
10kemurnianDNAgenom.
BAHANDANMETODE
P roses ek t raks i DNA d i l akukan TM menggunakan prosedur kerja PureLink1Genomic DNA mini Kits dari invitrogen.
PureLinkTMGenomic DNAmini Kits adalahpaket ekstraksi DNA yang terdiri atas LysisBuffer,DigestionBuffer,WashBuffer1,WashBuffer2,ElutionBuffer,Rnase,ProteinaseK.Kit PureLink® Genomic DNAmenggunakankolomyangprinsipkerjanyadidasarkanpadaikatanselektifDNApadamembranberbahansilika dan garam chaotropic sehingga dapatmengikatdanmelepaskanDNAlebihefisien.LysisbufferpadakitinitelahdioptimasiuntukmeningkatkanaktivitasproteinaseKsebagaienzim yang membantu dalam denaturasi
protein.
Sampel nyamuk dimasukkan ke dalameppendorf tube (satu ekor nyamuk pereppendorf tube)ditambahkanPBS20µldandigerus dengan pellet pestle sampai hancur. Tambahkan180µlGenomicDigestionBufferdan 20 µl proteinase-K, divortex dandiinkubasipadadrybath(Thermolyne)selama
0duamalamdengansuhu55 C.Setelahjaringanlisis, campuran disentrifus pada kecepatanmaksimal (12.000 rpm) pada suhu ruangselama sekitar lima menit. Supernatandiambildandipindahkeeppendorftubeyangbaru,ditambahkanRNAseAsebanyak20µlkedalamsetiaptube,kemudiandivortexselamalimadetik,inkubasidisuhuruangselamaduamenit.Selanjutnyadilakukanpenambahanketiap tube Genomic Lysis/Binding Buffer
sebanyak200µlkemudianvortexselamalimadetik. Sebanyak 200 µl ethanol 96-100%ditambahkankedalamsetiaptubekemudianvor tex se lama l ima det ik , Larutan
TMdipindahkankedalamtubekePureLink spincolumn. Kolom disentrifus pada kecepatan1000 g, selama 1-3 menit. Tube koleksidibuangdanpindahkan spin column ke tubekoleksiyangbaru.LimaratusmikroliterWashBuffer ditambahkan ke spin column dandisentrifuspadakecepatan12.000rpm,suhuruang selama lima menit. Tube koleksiselanjutnya dibuang dan spin columnditempatkan ke eppendorf tube danditambahkan Elution Buffer sebanyak 25µl. Inkubasi di suhu ruang selama satu menit. Sentrifus kolom pada kecepatan maksimal(12.000 rpm) pada suhu ruang selama 1-3menit. Eppendorf tube yang mengandungDNA, dipindahkan ke kolom eppendorf tubeyang baru dan penambahan Elution Bufferdiulangi. Tube disentrifus pada kecepatanmaksimal (12.000 rpm) pada suhu ruangselama 1-2 menit. Tabung spin columndibuang dan larutan berisi DNA padaEppendorf tube dicek konsentrasi DNAmenggunakan nano spectrofotometer (ND-1000v3.5.2)padapanjanggelombangA260danA280.
HASIL
HasilkonsentrasiDNAgenomnyamukAn.barbirostrisdariDesaKalukutinggurata-ratasebesar 17.33 - 26.78 µg/ml, paling rendahpada sampel satu dan paling tinggi padasampel tiga. Hasil konsentrasi DNA genomnyamukAn. barbirostris di desa Palolo rata-rata sebesar 19.91 - 34.79 µg/ml. PalingrendahpadasampelAdanpalingtinggipadasampelB.
Nilai tersebut diperoleh dari hasilabsorbansi panjang gelombang A260 yangditunjukkan pada alat spektrofotometer,sehinggadiketahuikonsentrasiDNAsampel1adalah = 17.33 µg/ml yaitu denganmenggunakanrumus:
Konsentrasisampel=A260xfaktorpengenceranx50
Untuk perhitungan sampel lainnyamenggunakan rumus yang sama. SedangkanuntukKemurnianDNAdilihatdarinilairasio
8
JurnalVektorPenyakit,Vol.10No.1,2016:7-10
Tabel1.HasilPengukuranKonsentrasiDNAgenomAn.barbirotris
9
PengukuranKonsentrasi.....................(HasridaMustafa,et.al)
Sampel
Panjanggelombang Konsentrasi
(µg/ml)
Rasio
Absorbansi
(R)A260 A280
5 4.78¹ 4.596 5¹ .77 6.6³
6 4.7³ ¹ 4.667 5³ .² 8 5.¹ ²
7 4.97⁰ 4.6⁰ ⁰ 6⁰ .¹ ² 6.45
8 4.86¹ 4.68¹ 65.7¹ 5.¹ 7
9 4.8⁰ ² 4.67⁰ 67.86 5.³ ²
⁰ 4.86⁰ 4.678 65.76 5.² 6
A 4.7³ ² 4.655 5³ .³ 5 5.² ³
B 4.⁰ ³ ⁰ 4.7¹ ¹ 78.¹ ³ 5.² 8
C 4.959 4.6¹ ¹ 69.¹ ⁰ 5.² ⁰
D 4.95² 4.6²6 69.² ² 5.² 7
E 4.8¹ ² 4.68⁰ 67.² ³ 5.³ 8
F 4.968 4.6¹6 6⁰ .65 5.³ 6
ÇĮÔ:1-6:SampelnyamukAn.barbirostrisdariDesaKalukutinggu; A-F:sampelnyamukAn.barbirostrisdariDesaPalolo.
absorbansi(R)A260/A280.
Dari hasil pengukuran kemurnian DNAgenom nyamuk An. barbirostris diperolehberkisar1,78–2,29dengankemurnianrata-rata1,9.
PEMBAHASAN
Banyaknya radiasi ultraviolet yangdiserap oleh larutan DNA berbanding lurusdengan banyaknya DNA dalam sampelnyamuk yang diektraksi. Penyerapan sinarultraviolet oleh nukleotida secara maksimaldapatdicapaipadapanjanggelombangA260nm, sedangkan penyerapan sinar ultravioletmaksimalolehproteindicapaipadapanjang
6gelombangA280nm.
HasilpengukurankemurnianDNAgenomnyamukAn.barbirostrishanyaadaduasampelyang kemurniannya diatas dua. Rasiokemurnian DNA d atas dua menunjukkan
imasihadanyasisabufferyangterbawaselama10,12
proses isolasi. Hasil yang sama jugadiperoleh pada penelitian Hasmiwati padanyamuk An. balabacens is diperoleh konsentrasi DNA 8,25-71,25 µg/ml dan
13KemurnianDNAyangberkisar1,59-2,1.
Perbedaan tempat pengambilan sampeltidak terlalu berpengaruh pada kemurnianDNAyangdihasilkan.KonsentrasiDNAantaranyamuk An . barb iros tr i s dar i Desa Kalukutinggu dan Desa Palolo tidakmenunjukkanperbedaanyangsignifikan.Halini dapat dilihat dari hasil rata-rata yangdiperoleh.Beberapahalyangsangatberperandalam mempengaruhi konsentrasi dankemurnian DNA yang dihasilkan adalahmetode ektraksi yang digunakan, rusaknyaDNA dan adanya zat pengotor/kontaminan
7sepertifenolatauproteinlainnya.
KESIMPULANKonsentrasi dan kemurnian DNA An.
barbirostris rata-rata 1,9 menunjukkansampel tidak terkontaminasidanmemenuhisyarat untuk dilakukan proses selanjutnyayaituamplifikasiDNA.
SARANWaktu yang diperlukan dalam tahap
pencucian pada proses ektraksi DNA tidakbolehlebihdarilimamenit,karenapencucianyangterlalulamadapatmempengaruhihasilekstrakyangdihasilkan.
UCAPANTERIMAKASIHTerimakasihpenulisucapkankepadatim
PembinaRisbinkesdrg.FaridaSoetirta,Prof.Amrul Munif , Prof . Emil iana Tj itra , DR . Su s i l owa t i He rman yang t e l ah memberikanbimbingansertamasukandalampenelitian ini. Terima kasih pula kepadateman-temandiBalaiLitbangP2B2Donggalaatassarandanmasukandalampenelitianini.Terima kasih kepada Sekretariat RisbinkesBadan Litbangkes atas izin dan dukunganpembiayaan oleh DIPA Sekretariat badanLitbangkes.
DAFTARPUSTAKA1. BoesriH.PerananAnophelesbarbirostrisVan
DerWulp Sebagai Penular Penyakit.BALABA.2011;vOL7NO1:7–15.
2. Elyazar IRF, SinkaME,GethingPW, et al.ThedistributionandbionomicsofanophelesmalariavectormosquitoesinIndonesia.1sted.ElsevierL td . ; 2013 :173–266 . Ava i l ab le a t : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23876873.AccessedMay17,2016.
3.NoshirmaM,WillaRW,WayanN,etal.NyamukAnophelesbarbirostris.MediaLitbangKesehat.2012;22Nomor4:161–166.
4. Santoso,yahya, Nungki hapsari suryaningtyaskatarinasrirahayu.DeteksimikrofilariaBrugiamalayi pada nyamuk Mansonia spp denganpembedahan dan metode PCR di KabupatenTanjung Jabung Timur. Aspirator. 2015;7 No1(April):29–35.
5 . Muhammad R , Mukr imin , Gusmiaty. OptimalisasiTeknikEkstraksidanIsolasiDNATanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untukAnalisis Keragaman Genetik berdasarkanRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD).J.NaturIndones.14(2),Februari2012138-142ISSN1410-9379.2012;2:138–142.
6. TenriuloA,SuryatiE,ParenrengiA.EkstraksiDNA Rumput Laut Kappaphycus alvareziiDengan Metode Fenol Kloroform.Mar. Chim.Acta.2001;2(2):6–10.
7. Sari septi kurniama, Mazieda muthia naila,ListyoriniD,sulasmiekosri.OptimizationOfDna Isolation And Purification TechniqueFrom Chili Pepper ( Capsicum frutescens )UsingGenomicDNAMiniKit(Plant)Geneaid.Semin. Nas. XI Pendidik. Biol. FKIP UNS.2014:65–70.
8. Darmono TW. Analisis keragaman genetikGanoderma spp . yang berasosiasi dengantanaman kakao dan tanaman pelindungnyam e n g g u n a k a n R a n d om Amp l i f i e d PolymorphicDNA(RAPD).2011;79(1):6–14.
9. Novita L. Analisis genetik karakter morfo-agronomi jarak pagar hasil pemuliaanberbasis pendekatan kuantitatif danmolekuler.Tesis.2013:1–50.
10. Amanda U darmania, Cartealy imam civi.IsolasiRNAtotaldarimesokarpbuahkelapasawit (Elaeis guineenssis Jacq. var. Tenera).Proceeding Semin. Nas. Masy. Biodivers.Indones. 2015;1 Nomor 2(April):171–176.A v a i l a b l e at:http://biodiversitas.mipa.uns.ac.id/M/M0101/M010101.pdf. Accessed October 25,2015.
11. Invitrogen.UserManual :PureLinkGenomicDNA Mini Kits for purification of GenomicDNA,invitrogen.In:;2007:8–9.
12.Kate-ngamS,LakoteP.Acomparativestudyofdifferent RAPD-PCR protocols for geneticdiversity analysis of Doritis germplasm.2008;39(3):203–206.
13. Hasmiwati, Sujadi, F.A S. Analisis GenetikAnopheles balabacensis Baisas (Diptera :Culicidae) dari Daerah Bangko (Jambi) danPurworejo (Jawa Tengah) Dengan RandomAmplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR.Maj.Kedokt.Andalas.2006;30No2:70–80.
10
JurnalVektorPenyakit,Vol.10No.1,2016:7–10
