Download - Laporan Isolasi DNA Dan Elektroforesis
LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI-2105)
ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS DNA
TANAMAN BAYAM (Amaranthus Sp.)
Tanggal Praktikum : 4 November 2013 dan 11 November 2013
Tanggal Pengumpulan : 18 November 2013
Disusun Oleh:
Annisa Amalia
10612007
Kelompok 1
Asisten :
Nofella Mahardika
10611063
PROGRAM STUDI BIOLOGI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
BANDUNG
2013
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul
lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi
DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa
gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan
dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding
sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan
terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Dewasa ini telah
banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu
pengetahuan terutama dalam ilmu genetika. Dalam praktikum kali ini, dilakukan
isolasi DNA pada tanaman bayam (Lee, 2013).
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi
mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan
cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar ultraviolet. Cara pemisahan dengan
elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi
DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai
tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk
pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya. Dalam praktikum kali ini,
tujuan dilakukannya elektroforesis yaitu untuk menentukan kemurnian dan ukuran
DNA tanaman bayam (Cheng and Zhang, 2008).
1.2. Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah :
Menentukan kemurnian DNA berdasarkan hasil elektroforesis
Menentukan ukuran DNA tanaman bayam berdasarkan hasil elektroforesis
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Prinsip Isolasi DNA Pada Tanaman
Isolasi atau ekstraksi DNA merupakan proses pemindahan DNA dari sel atau
virus. Isolasi DNA merupakan langkah awal dalam melakukan analisa DNA
menggunakan metode elektroforesis atau PCR, dapat pula dijadikan langkah awal
untuk dapat mendiagnosa penyakit apapun, termasuk bawaan genetik, sejak dini.
Isolasi DNA banyak metodenya sesuai dengan sampel apa yang akan kita isolasi.
Misalnya untuk isolasi tumbuhan,tumbuhan diketahui memiliki dinding sel untuk
mengambil bagian dalam khususnya DNA sebelumnya kita harus menghancurkan
dinding sel nya terlebih dahulu yaitu menggunakan nitrogen cair dan digerus
untuk memudahkan hancurnya dinding sel tersebut. Berbeda dengan tumbuhan
untuk isolasi sel hewan tidak perlu menggunakan nitrogen cair,karena tidak
mempunyai dinding sel yang keras sel hewan cukup memakai buffer lisis,untuk
melisiskan selnya (Rice, 2010).
Proses pengambilan DNA dari organisme yang akan diuji dapat melalui
berbagai macam cara, mengambil sampel darah, atau rambut pada manusia,
contohnya, atau langsung mencampurkannya dengan larutan SDS seperti pada
Drosophila. Perlunya dilakukan dengan mencampurkan dengan SDS terlebih
dahulu, untuk melisiskan sel, dan mengeluarkan DNA yang terdapat di dalamnya,
serta menjaga DNA untuk tetap utuh, walau sel telah lisis. Untuk memisahkan
DNA dengan organel-organel lain di dalam sel, campuran disentrifugasi.
Sentrifuga memiliki prinsip perbedaan berat jenis saat dilakukan pemutaran
dengan kecepatan tertentu, sehingga akan diperoleh hasil dengan larutan yang
memiliki berat jenis yang lebih ringan akan berada paling atas (biasanya akan
terbentuk 2-3 fasa) (Rice, 2010).
Setelah sel lisis dan dipisahkan, DNA harus segera dijaga keadaan
fisiologisnya dalam lingkungan yang memungkinkan, yaitu dengan
mencampurkannya dengan sejenis buffer yang mengandung fenol dan kloroform.
Sehingga DNA dalam keadaan utuh dan terjaga fisiologisnya. Kemudian larutan
dihomogenisasi atau di vortex, setelah itu larutan kembali disentrifuga, yang
nantinya akan diperoleh DNA berada di atas dan fasa organik dengan fenol dan
kloroform berada di bawah. DNA yang telah dipisahkan setelah disentrifugasi
diendapkan menggunakan etanol atau isopropanol, karena DNA tidak dapat larut
dalam etanol maupun isopropanol, sehingga DNA akan mengendap. Kemudian
setelah dilakukan pemurnian DNA, DNA dikeringkan, lalu dilarutkan dalam TE
untuk presipitasi agar dapat disimpan untuk analisis DNA selanjutnya. Secara
keseluruhan, tahapan isolasi DNA adalah pemecahan sel, pemisahan protein,
pengendapan DNA, dan pemurnian DNA (Rice, 2010).
Pada jaringan tanaman, yang harus diperhatikan adalah jaringan tanaman
diperlakukan terlebih dahulu dalam Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan
penggerusan agar diperoleh ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel
diperlakukan dengan ekstrak
2.2 Fungsi Larutan-Larutan yang Digunakan Dalam Isolasi DNA
Pada percobaan digunakan berbagai macam larutan dan reagen. Larutan-
larutan dan reagen tersebut memiliki fungsi tersendiri. Pada isolasi DNA bayam,
digunakan nitrogen cair pada saat penggerusan daun bayam. Nitrogen cair ini
memiliki fungsi menghancurkan dinding sel sehingga DNA lebih mudah diakses.
Kemudian pada saat gerusan telah didapat, terdapat penambahan extraction
buffer atau disebut juga buffer eksteaksi. Buffer ekstraksi mengandungTris-HCl-
SDS yang masing-masing bahan tersebut memiliki fungsi masing masing. Tris-
HCl berperan penting dalam kestabilan pH. Kestabilan pH menjadi hal yang
krusial karena pH yang pas akan membuat DNA tidak ikut terdenaturasi. Menurut
Rice, SDS merupakan deterjen yang memiliki fungsi membuang lipid dan protein
pada proses purifikasi DNA. Pada isolasi DNA bayam juga terdapat penambahan
Kloroform Isoamil atau disebut juga dengan CI yang memiliki fungsi untuk
menghilangkan kontaminan protein. Protein yang telah dipisahkan nantinya akan
terendapkan oleh etanol.
Layaknya percobaan-percobaan lain yang membutuhkan beberapa reagen
kimia untuk mendukung dan mempermudah proses percobaan, pada percobaan
kali inipun digunakan beberapa jenis reagen untuk isolasi DNA tanaman bayam,
diantaranya ethanol 75%, buffer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl, EDTA,
NaCl, dan 2-merkaptoetanol (SDS), isopropanol, nitrogen cair, larutan fenol :
kloroform : Isoamil alkohol (25:24:1), potassium asetat, serta sodium asetat.
Masing-masing buffer memiliki fungsinya tersendiri, misalnya saja salah satu
reagen yang penting yakni buffer ekstraksi yang digunakan mengandung Tris
HCl, EDTA, dan SDS. Tris HCl berperan sebagai buffer yang mengatur pH
larutan ekstraksi. Ethylenediamine tetraacetic acid atau EDTA berperan sebagai
chelating agent yang mengikat ion metal dalam larutan ekstraksi (Henry, 2001).
EDTA melemahkan sel dengan mengikat ion bivalen (Mg+2 dan Ca+2) yang
diperlukan untuk kestabilan membran sel. EDTA juga digunakan agar enzim
nuklease yang dapat mendegradasi DNA tidak aktif. Sementara itu SDS (sodium
dodecyl sulfate) merupakan detergen biologis yang menyebabkan membran sel
hancur serta mengemulsikan lipid dan protein sel dengan mengganggu interaksi
polar yang mengikat membran sel (Brooks, 2013).
Selain buffer ekstraksi, digunakan pula larutan fenol:kloroform:isoamil
alcohol (25:24:1) yang berperan sebagai pelarut organik yang dapat melarutkan
protein dan polisakarida, namun tidak dapat melarutkan DNA. Oleh karena itu
pelarut ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNAdari komponen-komponen
organik lainnya (Henry, 2001).
Nitrogen cair digunakan untuk melisiskan dindng sel sehingga semua isi
sel dapat dikeluarkan dan kemudian dapat ditampung dalam larutan buffer.
Dinding sel yang dikenai nitrogen cair akan menjadi getas dan mudah
dihancurkan ketika dilakukan proses penggerusn. Selain menggunakan nitrogen
cair, dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan buffer
ekstraksi diikuti penghangatan pada suhu 650C (Subandiyah, 2006).
2.3 Prinsip Kerja Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat
digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja
dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif
(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),
sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju
kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah
terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan
menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings
1994: 397).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.
Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat
medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan
atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan
kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak
melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19). Di dalam elektroforesis digunakan
sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well,
platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik danloading buffer),
matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994: A-6).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatanDensitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA
(Wolfe, 1993).
2.4 Fungsi Reagen dalam Elektroforesis
Seperti yang sempat dalam paragraf sebelumnya bahwa dalam setiap
percobaan biasanya memerlukan reagen guna mendukung dan memudahkan
proses percobaan, hal itu pula yang terjadi pada percobaan elektroforesis.
Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis misalnya
sajaagarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromida. Masing-masing reagen
memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung dan menentukan hasil
akhir dari percobaan.
Reagen loading dye misalnya. Pada percobaan, sampel DNA yang akan
dielektroforesis ditambahkan loading dye terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan
larutan loading dye memiliki peran penting dalam menghasilkan ban DNA yang
tajam. Tiga fungsi utama dari larutan tersebut adalah untuk menterminasi reaksi
enzimatik sebelum elektroforesis, menyediakan kerapatan agar sampel dapat
bergerak dalam sumur gel, dan menyediakan cara untuk melihat pergerakan
molekul DNA saat elektroforesis (Surzycki, 2003).
Loading dye mengandung bromofenol biru, xylene cyanol, dan orange G
yang digunakan untuk memvisualisasi sampel DNA. Pada agarosa 1 %, xylene
cyanol bergerak dengan kecepatan setara dengan 4000 bp DNA, bromofenol biru
bergerak dengan kecepatan setara dengan 200 bp DNA, dan orange G bergerak
dengan kecepatan setara dengan 200-400 bp DNA. Biasanya loading dye juga
mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kerapatan DNA sehingga
dapat masuk dan bergerak dalam sumur gel (Elkins, 2013).
Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) berperan dalam pemberian sensitivitas
dan kemampuan pemisahan yang tinggi. Buffer TAE memberikan ion untuk
konduktivitas listrik sehingga molekul-molekul DNA dapat bererak dengan baik
di dalam gel (Mitchelson and Cheng, 2001) selain itu larutan TAE juga berperan
sebagai penghantar arus pada media (Yuwono, 2005).
Setelah dielektroforesis, DNA divisualisasi menggunakan pewarna etidium
bromida. Etidium bromida dapat berikatan dengan kuat pada DNA dan
menghasilkan pendar sinar orange ketika dilihat dibawah sinar ultraviolet (Cheng
and Zhang, 2008). Karenanya, larutan etidium bromide dapat dikatakan memiliki
fungsi sebagai reagen pembantu visualisasi dalam proses elektroforesis DNA
(Marks et al, 2000)
2.5 Ukuran Genom Tanaman Bayam
Secara keseluruhan kumpulan gen-gen yang terdapat di dalam setiap sel-sel
individu organisme disebut sebagai genom. Ukuran genom adalah jumah total
DNA yang terkandung dalam satu salinan genom tunggal. Panjang molekul DNA
yang beruntai tunggal diukur dalam satuan basa. Karena secara kebanyakan DNA
merupakan pasangan komplementer dari untaian polimer yang disatukan dengan
ikatan hidrogen, panjang dari DNA beruntai ganda diukur dalam pasangan basa
atau base pairs (bp). Seribu pasangan dianggap sebagai 1 Kb , dan satu juta
pasangan basa sebagai 1 Mb (Bruzel, 1998). Kompleksitas suatu organisme tidak
berbanding lurus degan ukuran genom, beberapa organisme sel tunggal memiliki
DNA lebih besar dibandingkan dengan manusia (Stewart, 2009).
Amaranthus sp. merupakan salah satu organisme dengan model terbaik dalam
penelitian ukuran genom. Secara evolusi, spesies Amaranthus sp. sangat kaya
akan sumber daya genom. Berikut merupakan beberapa ukuran genom haploid
pada Amaranthus sp. (Stewart, 2009). Adapun bayam, organisme yang menjadi
objek percobaan kali ini, diikutip dari Brooks (2010), Spinacia oleracea atau
bayam yang merupakan kelompok tumbuhan Amaranthus memiliki genome 989
Mb.
Tabel 3.1 Ukuran Genom Haploid dari Amaranthus sp. (Stewart, 2009)
2.6 Gambar Susunan Ladder 1kb
Ladder DNA merupakan larutan yang terdiri dari berbagai ukuran molekul
DNA yang digunakan pada gel elektroforesis sebagai pembanding untuk
menentukan ukuran suatu DNA. Ladder memiliki ukuran yang berbeda-beda,
disesuaikan dengan perkiraan panjang DNA (Mobile Reference, 2007). Masing-
masing pabrik yang memproduksi ladder memiliki jangkauan base pair yang
berbeda-beda walaupun memiliki ukuran yang sama. Gambar 2.2 di bawah ini
merupakan ladder 1 Kb yang diproduksi oleh Geneaid, terdiri dari 13 garis linear
fragmen DNA yang dapat digunakan untuk mengukur DNA yang memiliki 250
bp hingga 10000 bp.
Gambar 2.2 Ladder 1 kb (Geneaid, 2013)
2.7 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Hasil Elektroforesis
Terkadang hasil elektroforesis yang didapatkan tidak sesuai dengan yang
diharapkan, baik berupa ban fragmen yang tidak terlihat, muncul smear, ataupun
terdapat anomali migrasi DNA. Berikut ini hal-hal yang menyeabkan ban yang
muncul pucat atau bahkan tidak muncul ban (Dube, 2010):
1) Kurangnya jumlah atau konsentrasi DNA, dapat diatasi dengan
menambahkan jumlah DNA asalkan tidak melebihi 50 ng/ban.
2) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.
3) Voltase yang digunakan terlalu rendah.
4) Panjang gelombang sinar ultraviolet yang tidak tepat untuk visualisasi
menggunakan pewarna etidium bromida. Untuk hasil yang baik
gunakan panjang geombang 254 nm.
Hasil lain yang seringkali muncul pada percobaan elektroforesis yang
gagal adalah smear. Masih menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear
pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah:
1) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.
2) Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis
3) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat.
4) Terlalu banyak garam pada DNA
5) DNA terkontaminasi protein
6) Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan
Sedangkan pada hasil elektroforesis yang menunjukkan anomali migrasi
DNA, Dube (2010) menambahkan, terdapat beberapa faktor mendasar yang
menyebabkan hal tersebut terjadi, diantaranya adalah:
1) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Jangan menggunakan voltase
lebih dari 20 V/cm dan jaga agar temperatur di bawah 300 C selama
elektroforesis. Harus dicek pula apakah konsentrasi buffer yang
digunakan sudah tepat.
2) DNA terdenaturasi. Jangan pernah memanaskan DNA ketika akan
dilakukan elektroforesis.
Senada dengan Dube, Sambrook (1989) juga mengidentifikasi beberapa
faktor utama yang menyebabkan hasil elektroforesis tak sesuai dengan yang
diharapkan. Hasil elektroforesis yang buruk seringkali disebabkan oleh banyaknya
zat-zat pengotor dalam DNA atau dengan kata lain DNA yang didapat tidak
murni. Beberapa faktor yang memengaruhi kemurnian DNA yakni tingkat
kontaminasi protein dalam larutan, faktor pengencer, serta daya absorbansi. Pada
elektroforesis, konsentrasi DNA diukur secara Sprektrofotometri dengan
menggunakan GeneQuant DNA calculator. Dasar teknik ini adalah DNA yang
dapat menyerap sinar ultraviolet dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan 280 nm merupakan daerah serapan protein. Panjang gelombang dengan
nilai serapan 1,0 (A260=1,0 ) setara dengan 50 mg DNA utas ganda per milliliter
larutan. Oleh karena itu, didapatkan bahwa konsentrasi DNA (µg/ml) diperoleh
dari perkalian antara faktor pengencer, faktor konversi (50 µg/ml) dan Absorbansi
(A260). Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam
larutan. Rasio optical density (OD) menurut Montgomery and Sise (1990), apabila
260 nm dan 280 nm berada di antara 1.8-2.0 menunjukkan bahwa proses
deproteinasi pada metode tersebut baik. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka
masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari dan Zein,
2003)
BAB III
METODE KERJA
3.1. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :
Tabel 3.1. Alat dan Bahan
Alat BahanAlat sentrifuga Tabung eppendorfVortex TipsFreezer TAE 50xWaterbath Loading buffer 6xMikropipet Etidium bromidePestel dan mortar Jaringan tanaman (Bayam)Cetakan gel Ethanol 75%Alat pencetak sumur Buffer ekstraksiSumber arus Isopropanol
Alat pemanas Nitrogen cairFenol:Kloroform:Isoamil alkohol (25:24:1)Potassium asetat 5MSDS 20%Buffer Tris EDTA : 10 mM Tris-HCl pH 8,1 mM EDTA
3.2. Metode Kerja
3.2.1. Isolasi DNA
Sebanyak 0,2 gram daun bayam digerus dengan nitrogen cair hingga halus.
Setelah itu, dimasukkan ke dalam microtube. Kemudian, kedalam microtube
ditambahkan 500 µL extraction buffer. Microtube di vortex selama 5 detik dan
diinkubasi waterbath 60ºC selama 30 menit dalam apung-apung. Microtube hasil
inkubasi ditambahkan 500 µL Chloroform:Isoamilalkohol (CI) dan dikocok
hingga tercampur. Kemudian, micortube disentrifuga 14000 g selama 5 menit.
Setelah disentrifuga, supernatant diambil sebanyak 400 µL. Kemudian, ke dalam
microtube ditambahkan isopropanol 400 µL dan diinkubasi selama 30 menit di
suhu -80ºC.Microtube hasil inkubasi disentrifuga 14000 g selama 5 menit.
Kemudian, supernatan dibuang dan pellet dikeringkan sampai agak bening
(sekitar 10-15 menit). Lalu, ke dalam microtube ditambahan buffer TE 50 µL.
Setelah itu, microtube ditempatkan pada es selama 5 menit dan disentrifuga 14000
g selama 2 menit. Setelah sentrifuga, supernatan yang terbentuk diambil dan
disimpan di suhu -20ºC. Kemudian, hasil isolasi DNA.
3.2.2. Elektroforesis DNA
Mula-mula, pencetak sumur diletakkan pada cetakan gel. Kemudian
agarosa dicampurkan dengan buter TAE 1x (konsentrasi akhir agarosa 0,3%) dan
didihkan. Setelah agak dingin, campuran agarosa dan TAE 1x ditambahkan
dengan 1 µL etidium bromide. Lalu, campuran gel tersebut dimasukkan kedalam
cetakan gel dan didiamkan sampai gel mengeras. Kemudian, cetakan gel
diletakkan pada alat elektroforesis. Setelah itu, buffer TAE 1x juga dituangkan
pada alat elektroforesis hingga mencapai tinggi 1mm diatas gel. Setelah gel
berada dalam larutan buffer TAE, pencetak sumur dilepaskan dari gel. Kemudian
10 µL DNA yang telah diisolasi dicampurkan dengan 2 µL loading buffer dan
campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah itu, alat elektroforesis
dihubungkan dengan sumber arus dan sumber arus dinyalakan pada 70 Volt
sampai bromofenol biru mencapai ujung gel. Setelah bromofenol biru mencapai
ujung gel, sumber arus dimatikan. Gel dikeluarkan dari tangki gel dan diamati.
Gel dicelupkan ke dalam 0,2-0,5 µg/ml etidium bromide dan buter TAE 1x selama
10-60 menit, kemudian etidium bromide dihilangkan dari dalam gel dengan
memindahkan gel ke dalam buffer TAE 1 x selama 10-60 menit. Setelah itu, gel
disinari ultraviolet agar band-band DNA dapat dilihat dan diamati.
BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Pengamatan
4.1.1. Foto Hasil Pengamatan
Gambar 4.1 Hasil Elektroforesis (Dokumentasi Pribadi, 2013)
4.1.2. Proses dan Hasil Perhitungan Band Melalui Metode Regresi
Tidak dapat dilakukan perhitungan band dikarenakan hasil elektroforesis
seluruhnya dalam bentuk smear.
4.2. Pembahasan
Hasil elektroforesis yang didapat pada percobaan kali ini berbentuk smear
sehingga ukuran DNA tidak dapat dihitung. Menurut Dube (2010), penyebab
munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah:
A. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan
mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah
komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan
lebih akurat.
B. Terlalu banyak garam pada DNA. Seharusnya garam digunakan pada
takaran yang memang dianjurkan dan sesuai literature selama proses
elektroforesis DNA. Kelebihan garam malah akan mengganggu proses
KEL. 1KEL. 2KEL. 3KEL.4KEL. 5KEL. 6KEL. 7KEL. 8KEL. 9KEL.10KEL.11KEL.12KEL.13 KEL. 15KEL.14 KEL. 16
elektroforesis dan memengaruhi hasil yang akan didapat. Kondisi ini dapat
diatasi dengan teknik presipitasi garam berlebih menggunakan etanol.
C. DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.
D. Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan. Kondisi ini dapat diatasi
dengan cara menambahkan etidium bromida saat elektroforesis.
E. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Penggunaan voltase listrik yang
lebih dari 20 V/cm selama proses elektroforesis dapat memengaruhi hasil
yang didapat di akhir percobaan. Oleh sebab itu, selalu gunakan voltase
listrik dalam rentang di bawah 20V/cm serta selalu ingat untuk menjaga
temperature lingkungan tetap di bawah 300 C selama elektroforesis
berlangsung, tujuannya adalah agar DNA tidak terdenaturasi akibat suhu
yang terlalu tinggi.
F. DNA terkontaminasi protein.Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol
sekalipun) akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi
smear karena kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi
DNA. Kontaminan tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang
didapat tidak jelas dan buruk akibat DNA yang dielektroforesis tidak
sepenuhnya DNA murni. Hal ini dapat diatasi dengan cara ekstraksi
protein menggunakan fenol.
Pita genom yang tidak smear atau bahkan tanpa latar pembayang di bagian
belakangnya mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik. DNA disebut
tidak terdegradasi atau terkontaminasi dan dapat diisolasi dengan baik.
Kontaminasi fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya
latar pembayang atau smear di sepanjang jalur pergerakkan pita genom DNA
(Tenriulo et al.,2001). Ada 3 hal yang menjadi faktor penentu dalam metode
ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal, yakni penghomogenan jaringan
tanaman, komposisi larutan buffer, dan penghilangan enzim penghambat
polisakarida (Syarifudin dan Santoso, 2011).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Setelah melakukan percobaan, didapat kesimpulan :
DNA yang didapat dari hasil isolasi tidak murni, banyak faktor pengotor lain
yang pada akhirnya memengaruhi hasil elektroforesis DNA pada percobaan
kali ini.
Ukuran DNA bayam tidak dapat dihitung karena hasil elektroforesis yang
didapat dari percobaan kali ini berbentuk smear.
5.2. Saran
Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum
dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat
mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam
penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam
petunjuk kegiatan praktikum.
Daftar Pustaka
Cheng, Liang and David Y. Zhang. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana Press
Henry, Robert J. 2001. Plant Genotyping : The DNA Fingerprinting of Plants. New York : CABI Publishing
Lee, Steven. 2013. DNA Extraction Methods. www.sjsu.edu/ people/ steven.lee/ courses/c3/s0/ DNA%2520ExtractiEx.ppt, (16 Oktober 2013).