INTRODUCTION

Genetic Transformation

Breeding

Mutation

Natural Mutation

Artificial Mutation

Cross Pollination

Genetic resources

Warm season grasses?

2

3

PENGERTIAN PEMULIAAN TANAMANIlmu pemuliaan tanaman atau ilmu seleksi atau ilmu penjenisan merupakan suatu ilmu dan seni dalam memanipulir gen. Ilmu disini berdasarkan pengetahuan genetika. Seni dalam melakukan seleksi dalam usahanya memanipulir keragaman genetik untuk mengembangkan jenis baru yang bersifat unggul.

Tujuan pemuliaan tanaman adalah untuk menciptakan jenis unggul atau jenis superior yang yang sudah ada dan mempunyai sifat-sifat seperti :· Jenisnya murni· Resisten terhadap hama dan penyakit· Respon terhadap pemupukan· Mempunyai sifat-sifat agronomis yang disukai· Daya adaptasi yang besar· Mempunyai daya atau kemampuan menghasilkan yang tinggi

4

Sebagai tujuan akhir dalam pemuliaan tanaman adalah untuk mendapatkan sifat dan hasil yang lebih baik yaitu mempunyai kuantitas baik dan kualitas yang baik.· Kuantitas yang baik artinya yaitu untuk mendapatkan potensi / gen apakah penampilannya / hasilnya bisa tinggi. Gen tersebut akan bekerjasama dengan faktor lingkungan. Gen-gen yang dimanipulir atau dikombinasikan dengan gen lain supaya memberikan potensi atau hasil yang tinggi.Gen tersebut tanggap terhadap faktor lingkungan, kemudian baru mengarah pada produksi yang tinggi.

P = G + E P : Phenotip / PerfomanceG : GenE : Environment (lingkungan)

· KualitasGen-gen diarahkan pada kehendak breederDari rangkaian gen-gen yang dimanipulir dengan gen lain dan bekerjasama dengan faktor lingkungan mengasilkan individu tanaman yang baru, sehingga menghasilkan varietas yang unggul. Dengan adanya gen-gen yang dimanipulir akan menciptakan keragaman baru maka berkembanglah Ilmu pemuliaan tanaman.

5

Peran pemuliaan tanamanIlmu pemuliaan tanaman memiliki peranan yang cukup penting dalam kehidupan sehari-hari yaitu dengan penggunaan berbagai macam jenis unggul dari tanaman, dengan peningkatan produksi yang dirasa semakin meningkat.

Dengan melihat berkembangnya pemuliaan tanaman maka dihasilkan :· Menghasilkan jenis baru yang berproduksi lebih tinggi dari jenis yang sudah ada.· Mendapatkan jenis unggul yang tahan hama, penyakit dan cekaman lingkungan.· Mendapatkan jenis baru yang kualitasnya tinggi sehingga mampu bersaing di pasaran dunia.· Jenis unggul yang masaknya awal atau berumur genjah

6

Ilmu yang terkait dalam pemuliaan tanamanIlmu pemuliaan tanaman sebagai ilmu terapan yang dilandasi oleh ilmu-ilmu yang lain seperti ilmu genetika, ilmu sistimatika tumbuhan / taksonomi, biokimia tumbuhan, kimia, fisiologi tumbuhan, ilmu hama dan penyakit dan lain-lain.Prospek pemuliaan tanamanPemuliaan Konvensional :· Menghasilkan jenis baru dengan persilangan · Dengan memanfaatkan keragaman yang tersedia di alam· Perkawinan antar genera tidak dapat· Perakitan sifat ketahanan sulit· Acak· Waktu lamaBioteknologi / rekayasa genetik :· Menghasilkan jenis baru dengan menggunakan dasar genetik· Perkawinan antar genera bisa dilakukan· Gen dari bacteri dapat ditransfer ke tanaman sehingga menghasilkan tanaman transgenik· Terarah· Cepat

Diversity of reproductive system in plant

Vegetative growthVegetative propagation: clonalpropagation, leaf and stem,micropropagation etc.

Reproductive growth Seed Propagation

Amphimixis

Apomixis(clonal propagation)

Self-pollination

Cross-pollination

7

8

Pollination pattern in plants

1a dan 1b self polination

2. Cross polination / out cross

3. Un polinatied

1a 1b

2

3

Rumput kadang ada yg self polination sehingnga apomiksis (clonal propagation) hanya dr mother female

9

The Growth habit of tropical grasses

Tropical, sub tropical zoneThe growth starts from 10 degree CThe best of growing season is from more than 25 degeree CC4plant, Docarboxylic acid cycle

The Growth habit temperate grasses

Temperate, the frigid zoneThe growth starts from 5CThe best pf growing seasons from 15 C to 21 CSummer depression occurs from more tahn 22 CC3 plant, calvin cycle

10

Perkembangbiakan secara aseksual atau secara alami (Apomiksis) adalah suatu peristiwa dimana dibentuknya biji tanpa adanya peleburan atau perpaduan sel jantan dan sel betina.

Sedangkan mekanismenya bermacam-macam, namun semuanya menggunakan material genetik dari induknya (betina). Karena tidak terjadi peleburan sel jantan dan betina maka tidak mengalami meiosis seperti pada pembentukan gametophyt. Yang dihasilkan dari proses apomiksis dinamakan Apomiktik (Apomict).

Bila suatu tanaman ada embrio yang dibentuk secara apomiksis dan ada pula yang dibentuk secara seksual maka disebut Fakultatif Apomictic, seperti pada poliembrioni biji jeruk, mangga, coklat,manggis dsb.

11

Vegetatif apomiksis ada 2 macam yaitu :1. Vegetatif apomiksis dengan organ tanamanOrgan vegetatif tanaman seperti rhizom, stolon, umbi, bulbus. Bagian tersebut bila ditanaman menjadi tanaman baru.2. Vegetatif apomiksis dengan bijiBiji yang terbentuk secara spontan dari sel telur di luar ovul kemudian berkembang menjadi biji, proses pembentukannya dinamakan Vivipary yaitu pembentukan biji tanpa pembentukan sporophyt. Jadi pada vivipary sporophyt tidak ada tetapi dapat tumbuh menjadi tanaman baru dan pada vivipary tidak otonom diperlukan stimulasi penyerbukan tanpa perkecambahan tepungsari.

12

Reproduction mode in plant

1. Autogamaous (self pollination) plant, homozygote

2. Allogamous (cross polination) plant , heterozigote

3. Apomixis –clonal propagation

Breeding barier no 2 dan 3

Warm Season Grasses Limiting Factor

Apomixis Clonal propagation

No Seed Production

Vegetative propagation

Ploidy level

Breeding barrier Micropropagation13

Tissue CultureBeda sel hewan dan sel tumbuhan

SymplastPlasmodesmata, tidak terisolasi walau ada dinding cell

Totipoten Cell kemampuan sel tumbuhan somatik/ vegetatif dan gametik untuk beregenerasi mjd tanamn utuh

Autonom: mengatur rumah tangga cell

Kultur jaringan; suatu metode untuk mengisolasi bagian bagia tanaman seperti sel, jaringan, organ serta menumbuhkannya secara aseptisndi dalam medium budidaya shg bagian tersebut bereregenerasi kembali

Eksplan: bagian kecil dr suatu tanaman yang digunakan untuk memulai suatu kultur

Primordia: sel-selnya masih aktif bersifat meristematis dan sudah mengalami diferensiasi. Sel mesofil, stomata daun, kambium, korteks

Kalus: massa sel yang tidak terorganisir

Dediferensiasi sel kalus: sel-sel yang tidak tidak ter diferensiasiZat pengatur tumbuh: auksin sintetic

Sub kultur: pemindahan sel, jaringan atau organ ke dalam medium baru

Morfogenesis in vitro: proses terbentuknya organ2 baru yg akan menjadi tanaman utuh

Plantlet: tanaman regenerasi yang dihasilkan dengan teknik kultur jaringan

Organogenesis: diferensiasi meristem unipolar, menghasilkan ujung tunas yang akan menjadi tunas atau ujung akar yang akan menjadi akar.

Embryogenesis somatic: diferensiasi meristem bipolar yang berupa bakal tunas dan akar.

eksplan

dediferensiasi

embryogenik

kalus

embrriogenesis

organogenesis

caulogenesis

rhizogenesis

plantlet

1. Apa kultur jaringan?2. Mengapa sel tumbuhan bersifat totipoten3. Apa yang disebut kalus

biji

Sterilisasi

Perkecambahan

Seedling steril

Bagian tanaman lain

sterilisasi

Induksi kalus

Kultr kalus Dispersi selpada medium cair

Kultursuspensi sel

Perlengkapan kultur jaringan

1.Persiapan2.Inokulasi3.Pemeliharaan4.Aklimatisasi

Medium Kultur

1.Garam-garam anorganik2.Zat-zat organik3.Substansi organk komplek4.Bahan pemadap

AuksinCytokinin

Pembentukan akar pada cuttingEmbryogenesisPembentukan akar adventiv kalusInisiasi kalus pada dikotilPembentukan tunas adventifProliferasi tunas aksiler

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

1. persiapan; meliputi penyiapan tanaman, alat, botolkultur dan pembuatan medium.

2. Inokulasi; sterilisasi, pengirisan bagian tanaman ygakan dijadikan eksplan, penanaman pd medium ygtelah disiapkan. Kondisinya hrs absolut steril.

3. Pemeliharaan; diletakkan di rak di ruanginkubator.suhu 25-28

4. Aklimatisasi; adaptasi planlet dr kondisi heterotrofdlm botol menjadi autotrof yg dpt ditanam pdkondisi alamiah di tanah. Aklimatisasi di green house.

MEDIUM KULTUR JARINGAN

Pemilihan medium disesuaikan dengan jenis tanaman ygdigunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing2 peneliti.

Medium MS atau LS merupakan medium yang sangat banyakdigunakan untuk kultur klaus dan regenerasi berbagai tanaman.

Medium ini mengandung garam2 mineral dengan kosentrasitinggidan senyawa N dlm bentuk ammmonium dan nitrat.

Medium B5 digunakan utk kultur suspensi sel tanamanleguminosae. Nitsch & Nitsch, N6 digunakan utk serealia. Medium WPM utk tanaman berkayu. VW dan C (Vacin, Went, Knudson) utk anggrek, medium Kao dan Michayluk utk kulturprotoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae.

KOMPONEN DASAR DARI MEDIUM KULTUR

1. Garam-garam anorganika. Unsur Makro; C ,H, N, S, P, K, Ca dan Mgb. Unsur Mikro; Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe, Co

2. Zat-zat organikGula, Myo-isonitol, Vitamin, asam-asam amino, Zat

pengatur tumbuh3. Substansi organik komplek

Air kelapa, Ekstrak buah-buahan, ekstrak yeast, pepton, Trpton, Hidrolisat kasein4. Bahan pemadat

agar-agar, Gelrite, Phytagel, Sea Plaque Agarose5. pH6. Bahan2 lain misal arang aktif.

Unsur Makro

Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang sudahmengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas 2 kali.

Kebutuhan garam mineral di dalam jaringan kurang lebih samadengan tanaman utuh. Beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan pada medium kultur jaringan antara lain; KNO3, NH4NO3, Ca(N03).4H2O; NaNO3; CaCl2; 2H2O, MgSO4; 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4; 2H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4Kisaran antara 25-60 mM

Nitrogen

Bentuk2 persenyawaannya; KNO3; NH4NO3, Ca(NO3).4H2O, NaNO3, NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan N itu terbesar utkmenyusun asam-asam nukleat, protein, sebagai koenzym ataupersenyawaan lain yang mengandung N seperti klorofil, alkaloit, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.Kisaran ion ammonium 2-8 mM, nitrat 25-40 mM

Fosfor

Bentuk persenyawaannya antara lain; KH2PO4; k2HPO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. Kisaran yg diberikan 0,5-20 mM/l

Kalium

Bentuknya: KNO3; KH2PO4; k2HPO4, KCl dan K2SO4. Kisaran yg diberikan 1,837-25,18 mM/l. fungsinya utk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan proten, pembuatan klorofil.

Sulfur

Bentuknya MgSo4; 7H2O; (NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4; 7H2O; MnSO4; 4H2O; ZnSO4; 7H2O; CuSO4; 5H2O.Kisaran pemberian0,75-3 mM/l. Fungsinya utk memacu perkembangan akar sertaketahanan tumbuhan.

Calsium

Bentuknya Ca(NO3); 4H2O; CaCl2. 2H2O; Ca3(PO4)2. pemberian kisaran 1-3 mM/l. digunakan utk pembentukan dinding primitive, sbg Ca-pectat yaitu bagian integral dr dinding sel, sbg kation selular dan kofaktor enzym.

Magnesium

Bentuknya MgSO4; 7H2O. Diperlukan sbg elemen utama dalam pembentukanklorofil, aktifator ensim terutama dalam proses fosforilasi dan sintesis protein dg cara mebentuk komplek enzim-substrat.

Unsur Mikro

Fungsinya tidak diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat2 ini mengakibatkankelainan pertumbuhan.Bentunya; MnSO4.4H2O; ZnSO4; 7H2O; H3BO3; Kl; CuSO4; 5H2O; NaMoO4; 2H2O; CoCl2; 6H2O; FeCl3; 6H2O; Fe III citrate; FeSO4; 7H2O; NaFeEDTA; 2H2O; Fe(SO4)3, Fe III tartrate.

BesiBerperan penting dalam sintesis klorofil, konfersi energi pd fotosintesis danrespitasi dg melakukanreduksi oksidasi. Bentuknya; FeCl3; 6H2O; Fe III citrate; FeSO4; 7H2O; NaFeEDTA; 2H2O; fe(SO4)3; Fe III tartrate.

BoronSebagai asam borak H3BO3, berperan dalam translokasi karbohidrat, diferensiasiseluler dan perkembangan.

Molybdenum

Sebagai sodium molybdat (Na2MoO4; 2H2O). Berfungsi pd konfersinitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen.

Manganese

Berperan sebagai aktifator enzim dengan bertindak sebagaiperantara pada proses fosforilasi. Bentuknya MnSO4

Cobalt

Esensial untuk fiksasi nitrogen, bentuknya Cobalt Chloride (CoCl2).

Zincum

Sebagai aktifator enzim, penyusun klorofil, pemacu pembentukan zatpengatur tumbuh terutama IAA. Bentuknya ZnSO4.

Cuprum

Berfungsi dlm proses fotosintesis dan reduksi nitrit. Bentuknya CuSO4.5H2O

Chlorine

Memacu proses fotosintesis. Bentuknya CaCl2

KEBUTUHAN ZAT-ZAT ORGANIK

zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon. Diberikandalam bentuk gula, myo-isonitol, vitamin, asam amino dan zat pengatur tumbuh.

Gula

Diperlukan dalam proses fotosintesa. Sukrosa dlm medium kultur ditambahkansebanyak 30 gr/l. glukosa pada kisaran 20-30 gr/l

Myo-inositol

Untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan jaringan. Myo-isonitol ini adalahzat perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagaiprazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.

Vitamin

Ditambahkan untuk mempercepat pertumbuhan, diferensiasi kalus. Berfungsisebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor dari reaksi-reaksi enszimatispenting. Bentuknya antara lain; Thiamin-HCl; Nicotinic acid; Pyridoxin-HCl; Ca D-panthothenate, Folic acid, Choline chloride; Robiflavin;

Asam-asam Amino

Merupakan sumber N organik, penyusun protein dan asam nukleat. Bentknya ; Glutamine; Glycine; L-Cyteine; L-Arginine; L-Aspartic Acid; L-Methionine

Zat pengatur tumbuh

Diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan, perkembangan dandiferensiasi. Bentuknya Auksin, Sitokinin, Gibberellin; Abscisic acid, Ethylene.

AuksinIAA sbg auksi alamiah berperan dalam mempengaruhi pemsnjsngsn sel, pembelahan sel, diferensiasi jaringan faskuler, inisiasi pembentukan akar, mempengaruhi dominasi aplikal, zona absisi pada daun dan buah, pembungaan, dan pemasakan buah.

Auksin sintetik yg sering dipakai ; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); I-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA)

Sitokinin

Sitokinin alami berupa kinetindan zeatin. Sitokini hanya aktif jika ada auksin, pemberiannya bersama auksin membantu memacu pembelahan sel danmorfogenesiaSitokinin sintesis seperti N6-benzylaminopurine (BAP)

Biji

Sterilisasi

Perkecambahan

Seedling steril

Induksi kalus

Pemindahan kalus

Dispersi sel pada medium cair

Suspensi sel

Baguan tanaman lain

Sterilisasi

CONTOH KASUS

Dwarf Cogongrass(Imperata cylindrica L.)

Dwarf Napiergrass(Pennisetum purpureum Schumach.)

36

Dwarf Plant Characteristics

Easy Maintenance Leafier More Clump and Cluster More TillersGood for grazing areaGood nutrient content

DeMerit:

Lower Yield ProductionDifficult for propagationNo Seed Production

Merit:

37

EXAMPLE Case

I. Efficient nursery plant production of dwarf cogongrass(Imperata cylindrica L.) through mass propagation inliquid culture.

I. Efficient nursery production and multiple-shoot clumpsformation from shoot tiller-derived shoot apices ofdwarf napiergrass (Pennisetum purpureum Schumach.).

I. Efficient of Embryogenic Callus Induction Derived FromApical Meristem and The Examination Of The GeneticTransformation Condition By Particle Bombardment inDwarf Napiergrass

38

Stage of Research Activity

I. Efficient nursery plant production of dwarfcogongrass (Imperata cylindrica L.) throughmass propagation in liquid culture.

39

COGONGRASS (Imperata cylindrica L.)

Spread over wide area.Perennial grass reproduces

vegetatively by rhizomes.Used as thatch, mulching

material, ground cover plant.Addapt well in any

environtment and soil type.

40

Establishment of tissue culture method(Akashi and Adachi 1989).

In 2005, dwarf cogongrass was found as a mutant of cogongrass radiated by ion beams. (Shigeki et al, 2009).

Dwarf Mutant- Dwarf Cogongrass

41

Characteristics of dwarf cogongrass

Dwarf mutant Wild type

The height is 15-20 cm. No need for cutting. Low maintenance. Ground cover grass. Leafier. Cluster.

42

Propagation of dwarf cogongrass

Dwarf cogongrass No Seed production

Vegetative propagation

Limiting factors• Long time to prepare nursery• Intensive labor• Need space• Dependent on field condition

Propagation Using In vitro Tissue Culture Method Enables rapid multiplication Not depending on the season Healthy plant production Not labour

43

Material and Method

o Explant : Shoot Apical Meristem

Cutting Apical Meristem

MSCs Induction MS solid medium 0.1 mg L–1 2,4-D and 2 mg L–

1 BAP.

Mass Propagation in liquid mediumMS liquid culture (2,4-D; 0, 0.05, 1.0 mg L–1) and BAP ; 0, 1.0, 2.0 mg L–1) .

Plant regeneration Transfer to MS solid media with 0.5 mg L–1

BAP+ 0.05 mg L–1 2,4-D; 2 mg L–1 BAP+0.01 mg L–1 2,4-D; 1 GA+1mg L–1

KIn; free hormon media.

Aclimatization Jiffy-7 peat pellets, soil, soil + vermiculite (30d).

Genetic analysisAFLP analysis

44

RESULT

Induction of MSCs in Dwarf Cogongrass

Figure 1. Induction of MSCs of dwarf cogongrass in MS solid medium

45

Figure 2. Effect of hormone concentrations on proliferation of multiple-shoot clumps in dwarf cogongrass.

Mass Propagation of MSCs in Liquid Culture

46

Evaluation of Plant Regeneration Media in dwarf cogongrass

Medium Composition No of inoculated MSCs

No of regenerated MScs (%)

Total No of regenerated plants

No. of plants/ regenerated MSc

Rooting

Basal Medium

Hormone concentration (mg/L)

MS BAP (0.5) ± 2.4-D (0.05)

74 0.0 0.0 0.0 -

BAP (2.0) ± 2,4-D (0.01)

74 0.0 0.0 0.0 -

GA3 (1.0)± kinetin (1.0)

74 0.0 0.0 0.0 -

- 74 46.3 (62.5±2.1)b

90.0± 4.9b 2.0 ± 0.2b +

½ MS - 74 52.5 (70.9±4.9)a

145.5± 5.6a 2.8± 0.2a +++

The values are means ± standard deviations of 3 replications, and rooting was evaluated objectively. Letters indicate a significant difference by Tukey’s test (P< 0.05).† Root rating: – none, + poor, ++ moderate, and +++ good .

Table 1. Effect of medium composition on plant regeneration and rooting

47

Size of MSC

Experiment

No. of Inoculated MSCs

No. of regenerated MSCs (%)

Total No. of Regenerated plants

No. of plants/ regenerated MSC

Rooting

< 2mm 1 60 56 341 6.1 +++

2 56 330 5.9 +++

3 56 367 6.6 +++

Mean 56.0(93.3±0.0)a

346.0± 9.0a 6.2± 0.3a +++

2-5mm

1 80 28 78 2.8 +

2 31 57 1.8 +

3 30 84 2.8 +

Mean 29.7(49.4±2.5)b

73.0± 14.2b 2.5± 0.6b +

Effect of MSC Size on Plant Regeneration and Rooting

Mean values are indicated mean ± standard deviations of 3 replications, and rooting was evaluated objectively. Letters indicate a significant difference by Tukey’s test (P< 0.05).† Root rating: – none, + poor, ++ moderate, and +++ good .

Table 2.Effect of MSC size on plant regeneration and rooting in dwarf cogongrass

48

Acclimatization medium

Pla

nt

heig

ht

(cm

)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

Jiffy-7 Soil Soil + Vermiculite

a

b

b

Figure 3 Effect of acclimatization medium on nursery plant growth of dwarfcogongrass. Values are the means of 30 replications, standard deviations arerepresented by vertical bars. Letters indicate a significant difference by Tukey’stest (P < 0.05).

Aclimatization in Several Media

49

b c d

e f g

I j

1 mm 5 mm 5 mm

Figure 4 Mass propagation and nursery plant production of dwarf cogongrass.

Culture of MSCs on solid medium

Mass propagation in liquid culture

Plant Regeneration and Rooting Aclimatization

50

Primer Combination

Total fragments

Fragments details Polymorphic bands Original

plant

Regenerated

plant

X-CTA/M-CTG

X-CAG/M-CAA X-CTG/M-CAT

X-CGA/M-CGC

P-GTA/M-CGT

P-GCA/M-CAC

P-GCG/M-CGA P-GAC/M-CCG

P-GTG/M-CAG

P-GTT/M-CTC

Total

15

13 15

5

9

8

7 10

10

9

101

15

13 15

4

9

8

7 10

10

9

100

15

13 15

5

9

8

7 10

10

9

101

0

0 0

1

0

0

0 0

0

0

1

Table 3. AFLP analysis of original dwarf plants and regenerated dwarf plants of cogongrass

51

Figure 5. AFLP profiles ofthe original dwarfnapiergrass plants (O1-3)and regenerated plants(1-24) as revealed byAFLP primer combinationXba I+CTA/ Mse I+CTG.(M= DNA marker 1 kbpladder).

Genetic variations of regenerated plants through micropropagations were assessed by amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis using 3 primer combinations. 43 scorable fragments were amplified, all regenerants showed same band pattern with original dwarf cogongrass and no major genetic variations.

AFLP Analysis

52

1.Mass propagation of dwarf cogongrass conditions were established from

multiple-shoot clump cultured in MS liquid medium containing 0.05 mg L–1 2,4-D

and 0.5 mg L–1 BAP.

2.The small clump size is more effective to proliferate than the large one. On

regeneration medium, the small clumps have higher regeneration rate and higher

rooting on the similar medium than the large clumps.

3.Regenerated clumps of the small size can grow normally in aclimatization media

and can grow well on soil media.

4.Genetic uniformity of the regenerants in the present study adds to the

significance of this establishment method as supply nursery plant production

system of dwarf cogongrass .

Conclusions

53

II. Efficient Nursery Production and Multiple-ShootClumps Formation from Shoot Tiller-Derived ShootApices of Dwarf Napiergrass (Pennisetumpurpureum Schumach)

Stage of Research Activity

54

DWARF NAPIERGRASS (Pennisetum purpureum Schumach)

LeafierCan be grown in a wide

variety of soil typeForage for grazingHigh nutrient contains

No Seed Production

Vegetative Propagation

In Vitro Propagation 55

Using convensional vegetative propagationAdvantage: Simple method/ every farmer in smalholder farm

can apply the system Gives good result

Disadvantage; Demand suplly problem (quantity and time) Labour intensive

56

Research on micropropagation of monocotyl plants using multiple-shoot clumps:

• Sugarcane (Sacharum officinarum) (Khan et al. 1996).

• Pineapple( Ananas comosus) (Gutterson, 2003).

• Lemongrass (Cymbopogan citratus) (Mizukami et al. 1989)

• Vetiveria grass (Vetiveria zizoinoides) ( Vanbe et al., 2003)

57

MATERIAL AND METHOD

• Induction of MSCs (2,4-D and BAP)(0.0, 0.01, 0.1, 0.5 mg L–1 2.4-D and 0.0, 2.0 mg L–1 BAP)

• Proliferation of MSCsD0.1B2 : 0.1mg L–1 2,4-D + 2.0 mg L–1 BAP;D0.1B2CL : 0.1 mg L–1 2,4-D +2.0 mg L–1 BAP + 5.0 µM CuSO4;D0.1B2CH : 0.1 mg L–1 2,4-D + 2.0 mg L–1 BAP + 50 µM CuSO4).

• Regeneration of MSCs (NAA and BAP)(0.0, 0.01, 0.1 mg L–1 NAA and 0.0, 0.2 mg L–1 BAP)

• Morphological Characteristics and Flow Cytometry (FCM) Analysis

58

Sterilization Of Explants

59

RESULT

Induction of MSCs of dwarf napiergrass

2,4-D mg/L 0 0.01 0.1 0.5

BAP (mg/L) 2 2 2 2

Figure 6. Induction of MSCs of dwarf cogongrass in MS solid medium60

Table 4. Effect of hormone concentration on the formation ofMSC derived from shoot apices in tiller of dwarf napiergrass

Hormone

concentration (mg L–1)

No. of

inoculated

shoot apices

No. of multiple-shoot

clumps formed (%)

2,4-D BAP

0 0 60 0 (0) a

0 2 60 0 (0)a

0.01 2 60 0 (0) a

0.1 2 60 17 (29) b

0.5 2 60 8 (14) c

abc Different letters following each value within a column indicated a significant difference by Tukey’s Test (P< 0.05) on experiment of MSCs formation.

Effect of Hormone Concentration on MSC Formation

61

Clump Proliferation Capacity

Clumps proliferatiin capacity (%)= (number of cluster proliferated) (number of cluster on the subculture medium ) –1X100.

Figure 7. Clumps proliferation capacity in proliferation media.

62

Table 5. Effect of hormone concentration on plant regeneration fromMSC derived from shoot apices in tiller of dwarf napiergrass

Hormone

concentration

(mg L–1)

No. of

inoculated

clumps

No. of

regenerated

clumps(%)

No. of total

regenerated

shoots

No. of

shoot/c

lumps

NAA BAP

0 0 63 27 (47.8) a 49 ab 1.5

0 2 63 14 (22.2) b 31 a 2.5

0.01 2 63 33 (52.3) ab 99 b 3.0

0.1 2 63 53 (84.1) b 158 c 3.0

ab Different letters following each value within a column indicated significant difference by Tukey’s Test (P < 0.05).†Clumps derived from one original shoot apex.

Effect of hormone concentration on plant regeneration

63

Figure 8 Plant regenerationvia MSCs in dwarf napiergrass.(a) Excised shoot apex fromshoot tiller as initial explant.(b) Inducted of shoot apex inMS medium containing 2 mgL–1 BAP and 0.1 mg L–1 2,4-Dafter 10 days of culture. (c)Primary MSCs after 30 days.(d) MSCs after 40 days in thetube culture. (e) Proliferatedclump in MS inductionmedium with 50 µM CuSO4.(f) Germinated clump in MSmedium containing 0.1 mg L–1

NAA and 2.0 mg L–1 BAP. (g)Numerous green regeneratedplants in MS mediumcontaining 0.1 mg L–1 NAA and2.0 mg L–1 BAP. (h) Rootingregenerants in half strenghhormone-free MS medium. (i)Regenerants from MSCs infield experiment. 64

a

cFigure 9. Regenerated plants from multiple-shoot clumps of dwarf napiergrass growth in the field. 65

100

Nu

mb

er o

f n

ucl

ei

(a)

(b)

Dwarf napiergrass (control)O. sativa

100

Nu

mb

er o

f n

ucl

ei

Fluorescence intensity

Regenerant dwarf napiergrass from multiple-shoot clumpO. sativa

DNA Content Analysis Using Flowcytometry

Figure 10. DNA content of regenerants from multiple-shoot clump and control plant.

66

Control: 128.6 cmReg 1: 115.2 cmReg 2: 145.2 cm

Control: 134.04 cmReg 1: 116.3Reg 5: 148.1

0

20

40

60

80

100

120

140

160

12 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021

Plan

tleng

th(cm)

PlantNumber

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021

Leafblade

leng

th(cm)

PlantNumber

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021

LeafBlade

Width(cm)

PlantNumber

0

20

40

60

80

100

120

140

160

1 3 5 7 9 111315171921

Plan

tHeigh

t(cm)

PlantNumber

Control: 77.4Reg 17: 83.3Reg 19: 62

Control: 2.9Reg 17: 3.4Reg 2: 2.44

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021

FreshYield(g/pot)

PlantNumber

Control: 21.6Reg 15: 32Reg 15: 561

Control 731.6Reg 16 : 876Reg 15: 561

Figure 11. Morphological characteristics and fresh yield of regenerants from multiple-shoot clumps and control plants of dwarf napiergrass.

Morphological Characteristics

67

1. The most effective plant growth hormone treatment for multiple-shoot

clumps induction was 0.1 mg L–1 2,4-D plus 2.0 mg L–1 BAP in MS solid

medium.

2. The addition of 50 µM CuSO4 could increase the percentage of multiple-

shoot clumps proliferation. Plant regeneration frequency was achieved up

to 84% by culturing the multiple-shoot clumps on solid MS medium

containing 0.1 mg L–1 NAA and 2.0 mg L–1 BAP.

3. All regenerants were successfully grown up in the soil. Compared to control

plants, in vitro regenerated plants did not reveal any significant difference

on morphological characteristics and DNA content.

Conclusions

68

III. Efficient of Embryogenic Callus InductionDerived From Apical Meristem and TheExamination Of the Genetic TransformationCondition by Particle Bombardment in DwarfNapiergrass

Stage of Research Activity

69

Breeding Of Dwarf Napiergrass

Agronomic important genes

New CultivarMass Propagation

Nursery

70

Transformation of Graminae

Species

Barley(Cho et al 1998)Wheat(Cho et al 2000)Pearl Millet (Gildman et al 2003Bahiagrass (Gondo et al 2003)Ruzigrass (Ishigaki et al 2012)

Embryogenic Calli for Material Genetic Transformation

Materials

Embryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calli and Multiple-shoot clumps

71

Materials and Methods

Induction of EC (2.0 mg L–12.4-D & 0, 0.01, 0.1, 0.5 mg L–1BAP), 30-40d

Proliferation of EC•D2B0.5 : 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP; •D2B0.5CL : 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP + 5.0 µM CuSO4;• D2B0.5CH: 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP + 50 µM CuSO4).

Regeneration of MSC and EC (NAA&BAP)

Shoot apices

Data were analysed by Tukey’s Test with SPPS 10 software

72

RESULT

2,4-D mg/L 2 2 2 2

BAP (mg/L) 0 0.01 0.1 0.5

Induction of Embryogenic Callus

Figure 12. Induction of embryogenic callus of dwarf napiergrass onseveral media. 73

Table 6. Effect of hormone concentration on the formation of EC derivedfrom shoot apices in tiller of dwarf napiergrass

Hormone

concentration

(mg L–1)

No. of

inoculated

shoot apices

No. of calli

formed (%)

No. of

embryogenic

calli formed (30

days) (%)

No. of

embryogenic

calli formed (60

days) (%)2,4-D BAP

0 0 60 0 ( 0.0) 0 (0.0) a 0 (0.0)

2 0 60 49 (81.7) 0 (0.0) a 22 (36.7)

2 0.01 60 56 (93.3) 5 (8.3) a 27 (45.0)

2 0.1 60 52 (86.6) 12 (20.0) b 37 (56.7)

2 0.5 60 54 (90.0) 15 (25.0) b 48 (80.0)

Embryogenic Calli Formation

abdifferent letters following each value within a column indicate significant difference by Tukey’s Test (P<0.05). 74

0 day 10 day 20 day 30 day

D2B0

D2B0.5

e

Figure 13. Developmental stage of embryogenic calli of dwarf napiergrass.

Developmental Stage of Embryogenic Calli

75

Callus Proliferation Capacity

Figure 14. Callus proliferation capacity of dwarf napiergrass in proliferation media.

76

Figure 15. Developmental stage of embryogenic calli of dwarf napiergrass on different media.

0 day 3 days 7 days 21 days

D2B0.5

D2B0.5CH

Developmental Stage

77

Table 7. Effect of hormone concentration on plantregeneration from EC derived from shoot apices in tillerof dwarf napiergrass

Hormone

concentration

(mg L–1)

No. of

inoculated

calli

No. of

regenerated

calli (%)

No. of total

regenerated

shoots

No. of

shoot/c

alli

NAA BAP

0 0 63 20 (31.7) a 39a 1.9

0 2 63 29(46.0) a 50a 2.0

0.01 2 63 32(50.8) a 62a 1.9

0.1 2 63 43(68.2) b 87a 2.0

ab: different letters following each value within a column indicate significant difference by Tukey’s Test (P<0.05).

78

Regeneration, Rooting and Aclimatization

Figure 16. Regenerating and Rooting Stage ofdwarf Napieragrass.

79

Genetic Transformation of Dwarf Napiergrass

Target Tissue : Embryogenic calli of dwarf napiergrass.

Vector DNA pAHC25 containing uidA gene controlled by maize ubiquitin 1 (UBI1)promoter, which was used to drive GUS reporter gene and selective marker bar (Christensen et al. 1992).

Osmotic treatment : Mannitol and Sorbitol (0-1.2M).

80

Callus

Gold（xμm）

Target gene

Helium gus pressure

Transgenic plant

High digestibilityResistant to droughtResistant to virus

・・・・

etc

Transformation System Using Particle inflow gun

Selectionand

Regeneration

Rooting

Donor plant

81

Promoter

pAHC25

NOS 3’

GUS

Exon

9706 bp

PromoterExon

BAR

NOS 3’

HindIII

SphI

PstI

Sal I

PstI

Sal I

XbaI

BamHI

SmaI

Bgl II

Eco RI

Sac I

Hind III

SphI

PstI

Eco RIBamHI

XbaI

Sal I

PstI

PstI

Sal I

Bgl II

SphI

Eco RI

Sal I

Eco RI

SphI

Bgl IISal I

pUC8

bla

Figure 17. Schematic diagrams of plasmid used for transformation.

pAHC25

Reporter gene,GUS

Selection marker gene, BAR

82

1 2 3 4 5

Concentration ofMannitol&Sorbitol

0 0.3 0.6 0.9 1.2

Number of GUS Spot 609 1189 2804 2739 1894

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Nu

mb

er

of

GU

S Sp

ot

Comparison of transient GUS expression in MS-D2B0.5CH with mannitol and sorbitol

83

GUS Expression on Embryogenic Callus of Dwarf Napiergrass

84

1. Embryogenic calli of dwarf napiergarss could produce regenerated plants on

MS medium containing 2 mg L-1 2,4-D and 0.5 mg L-1 BAP, which was found as

a suitable induction medium of dwarf napiergrass.

2. MS medium containing same hormon on induction medium and addition by

50 μM CuSO4 was the best condition for proliferation.

3. The best osmoticum for embryogenic callus was found at 0.3M mannitol and

0.3M sorbitol. With this concentration give result in improving number of

GUS expression and there was no browning expression in the calli.

4. This embryogenic calli can be used as target tissues for genetic

transformation using particle bombardmet of napiergrass.

Conclusions

85

Cogongrass Napiergrass

Dwarf Type Artificial Mutation Natural Mutation

Propagation Clonal/ No Seed Clonal/ No Seed

Merit Covergrass, cluster grass, Easy to maintenance

Forage for grazing area, Good Quality forage

Demerit Difficult to propagate Need alternativemethods and breeding

SUMMARY

86

The Total Composition of Artificialdifficult