KAR,AKTERISASI ENZIM KATEPSIN DARI IKAN PATIN (Ponsosius sp)
f,lrcmmod Zokiyul Fikri, lmo Wiioyonti, Noni Nur'qenoh, Sofrino Dyoh Hordiningtyos,Elizobeth Juleni Topotubun
Deportemen Teknologi Hosil Peroiron, Fokultos Perikonon don Ilmu Kelouton, IPB
Abstrsk
I':im kotepsin merupokon enzim penting yong berperon dolom proses pelunokon: : ; - I i< on selomo proses kemunduron mutu. Aktivitos enzim ini songot berpengoruhn ':::o proses kemunduron mutu ikon . Oleh koreno itu, perhr diketohui korokteristik enziri"i
i ::-':clom proses kemunduron mutu sehinggo dopot mengombil longkoh yong tepot:: :* :erongonon don pengolohon ikon. Tuiuon penelition iri odoloh mengekstrok enzim: ::: - :ori ikon potin don menentukon korokter enzim kot,rpsin yong berosql dori ikon: )e'elition ini dilokukon duo tohop yoitu ekstroksi en;,im kosor don pengendopon:- . : - c.nmonium sulfot. Hosil penelition ekstrok kosor (c'ude ekstrok) enzim kotepsin
-:'-- -((:rn oktivitos spesifik 0,457 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengon- -'
= I --c(on ommonium sulfot 6070. Pengendopon dengon renggunokon ommonium sulfot-:-:-:: iion oktivitss spesifik 0,23 koli. Enzim kotepsin memprnyoi suhu optimum 50 "C don- :''*-T 6, konsentrosi substrot optimum 670 dengon niloi crktivitos 0,8167 U/ml. Berot
enzim kotepsin kosor hosil SDS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot molekul enzim: ;-go mempunyoi oktivitos proteolitlk podo onolisis zym,rgrom odoloh 28,88 kDo.
-: : enzim, kotepsin, korokteristik, ikon potin
,T H U LUAN
: 3' n merupokon ienis ikon konsumsi oir towor osli lndonesio yong tersebor di
:- .viloyoh Sumoters don Kolimonton. Doging ikon potin memiliki kondungon kolori
':'e n yong cukup tinggi, roso dogingnyo khos, eno<, lezot don gurih sehinggo
:' :leh mosyorokot. lkon potin diniloi lebih omon untuk kesehoton koreno kodor
'.'/a rendoh dibondingkon dengon doging hewon 'ernok. Seloin itu ikon potin
:eberopo kelebihon loin, yoitu ukuron per indiv dunyo besor don di olom
;-: r biso mencopoi 120 cm (Susonto don Amri, 2OO2).
"':1urut doto stotistik perikonon budidoyo tohun 2O('1, produksi ikon potin (dori
.: kolom, kerombo don ioring opung, serto sowoh) odoloh sebesor I l.l I8 ton.
: <rn potin noik meniodi 32.375 ton podo tohun 2005, tetopi podo tohun 2006 turun
: 3' .490 ton (Anonim 2OO7). Berbogoi tontongon yong dihodopi dolom pemosoron
::' - hosil budidoyo ontoro loin odoloh odonyo hom >oton menyongkut mutu don
:-:'pongon. Hol ini disebobkon koreno ikon polin secerti holnyo sifot ikon podo
- . : ' oitu cepot mengolomi kemunduron mutu ikon.
re.urunon mutu ikon teriodi segero seteloh ikon dito rgkop otou moti. Kecepoton
,-:'mutu dipengoruhi oleh bonyok foktor, ontoro loin ienis kelomin, ienis ikon, ukuron
.:-o si lingkungon, perlokuon fisik, iumloh iosod renik, dor oktivitos enzim (Ridwonsyoh
I Prosiding Pertemuon llmioh don Semincr Nosionol MPHPI 20'i I 2l
2oo2)' soloh sotu ienis enzim yong berperon penting dorom proses kemunduron mufu ikonodoloh enzim-enzim penguroi protein (enzim proteoritik) yong menguroikon protein meniodipepton' polipeptido' don osom-osom omino (Kreuzer r 965) Hidrorisis protein oreh suotuproteose seperti kotepsin colpoin don kologenose dopot menyebobkon timburnyo okumurosimetobolit' perubohon citoroso, don pelunokon tekstur, terbentuknyo komponen vorotire sertopeningkoton iumloh bokteri yong okhirnyo menimbulkon kebusukon.Proteqse odoloh enzim yong mompu menghidrolisis ikoton peptide podo protein.Enzim ini untuk melokukon oktivitosnyo membutuhkon oir sehinggo dikerompokkon dorom keloshidrolose (Roo ef o/' I998)' secoro umum proteose dopot dibogi dorom duo gorongon, yoituproteinose don peptidose' Berdosorkon sifot kimio don sisi okt;fnyo dikenor empot gorongonprofeose yoitu serin, sistein, osportot don metollo endopeptidqse (otto don schirmeisfer
jilll;.t'ttein proteose merupokon kelompok besor enzim, termosuk korepsin risosomor don
Kofepsin ditemukon di lisosom serot doging don di sel fogosit. Lisosom merupokonintroseluler orgonel yong bonyok mengondung enzim hidrolitik don berperon dorompencernoon dolom sel' Kotepsin odoloh osom proteose terretok di risosom. Mereko mungkinterbeboskon ke keduo sitoplosmo don ruong introseruror sebogoi konsekuensi dori gongguonlisosomol yong teriodi seteloh kemotion sel okibot penurunon pH (Duston r 9g3 diocu dolomCherer 2OO7).
Beberopo tipe kotepsin teloh diidentifikosi dengon osom omino yong berbedo di sisioktifnyo' Kotepsin B don Kotepsin L keduonyo merupokon sistein proteinose yongkemungkinon poling penting dolom kemunduron tekstur doging (Aoki er cr. 2ooo;Kolodzieisko don sikorski 1996)' Aktivitosnyo berbedo-bedo tiop froksi doging don spesiesikon' Aktivitos opfimum diloporkon podo suhu 4o-so oc don oktivitosnyo menurun dengonpenurunon suhu' Kotepsin secoro umum bekerio podo pH 3-4 don beberopo kotepsin iugomempunyoi oktivitos tinggi podo pH 6-6,5 (Aoki ef ot. 2ooo; Korodzieisko don sikorski1996).
Aktivitos kotepsin songot berpengoruh terhodop tekstur doging ikon koreno kotepsindopot menurunkon fleksibilitos (kekenyolon) sehinggo doging ikon meniodi t,dok elostic donioringon doging ikon melunok (lembek)' Pelunokon doging ini merupokon soroh sotu sumbermosoloh podo industri surimi koreno kotepsin dopot menurunkon kemompuon pembentukongel podo proses pembuoton surimi dori doging ikon okibot degrodosi protein myofibrir yongdopot mengurongi elosfisitos don kekuoton gel surimi. Jenis kotepsin B, D, L don H telohdiketohui memiliki efek ge/ soffenrng podo proses pembenrukon ger surimi (Hoord 2ooo).
I Prosiding pertemuon llmioh don Seminor N.*r, *rrfllO, ZZ
fir*egr dori penelition ini odoloh untuk mengetohui korokterisosi don purifikosi enzim kofepsin
r *on Potin dengon presipitosi ommonium sulfot.
:TO'I}E PENELITIAN
Eil don Alot
Bohon yong digunokon terdiri dori bohon utqmo berupo ikon potin dolom keodoon
bohon-bohon untuk ekstroksi kosor (buffer Tris HCI 0,1 M pH 2,4), presipitosi
rsrm,urium sulfot teknis), uii oktivitos kotepsin (hemoglobin, buffer tris HCI 0,1 M pH 7,4,
- ::rodes, TCA Soh,folin, HCI I N), uii kodor protein (pereoks Brodford, bovine serum
* - Alot yong digunokon ontoro loin incubotor, sentrifuse suhu Jingin, spektrofotometer,
r, - *:'i', kertos soring whotmon no.'l , tobung reoksi, don erlenmeyer '
irr .':r,si Kotepsin Kqsor
i<stroksi dilokukon dengon presipitosi sompel untuk merrperoleh ekstrok kosor
n:: - cengon coro ikon dimotikon, kemudion doging ikon dibedoh dengon cepot don
.: ---,6 menghilongkon dorqh. Tohopon ekstroksi kotepsin kosor ;eloniutnyo berdosorkon
". :' :, 2002).
:,'erisosi Suhu
. c.okterisosi suhu dilokukon dengon melokukon voriosi st,hu inkubosi podo soot
.- :- oktivitos kotepsin dengon suhu 20, 30, 40,50, 60 dan 70 oC. Podo woktu
.- r-, hemoglobin sebogoi substrotnyo dibuot dengon konsenlrosi 2oh pH 2. Aktivitos
: - .:'epsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu ef ol.2OO2)-
: ,'erisosi pH
.: crokteriscsi pH dilokukon dengon menggunokon substro" hemoglobin 2o/o yong
:.-" ::do berbogoi voriosi pH yoitu 4, 5, 6, don 7. Seloin i'u, buffer Tris HCI yong
: - -:.3n iugo diotur podo voriosi pH yong somo yoitu 4, 5, 6, don 7. Aktivitos enzim
:-: - <osor di ukur berdosorkon (Dinu el ol.2OO2l.
ir : :*'erisosi Konsenirqsi Subslrqt
< crqkterisosi konsentrosi substrot dilokukon dengon menguboh konsentrosi substrot
-*:: rcln dengon berbogoi voriosi konsentrosi yoilvz 3o/o,4oh, !;oh don 60/o (b/vl pH 2.
:: enzim kotepsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu et ol.2OO2)'
i"+: : tosi Enzim Kotepsin Kosor
<r.otepsin semi murni diperoleh dengon mengendopkon esktrok kosor kotepsin
-,-.I,-ckon ommonium sulfot dengon tingkot keienuhon 5Oo , 600/0, 7ooh, don 807o.
* -:- --^ sulfot ditombohkon sedikit demi sedikit ke dolom supernoton don seloniutnyo
I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor No,ionol MPHPI 20 11 23
disentrifuse podo '12000xg selomo 30 menit. Pelet yong diperoleh dqri hosil sentrifuse
dilorutkon dolom buffer Tris HCI 0,1 M pH7,4.
Aktivitos Kotepsin
Aktivitos proteolitik dori kotepsin diuii menggunokon hemoglobin sebogoi substroinyo
dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Aktivitos kotepsin diukur menurut metode Dinu et o/. (2002).
Penetuon Konsenlrqsi Protein
Konsentrosi protein ditentukon dengon menggunokon metode Brodford dengon bovin
serum olbumin (BSA) sebogoi stondor (Brodford 1976).
Penenluon Berot Molekul dengon SDS-PAGE don Zimogrom
Penentuon berot molekul dilokukon dengon metode SDS-PAGE dengon komposisi gel
penohon (stocking gel) sebesor 4o/o don gel pemisoh (gel okrilomid) sebesor 8o%. Anolisis SDS
don zimogrom dilokukqn berdosorkon (Loemmli I970).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstroksi Enzim Kolepsin
Ekstroksi enzim kotepsin kosor dori doging ikon potin dilokukon dengon mengombil
bogion doging ikon yong sudoh memosuki tohop posf-rigor. Berdosorkon hosil penelition
Fentiono (2009), podo f ose ini oktivitqs kotepsin berodo podo oktivitos tertinggi
dibondingkon podo fose-fose sebelumnyo, sehinggo dihoropkon rendemen kotepsin yong
dihosilkon tinggi.
Seloniutnyo doging ikon dilorutkon dolom qkuodes dengon perbondingon l:'l don
dihomogenisosi. Menurut Correno (2000), kotepsin bonyok ditemukon podo lisosom don sel
pogosit. Proses homogenisosi ini bertuiuon untuk mengeluorkon enzim kotepsin dori bogion
lisosom don mitokondrio.
Hosil pemecohon sel dengon proses homogenrsosi dipisohkon dengon sentrifugosi
metode diferensiol sebonyok tigo koli. Penelition yong dilokukon Dinu el o/. (2OO2l
menyebutkon bohwo podo sentrifugosi tingkot pertomo dilokukon sentrifugosi podo
kecepoton 600x g selomo l0 menit. Sentrifugosi tingkot keduo dilokukon podo kecepoton'10000x g selomo '10 menit. Sentrifugosi tohop ketigo dilokukon podo kecepoton 4000x g
selomo I0 menit.
Sentrifugosi metode differensiosi diowoli dengon sentrifugosi tingkot pertomo, dimono
supernoton yong dihosilkon diombil untuk kemudion dilokukon sentrifugosi keduo podo
kecepoton tinggi untuk memisohkon portikel yong berukuron sedong. Pelet yong dihosilkon
podo sentrifugosi keduo dilorutkon dengon buffer Tris-HCl 0,1 M pH7,4 dengon iumloh yong
somo dengon okuodes yong digunokon untuk proses homogenisosi.
T
I Prosiding Pertemuon llmioh Jon Seminor Nosionol MPHPI 201 1 24
: r -:u'nyo disentrif ugosi kemboli untuk memperoleh supe rnoion yong merupokon
:::' dqri kotepsin. Buffer Tris-HCl pH7,4 yong digunokon ;ebogoi pelorut berfungsi
-;ungi enzim dori seiumloh besor osom yong dileposkon dori vokuolo podo soot
:e . rlol ini seloros dengon pendopot Whittoker (1994} /ong menyotokon bohwo
=-:'n- seboiknyo menggunokon buffer untuk mengontrol pH dekot dengon 7,5 don
:- 0,1-0,5.
' ."ros ekstrok kosor enzim kotepsin ditentukon dengon rrenggunokon hemoglobin
-ssirctnyo dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Hosil penguiion menuniukon ekstrqk kosor
'=csin memiiki oktivitos spesifik sebesor O,45706 lJ/ry1 dengon kodor protein.. - 2202 mgf ml. Niloi oktivitos enzim kotepsin dipengort hi oleh ienis ikon, kondisi
":-c'ongon gonod, umur, don temperotur lingkungon. Aktivitos spesifik ekstrok
* kctepsin dori ikon bondeng (Chonos chqnos Forskol) mencopoi 0,8598 U/-g
-:'l , 9,4 Ufmg podo ikon mockerel don 4,5 U/^g prdo milkfish (Jiong ef o/.
- ' : J/^g podo ikon mos (Liu ef o/. 2008). Beordrrll don Johnston (1985)
':- cchwo oktivitos enzim kotepsin podo ikon soithe (Po//:chius virens L.) meningkot
: !? on'ro kondisi lopor. Podo ikon solmon lOncorhyncl'us kefo L.) menuniukkon
:':'eolitik cothepsin L tinggi selomo migrosi pemiiohon (Yomoshito el o/. .l990).
- :, A<fivitos kotepsin podo otot meningkot cepot selom,r musim pemiiohon ikon
--:-: n. pi/chordus) (Gomez-Guillen don Botiso 1997).
:: Enzim Kosqr
i':-'c\, (qsqr yqng diperoleh seloniutnyo di presipitosi menggunokon qmmonium sulfot
'-l{c- keienuhon 5Oo/o,6Oo/n,7Ooh, don 807o dengon tuiu:n untuk memisohkon don
,:- e-:im kotepsin dori protein-protein loin yong terdopot :odo ekstrok kosor enzim
3r lihon tingkot ke[enuhon ommonium sulfot podo rento rg 5O%-8Ao didosorkon
: - : : c :t Bisswonger (2004) yong menyotokon bohwc tiop presipitosi protein
-ck'eristik podo konsentrosi reogen yqng berbedo. Pres pitosi dengon omrnonium
-: se cng konsentrosi 20-1A0o dionggop cukup untuk pre;ipitosi protein. Berbogoi
-sr yong dopot digunokon podo proses presipitosi diorforonyo ommonium sulfot,
:::e" polietilen glikol (PEG), otou loruton orgonik seperti oseton otou olkohol
I ?a diocu dolom Kumor ef o/. 2003). Nomun pe nilihon ommonium sulf ot
, :- p,:rdo pendopot Jovois (.l999) yong menyotokon bohwo ommonium sulfot
: : ::pct don muroh.
-"'."ic; enzim kotepsin ikon potin yong teloh mengolorri pengendopon dengon
-- :;rf ot dopot dilihot podo Gombor l.
I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 201 I 25
ti .!-,
li ;
l! lr ,
).,
ti'
Gombor 'l Aktivitos enzim kotepsinommonium sulfot.
€sen 4*16 66$+ *ft*6 1*#.i+
lqoc***ntra*[ arftsatgm fi{.+{f *t
setelqh pengendopon dengon berbogoi konsentrosi
Aktivitos enzim podo pelet lebih besor dibondingkon dengon oktivitos enzim podo
supernoton. Aktivitos optimum enzim kotepsin podo pelet diperoleh dengon pengendopon
ommonium sulfot podo tingkot keienuhon 600/o dengon niloi 0,21 62 unitfml don oktivitos
enzim menurun toiom dengon semokin tingginyo tingkot keienuhon qmmonium sulfot. Aktivitqs
enzim kotepsin podo supernoton cenderung mengolomi p.nrrunon dengon semokin
meningkotnyo tingkot keienuhon ommonium sulfot. Presipitosi menggunokon gqrom odoloh
coro pengendopon protein berdqsorkon kemompuon ion gorom dolom mempengoruhi
kelorufon protein. lon gorom dori gorom ommonium sulfot, yoitu ion NHr+ don SO+2-. Pqdo
konsentrosi rendoh, ion-ion gorom tersebut okon mengelilingi protein don mencegoh
bersotunyo molekul-molekul ini, sehinggo protein lorut. Peristiwo ini disebut solfing in. Pqdo
konsentrosi yong finggi, teriodi peningkoton muoton listrik disekitor protein yong okon
menorik moteri oir dori koloid protein. Interoksi hidrofobik diontoro sesomo molekul protein
podo suoson yong tinggi qkon menurunkqn keloruton protein (Suhortono 1989).
Koroklerislik Suhu Ekstrok Kosor Enzim Kotepsin
Suhu merupokon soloh sotu foktor yong mempengoruhi oktivitos enzim. Pengoruh suhu
terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor disoiikon podo Gombar 2. Aktivitos enzim meningkot
dengon odonyo peningkoton suhu dori 40 oC meniodi 50 oC, nomun peningkoton suhu
sompoi 60 'C menyebobkon oktivitos enzim menurun. Suhu optimum ekstrok kosor enzim
kotepsin odqloh podo suhu 50 "C dengon niloi oktivitos 0,0749 U/ml.
Podq perubohon suhu, kecepoton reoksi yong dikotolisis oleh enzim mulo-mulo
meningkot koreno odonyo peningkoton suhu. Energi kinetik okon meningkot podo kompleks
enzim don substrot yong bereoksi. Nomun, peningkoton energi kinetik oleh peningkotqn suhu
mempunyqi botos yong optimum. Jiko botos tersebut terlewoti, moko energi tersebut dopot
memutuskon ikoton hidrogen don hidrofobik yong lemoh yong mempertohonkon struktur
sekunder-tersiernyo. Podo suhu ini, denoturosi yong disertoi dengon penurunon oktivitos
L
v
4ry
26I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 20l I
L_
F -togtoi kotolis okon teriodi suhu optimol enzim bergontung podo lomonyo
Fh kodor yong dipokoi untuk menentukonnyo. Semokin lomo suotu enzim
Fh-H- podo suhu dimono strukturnyo sedikit lobil, moko semokin besor kemungkinonpur mengolomr denoturosi.
i i,:Snilat
t Gombor 2 Pengoruh suhu terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor.
L=-=--=-] $crot pgo merupokon sqloh sotu foktor yong mempengoruhi loiu reoksi enzim.
I*, dd dengon kosentrosi enzim yong lebih sedikit dibondingkon subsrrot, penembohon
Fa frr rreningkotkon loiu reoksi. Peningkoton loiu reoksi ini teriodi secoro lineor. jiko
]- rtcrot don enzim seimbong, loiu reoksi okon relotif konston. pengoruh kosentrosi
Jfr':*roaop oktivitos spesifik enzim dopot dilihot podo Gombor 3. Kosenrrosi substrot
lFF.5 lerhodop qktivitos spesifik enzim yong dihosilkqn. Jiko kosenrrosi substrot
l*- noko oktivitos spesifik enzim okon sompoi podo tifik tetentu. Kosentrosi substrot
F- 616 merupokon kosentrosi substrot yong poling tinggi oktivitos spesifik enzim kotepsin
lF Joi sebesor 0,81 67 (U/ml) tetopi tidok biso dikorokon bohwo 60% merupokon
]ffi optimol untuk enzim kotepsin koreno dengon dinoikkon kosentrosi substrotnyo
lr.OX lernr.rngkinon okon menemuksn iumloh kosentrosi optimol untuk enzim ini.
0.90
= 0.80
€ o.zof,- 0.60.5 o.soE o.+o
$ o.:oE o.zo< 0.10
0.00
K3% K4% K50/o K6%
Konsentrasi substrat
l:-c:r 3 Pengoruh kosentrosi substrot terhodop oktivitos spesifik kotepsin.
?,=€ *.+3 ;
c
*;LT=i\J{
I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nos onol MpHpl 20l 1 27
----rE
Semokin bonyok molekul substrot yong tersedio, semokin sering molekul-molekul
tersebut memosuki sisi qktif molekul enzim. Akon tetopi, terdopot keterbotoson dolom
memqcu kecepoton reoksi dengon corq menombohkon lebih bonyok logi substrqt ke suotu
kosentrqsi enzim yong tetop. Pqdo suotu titik tertentu, kosentrosi substrot itu qkon meniodi
cukup tinggi sehinggo semuo sisi oktif podo semuo molekul sudoh ditempoti oleh susbtrot.
Segoro seteloh produk meninggolkon sisi oktif, molekul substrot yong loin okon mosuk. Pqdq
kosentrosi substrot seperti ini, enzim ifu dikotokon mengolomi keienuhon don loiu reoksi
ditentukon oleh kecepoton sisi oktif menguboh substrot meniodi produk. Ketiko suotu enzim
teloh ienuh, sotu-sotunyq corq untuk meningkotkon produktivitos oioloh menombohkon lebih
bonyok logi enzim (Compbell 2OO2l.
Pengoruh pH
Semuq reoksi enzim dipengoruhi oleh pH medium tempot reoksi feriodi. Setiop enzim
memiliki pH optimum yong khos, yoitu pH yong menyebobkon oktivitos moksimol. Profil
oktivitos pH enzim menggomborkon pH podo soot pemberi don penerimo proton yqng
penring podo sisi kotolitik enzim berodo podo tingkot ionisosi yong diinginkon. Nomun podo
pH tertentu (ekstrim) dopot menyebobkqn enzim terdenoturosi yong menyebobkon enzim
kehilongon oktivitos biologisnyo (Lehninger I 993).
Niloi pH songot berpengoruh terhodop oktivitos spesifik enzim kotepsin. Niloi pH
yong memberikon oktivitos spesifik terboik, ditompilkon oleh pH 6 yoitu 0,6660 U/ml. Jiko
pH kurong qtou lebih dori 6, menyebobkon teriodinyo penurunqn oktivitos spesifik dori enzim
korepsin (Gombor 4). Aktivitos spesifik kotepsin yong lebih tinggi podo pH 6 iugo ditemukon
podo ikon nilo (Sherekor el ol. 1988) don doging ikon mos (Horo ef ol. 1988).
pH
Gombor 4 Pengoruh pH terhodop ok.ivitos spesifik kotepsin.
Bobot Molekul Kotepsin
Penentuon bobot molekul dilokukon dengon nrenggunokon teknik SDS-PAGE (Sodium
dedocyl Su/phofes-Poliocrylomido gel E/ekfroforesis). Pcdo metode ini terdopot duo mocom gel
yoitu gel pemisoh (resolving) don gel penohon (sfocking gel) yong mengondung SDS, APS
a s.ffisE
H n.arym
EE m"4+*$a,
E s&mil
E *.uwo
Prosiding Pertemuqn llmioh dqn Seminor Nosionol MPHPI 201 I
:--cnium perisulfot), okrilomido don TEMED serto sompel yorg okon ditentukqn berot
- : .<.J nyo yoitu ekstrok kosor enzin, kotepsin.
i.osil onoliso berot molekul dengon SDS-PAGE dopot dilihot podo Gombor 5. Morker
:-: cigunokon podo onoliso ini berosol dori pormocio. Morker pqrmocio menggunokon
':-:sr LMW (Low Moleculorweight). Podo morker pormocio terlilot odo 6 bond/pito yong
:'rr.)e dituniukkon podo Tobel 2, sedongkon podo ekstrok kqsor terdopot 5 pito.
97 kDo 4i
66 kDo
14,4 kDq*
Morker Enzim kosor
-:-::r 5, Hosil onolisis SDS-PAGE ekstrok kosor enzim kotepsin ik:n potin. M = Mqrker, E=ekstrok kosor
Tqbel I Jenis stondor, berot molekul don niloi Rf stondor pormocio
45 kDo
30 kDq
20,1 kDq
-r'1w (14400-97000) BM Log BMJqrok migrosi Bond
(cm) (cm) Rf
llrcsphorylose b
ADqninOvolbumin
ffionic onhydrose
Trypsin inhibitor
r-Loclolbumin
97000 4,98677266000 4,81954445000 4,65321330000 4,47712120100 4,3031 9614400 4,158362
5
5
5
5
5
5
112
119
2,3
2rg
3r3
4,4
O,24
0,38O,46
0,560,660,88
3erot molekul ekstrok kosor ditentukon berdosorkon personroon regresi lineor ontoro
: ij con logoritmo berot molekul podo stondor (Gombor 6), Persomoon regresi linier
:: :- ! = -1,372x + 5,293 dimono y = log berot molekul norker (kDo), sedongkon
= -:tr ltos relotif protein (cm). Ekstrok kosor enzim kotepsin memiliki berot molekul sebesor
- ' - . )a,21,51 kDo, 29,50 kDo,43,10 kDo, don 55,49 kDo (Tot,el 1).
I Prosiding Periemuon llmioh don Seminor Nrrsionol MPHPI 201 1 29
- -=-
0
E!o
:.Igo5
tbroTD0
6
5
{3
2
I0
Y='1,3718xt 5'X9$9&r * fr.$$43
s.l 0,! t,3 0,4 s"5 0.$ s-? t8 s,$ IRf
Gombor 6. Kurvo stondor SDS-)AGE
Tobel 2 Perhitungon berot molekul ekstrok kosor e nzim kotepsin ikon potin
PoniongBqnd
5
5
5
5
PoniongBond (cm
2
2.4
3
3.5
Log BM BM BM Kd
,l
2
3
4
0.4 -1.372 5,293
0.48 -1.372 5,293
0.6 -1.372 5,293
0.7 -1.372 5,293
55488,12 55,49
43096,3 43,10
29498,5 29,5O
2 t 508 21 ,51
4,74424,634444,46984,3326
Untuk melihot qktivitos enzim dilokukon uii zimogr<rm dengon elektroforesis. Anolisis
zimogrom hompir somo dengon SDS-PAGE, perbedoonnyo podo gel ditomboh substrot yong
somo dengon uii oktivitos dengon spektrofotometri. Sompel podo zimogrqm tidok mengolomi
pemorrosqn seperti podo SDS-PAGE. Seloin itu podo zim!)grom terdopot proses pemulihon
protein dengon coro inkubosi. Hosil onoliso zimogrom dopot dilihot podo gombor 7. Podo
ekstrok kosor terdopot bond bening yong menunfukon :donyo oktivitos enzim kotepsin.
Morker yong digunokqn berupo pormocio dengon kurvt regresi y = -1,160x + 5,266
(Gombor 8). Berot molekul dori bond bening tersebut Jihitung berdosorkon persomoon
regresi dori stondor don diperoleh niloi sebesor 28,28 kDo (Tobel 2). Penelition yong
dilokukon Krouse ef ol. (2010) mennuniukkon bqhwo kotecsin D yong berqsol dori doging
ikon osfrich memiliki bobot molekul 29,1 kDo. Penelition loir yong dilokukon oleh Jiong ef ol.
(1997) mengenoi kotepsin D ikon tongkol don ikon bondetg, menuniukkon bahwo kotepsi D
podo ikon tongkol terestimosi sebesor 5l kDo don podo ikrn bondeng sebesor 54 kDo.
I Prosiding Pertemuon llmioh don l,eminor Nosionol MPHPI 2OI I 30
97 kDa
66 kDo
45 kDo
30 kDq
20.1 kDo
8,88 kDo
14,4kDo re€.Morker Hasil pengendapan
ammonium sulfat
Gombor 6 Zimogrom enzim kotepsin ikon potin.
ur5l
I
41
3
2
1
0.0.
./= -1.1607x + 5.2661R2 = 0.9461
lI
I+-,00 0.20 0.40 0.60 0.80 'r.00 1.20
Rf
Gombor 7 Kvrvo regresi lineor Zimogrom stondur pormocio.
Tobel 3 Perhitungon berot molekul enzim yong men"punyoi oktivitos
lgoE
E(,.oo)o
Ponionglo nd Migrosi
(cm)
PoniongBond Rf(cm)
q b [ogBM Brvr rlJlri':-":,( kosor 3.3 0.702128 -'r.r 6 5,266 4,451532 28283,42 28,28
( "i -pulon
-os l penelition ekstrok kqsor (crude eksfrok) enzim kotepsin menuniukkon oktivitos
:; :. ),a57 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengrn menggunokon ommonium
':' :lr :: Enzim kotepsin mempunyoi suhu optimum 50 'C dor pH optimum 6, konsentrosi
: ":- opi,mvm 60/o dengon niloi oktivitos 0,8167 U/ml. Berot nolekul enzim kotepsin kosor
ilS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot rnolekul enzim yong didugo mempunyoi oktivitos
4.7
I Prosiding Pertemuon llmioh don Semino. Nosionol MPHPI 201 1 3l
proteolitik podo onolisis zymogrom odoloh 28,88 kDo. )engendopon dengon menggunokon
ommonium sulfot menghosiikon oktivitqs spesifik 0,23 koli
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2007. Stofistik Ke/oufon don Perikonon Tohun 2006. Pusot Doto Stotistik don
lnformosi. Deportemen Kelouton dqn Perikonsn. Bodon Pusot Stotistik Republik
lndonesio
Aoki T. Yomoshito T. Ueno R.2OOO. Dislribution of cofhe psins in red ond white muscles omong
fish species. J. Agric. Food Chem . 43 t 327 -330
Beordoll C. Johnston lA. ,l985. Lysosomol enzyme oc'ivities in muscle following storvotion
ond refeeding in the soithe Pol/ochius Virens l.E r. J.Cell Bio/.39''l 12-117.
Bisswonger H. 2004. Procticol Enzymology. Germony: \Viley-VCH'
Brodford MM. ,|976. A Ropid ond sensitive method for rluontificotion of microgrom quontities
of protein utilizing the principle of protein dye binding. Ano/ Biochem72r234-254.
Cheret R, Lodrot CD, Anton M de Lombollerie, Bogni ' YY.2OO7. Colpoin ond cothepsin
octivities in posf morlem fish ond meot muscles. f cod Chemislry'l0l: I474-1479
Dynnor N. 20l l. Pemurnicn don korokterisosi enzim Iotepsin dori ikon bondeng (Chonos
chonos Forskoll). [Skripsi]. Fokultos Perikonqn don llmu Kelouton. lnstitut Pertonion
Bogor.
Dinu D, Dumitru lF, Neichfor MT. 2OO2.lsoloiion ond c[ orocierizotion of two chotepsin f rom
muscle of corrqsius ourotus gibelio. Roum. Biolec'tol. Lelf.7(3),753-758.
Fentiono N. 2009. Peronon Enzim Proteose Jeroon lk< n Bondeng (Chonos chonos) dolom
proses kemunduron mutu. [skripsi]. Bogor: De portemen Teknologi Hosil Peroiron,
Fokultos Perikoncrn don llmu Kelouton, lnstitut Pe rtonion Bogor.
Gc mez-Guille'n MC, Botiso l. 1997. Seosonol chonge s ond preliminory chorocterizoton of
cothepsin D-like octivity in sordine (Sordinr: pi/chordus) muscie' int. J. Food Sci.
Technol., 32 255-264.
Hoord NF. 2OOO. Seofood enzymes: the role of odoptc tion ond onother introspesific foctor.
Dolcm: Hqord NF, Simpson BK, editor. Seofooc Enzymes : lJtilizqtion ond Influence on
Posfhorvest Seofc,od Quo/itiy. New York: Morcei Dekker. lnc. hlm 531-547
Jiong ST, Her YH, Lee JJ, AND Wong JH. 1993. Iomporison of the cothepsin D f rom
Mockerel (Scomber ousfro/osicus) ond Milkfish (Chonos chonos) muscle. Bioscience,
Biolechnology, Biochemislry 57 (4): 57 1 -577.
Jovois JC. .|999.
lmmunocylochemico/ Method ond Profoc:/s. New Jersey: Hurnono Press lnc.
Krouse l, Shonisoni C, Tshidino, Tomohiso O, Yosuhoru, /oughon, Bensh S, Muromoto K, Ryno
JN.2010. Iurificotion qnd portiol chorocterizot on of ostrich skeletol muscle cothepsin
D ond its octivity during meot moturotion. J. Me:lScience.87(3): 196-201.
Kreuzer R. ,1965. The Technology of Fish tJtitizofion. Englond : Fishing News (Books) Ltd,
Ludgote House I l0 Fleet Street London ECa.
Ku.nor A, lgor Y, Goloev, Bo M. 2003. /so/ofion ond t'urificolion Protein New York: Morcel
Dekker lnc.
Loemmli UK. 1970. Cleovoge of structurol protein riuring the sssembly of the heot of
bocteriopho ge 14. Nofure 227(10): 680-685'
I Prosiding Pertemuon llmioh con Seminor Nosionol MPHPI 2011 32
t_
lil H, Yin L, Zhong N, Li S, Mo C. 2008. lsolotion of cothepsin B from the muscle of silvercorp (Hypophtholmichlhys molilrixl ond comporison of cothepsins B ond L octions onsurimi gel softening. Food Chemistry I I 0: 3l 0-31 8.
Ono HH, Schirmeister T. '1997. Sislem Profeoses ond their inhibifors. Chem. Rev g7(l\ "133-172
Edwonsyoh. 2OO2. Pengoruh Konsenfrosi Hidrogen Peroksrdo don lomo perendomon lerhodopMutu lkan Kembung yong di Pindong. USU Librory : Universitos Sumotrs Utoro.
loo MB, Tqnksole ASM, Ghotgote MS, Deshponde W. I998. Moleculor ond BiotechnologicolAspecls of Microbiol Proteoses. Microb. Mol. Biol. Revw. 62: 1092-2171
lrorto, H don Amri, K. 2OO2. Budi Doyo lkqn Potin. Penebor Swodoyo. Jokorto. 90 hol.
lftortono MT. 1989. Enzim don bioteknologi. Bogor : Pusot Antor Universitos.
Ulftoker JR. 1994. Principles of Enzymology for lhe Food Science. Second Edition. New York:Morcel Dekker, lnc.
lqro*rito M, Konogoyo S. 1990. Porticipotion of cothepsin L into extensive softening of themuscle of chum solmon cought during spowning migrotion. Nippon Surson Gokkoishi,5621271-1277.
I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 20I I 33i