7/21/2019 Isolasi Enzim

1/24

ISOLASI ENZIM

7/21/2019 Isolasi Enzim

2/24

RUANG LINGKUP

Preparasi Sampel

Ekstraksi

Fraksinasi

Dialisis

Kromatografi

Elektroforesis

Spektrofotometri

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

7/21/2019 Isolasi Enzim

3/24

1. PREPARASI SAMPEL

Preparasi Sampelisolat protein.

tergantung pada sumber

Sumber Enzim: Mikroorganisma

Hewan

Tumbuhan

7/21/2019 Isolasi Enzim

4/24

2. EKSTRAKSI

SentrifugasiDiferential

Sel dihancurkan dengan

homogenizer homogenatdi setrifugasi diferentialekstrak yg berat akan adadi dasar tabung

7/21/2019 Isolasi Enzim

5/24

Enzim dapat dimurnikan berdasarkan sifat

kelarutan, ukuran, muatan, dan afinitas enzim.

7/21/2019 Isolasi Enzim

6/24

TEKNIK FILTRASI

7/21/2019 Isolasi Enzim

7/24

7/21/2019 Isolasi Enzim

8/24

3. FRAKSINASI

Kelarutan Enzim Fraksinasi Enzim

7/21/2019 Isolasi Enzim

9/24

4. DIALISIS

Saat awal dialisis Mencapai kesetimbangan

Enzim dapat dipisahkan dari molekul yg kecil (garam amonium sulfat)dengan proses dialisis menggunakan membran semipermiabel ~selulosa membran

Proses Dialisis:

.................................

.................................

.................................

..................................

..................................

7/21/2019 Isolasi Enzim

10/24

5. KROMATOGRAFI

Gel Filtrasi berdasarkan ukuran molekul

Kromatografi Penukar Anion/Kation

berdasarkan muatan total enzimAfinitas Kromatografi berdasarkan

afinitas (spesifikasi ikatan)

HPLC berdasarkan ukuran molekul

7/21/2019 Isolasi Enzim

11/24

GEL FILTRASI

Polimer terhidrasi: dextran, agarosa, poliakrilamida Sephadex, Sepharose, Biogel ~ diamater 100 m (0,1 mm)

7/21/2019 Isolasi Enzim

12/24

KROMATOGRAFI PENUKAR ANION/KATION

Enzim bermuatan positif/negatif yang telah terikat pada resin -/+ dapatdielusi dengan meningkatkan konsentrasi NaCl yang akan berkompetisidengan Enzim untuk berikatan dengan muatan +/- dari resin.

7/21/2019 Isolasi Enzim

13/24

AFINITAS

KROMATOGRAFI

Conconavalin A(Glikoprotein)mempunyai residuGlukosa yang akan

berikatan dengan kolom.Penambahan larutanglukosa Conconavalin

A akan terelusi.Pemurnian

7/21/2019 Isolasi Enzim

14/24

H P L C

1.Thyroglobulin (669 kd),

2.Catalase (232 kd),

3.Bovin serum albumin (674.Ovalbumin (43 kd),

5.Ribonuklease (13,4 kd)

kd)

7/21/2019 Isolasi Enzim

15/24

Gel Elektroforesis

SDS Gel Elektroforesis

Isoelectric Focussing

Two-Dimensional Electrophoresis

1.

2.

3.

4.

6. ELEKTROFORESIS

7/21/2019 Isolasi Enzim

16/24

GEL ELEKTROFORESIS

Pemisahan enzim berdasarkan ukuran molekul semakinkecilukuran protein, semakin cepat laju enzim pada proses elektroforesis

7/21/2019 Isolasi Enzim

17/24

Cross-linker

PembentukanGel Akrilamida

7/21/2019 Isolasi Enzim

18/24

SDS Gel Elektroforesis

memutus interaksi non-kovalen pada enzim enzim

bermigrasi berdasarkan massa

7/21/2019 Isolasi Enzim

19/24

ISOELCTRIC FOCUSSING

Pemisahan enzim berdasarkan muatan residuasam/basa dari asam amino

7/21/2019 Isolasi Enzim

20/24

TWO DIMENSIONAL ELECTROFORESIS

Enzim dipisahkan dengan SDS PAGE (terpisah berdasarkan ukuranmolekul), kemudian di lakukan IEF (pemisahan berdasarkan muatanasam/basa dari residu asam amino)

7/21/2019 Isolasi Enzim

21/24

Elektroforesis Proses Pemurnian Enzim

Efektifitas proses pemurnian terlihat dengan semakin murninyaEnzim yang diinginkan.

7/21/2019 Isolasi Enzim

22/24

7. SPEKTROFOTOMETRI

Spektrofotometri Massa MALDI-TOF

7/21/2019 Isolasi Enzim

23/24

Spektrofotometri Massa MALDI-TOF: Insulin dan -Lactoglobulin

7/21/2019 Isolasi Enzim

24/24

KUANTIFIKASI PROSES

PEMURNIAN ENZIM

ISOLASI/

Total Protein

Rendemen

Aktivitas Enzim Aktivitas Spesifik

Tingkat Kemurnian