ii
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Natasya Nora Rubiyo
NIM: 168114019
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Tuhan menetapkan langkah-langkah orang yang hidupnya berkenan
kepada-Nya; apabila ia jatuh, tidaklah sampai tergeletak, sebab Tuhan
menopang tangannya.”
(Mazmur 37: 23-24).
“If somebody offers you an amazing opportunity, but you are not sure you
can do it, say yes, then learn how to do it later.” – Richard Branson
Saya persembahkan kepada,
Tuhan yang Maha Esa
Kedua orang tua saya yang selalu mendukung saya dalam keadaan terpuruk
sekalipun
Kakak tercinta saya yang selalu menguatkan saya ketika saya putus asa
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menuntut
ilmu selama ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan yang Maha Esa atas
berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul
“Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok Ras
Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction”.
Penulis menyusun skripsi ini untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma. Skripsi yang disusun merupakan bagian dari penelitian Dr.
Christine Patramurti, Apt. dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6 *4, *7, dan *9
pada Subjek Uji Nonperokok Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di
Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)”.
Penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak.
Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih
kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, dosen pembimbing yang telah
berperan seperti orang tua dalam memberikan pendampingan, masukan,
nasihat serta dukungan kepada penulis.
3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji yang telah
memberikan kritik dan saran kepada penulis.
4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang telah
memberikan kritik dan saran kepada penulis.
5. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku Kepala Penanggung Jawab
Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam
penggunaan laboratorium untuk kepentingan penelitian.
6. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku dosen Pembimbing Akademik atas
bimbingannya selama masa perkuliahan.
7. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
Halaman
COVER ...............................................................................................................
HALAMAN JUDUL ...........................................................................................
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..............................................................
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...............................................
HALAMAN PERSEMBAHAN ..........................................................................
PRAKATA ..........................................................................................................
DAFTAR ISI .......................................................................................................
DAFTAR TABEL ...............................................................................................
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................
ABSTRAK ..........................................................................................................
ABSTRACT ..........................................................................................................
PENDAHULUAN ...............................................................................................
METODE PENELITIAN ....................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................................
KESIMPULAN ...................................................................................................
SARAN ...............................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
LAMPIRAN ........................................................................................................
BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
x
xi
xii
xiii
xiv
xv
1
2
6
15
15
16
19
33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Frekuensi Alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 ........................................... 13
Tabel 2. Efek Polimorfi gen CYP2A6 pada beberapa obat ................................... 14
13
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis........................................................................... 9
Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida
CYP2A6*7.............................................................................. 10
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan
CYP2A6*7 (perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna
hijau dan abu-abu, primer ditunjukkan oleh warna
merah)….................................................................................. 12
Gambar 4. Elektrogram produk PCR dari berbagai isolat DNA..............
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Ethical Clearence Penelitian.............................................
Lampiran 2. Go TaqGreen Master Mix Certification of Analysis.........
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix.............
Lampiran 4. Usage information of FavorPrepTM
Blood Genomic DNA
Extraction Mini Kit...........................................................
Lampiran 5. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse
CYP2A6*7..........................................................................
Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers..............
Lampiran 7. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA..............
Lampiran 8. Elektroforegram Hasil PCR..............................................
Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sampel..............................................
Lampiran 10. Data Subjek.....................................................................
Lampiran 11. Formulir Kuisioner Subjek Uji........................................
Lampiran 12. Frekuensi Alel.................................................................
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRAK
Asap rokok merupakan campuran aerosol kompleks yang mengandung
senyawa prokarsinogenik yaitu nitrosamin. Senyawa nitrosamin akan berubah
menjadi karsinogenik setelah teraktivasi oleh gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6).
CYP2A6 sering mengalami polimorfisme, salah satu polimorfisme yaitu
CYP2A6*7 yang mengalami substitusi nukleotida T menjadi C pada urutan
nukleotida 8454 pada ekson 9. Hal ini mengakibatkan penurunan aktivitas enzim
dalam metabolisme nitrosamin. Variasi alel gen ini ditemukan pada perokok ras
kulit hitam cukup tinggi yaitu sebesar 13,33%. Penelitian ini bertujuan
mengetahui keberadaan dan frekuensi alel CYP2A6*7 pada isolat DNA
nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia. Penelitian ini merupakan penelitian
deskriptif observasional yaitu dilakukan identifikasi alel CYP2A6*7 pada 30
sampel isolat DNA nonperokok ras kulit hitam Papua di Indonesia dengan metode
polymerase chain reaction (PCR) dan dianalisis menggunakan metode
elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan adanya alel CYP2A6*7 pada
nonperokok ras kulit hitam Papua dengan frekuensi 0%, sehingga dapat
disimpulkan bahwa pada ras kulit hitam Papua nonperokok berpotensi mengalami
risiko kanker akibat menghirup asap rokok.
Kata Kunci: CYP2A6*7, ras kulit hitam Papua, Polymerase Chain Reaction
(PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
ABSTRACT
Cigarette smoke is example of a complex aerosol mixture which contains
procarcinogen compound such as nitrosamine. Nitrosamine compound will
transform into a carcinogenic compound after being activated by cytochrome
P450 2A6 gene (CYP2A6). CYP2A6 often experiences polymorphism, which one
of them is called CYP2A6*7 which undergoes T nucleotide substitution to C in
nucleotide 8454 in exon 9. This polymorphism causes reduction of the enzyme’s
ability to metabolize nitrosamine. The variation of this allele was found at a quite
high rate which is 13.33% in black Papuan smokers. This study aimed to
determine the presence and frequency of CYP2A6*7 alleles in DNA isolated from
non-smokers population of black Papuan in Indonesia. This research is an
observational descriptive study, which was done by identifying CYP2A6*7 alleles
in 30 samples of DNA isolated from non-smokers population of black Papuan in
Indonesia using polymerase chain reaction (PCR) method and was analyzed using
electrophoresis method. The result showed the presence of CYP2A6*7 alleles in
non-smoker population of black Papuan with a frequency of 0%, thus it can be
concluded that said race has potential risk of cancer due to inhalation of cigarette
smoke.
Keywords: CYP2A6*7, black Papuan, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Merokok merupakan salah satu kebiasaan yang sering dilakukan oleh
seluruh masyarakat di Indonesia maupun di dunia. Penelitian terbaru telah
memberikan bukti bahwa kebiasaan merokok tidak hanya dipengaruhi oleh
lingkungan, tetapi juga faktor genetik (Minematsu et al., 2006). Kebiasaan
merokok menyebabkan perokok aktif dapat menyebarkan polusi asap rokok.
Menurut Dede dan Cinar (2016), orang yang menghirup asap rokok tersebut
merupakan perokok pasif. Faktor risiko yang ditimbulkan dari asap rokok yaitu
dapat menyebabkan penyakit dan kematian (Schroeder and Warner, 2010).
Asap rokok merupakan campuran aerosol kompleks yang mengandung
nitrosamin yang mengandung tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Beberapa
senyawa golongan TSNA adalah 4-(mehylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone
(NNK), N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanabasine (NAB), dan N-
nitrosoanatabine (NAT) (Ashley et al., 2010). Menurut IARC (2007), senyawa
NNK dan NNN dikategorikan sebagai golongan 1 yang bersifat karsinogenik bagi
manusia dan dapat menginduksi kanker paru-paru, hati, rongga hidung, esofagus
dan eksokrin pankreas. Enzim yang berkontribusi dalam mengaktivasi kedua
senyawa tersebut yaitu CYP2A6, sehingga dapat menginduksi karsinogenesis
terhadap paru-paru (Chiang et al., 2011; Xue et al., 2014).
Aktivitas CYP2A6 sangat tergantung pada perbedaan individu, etnis,
serta variabilitas genetik CYP2A6 (Jordjevic et al., 2013; Kadlubar et al., 2009).
Saat ini terdapat 89 bentuk polimorfisme CYP2A6 yang telah teridentifikasi
(PharmVar, 2012). Variasi urutan DNA yang terjadi dalam suatu populasi dengan
frekuensi 1% atau lebih tinggi disebut polimorfisme. Polimorfisme yang terjadi
dapat berupa satu atau lebih perubahan nukleotida, seperti halnya mutasi (Karki et
al., 2015). Polimorfisme CYP2A6 yang terjadi pada ras berbeda menyebabkan
terjadi perubahan aktivitas dari enzim CYP2A6 dalam memetabolisme
nitrosamin. Beberapa penelitian menunjukkan CYP2A6 dalam memetabolisme
nitrosamin lebih rendah pada ras kulit hitam dibandingkan ras kulit putih (Liu et
al., 2011; Minematsu et al., 2006; Mwenifumbo et al., 2005; Nakajima et al.,
2006; Tanner et al., 2018).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Ras kulit hitam atau ras Negroid merupakan ras yang memiliki ciri
khusus warna dan bentuk rambut yaitu kulit berwarna hitam dan berambut
keriting. Populasi yang memiliki kesamaan ciri dengan ras Negroid (kulit hitam)
yaitu Afrika-Amerika dan masyarakat asli Papua (Waluya, 2007). Pada ras kulit
hitam ditemukan beberapa variasi gen CYP2A6 yaitu alel CYP2A6*2, *4, *5, *7,
*9, *10, *11, *17, *19, dan *20 (Nakajima et al., 2006). Polimorfisme alel
CYP2A6*7 ditemukan pada ras Negroid (kulit hitam) perokok di Afrika dan ras
Negroid perokok di Indonesia yaitu di daerah Papua (Tanner et al., 2018;
Tirtawamsa, 2018; Wassenaar, 2015).
Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme gen
CYP2A6 yaitu alel *7 pada populasi nonperokok ras kulit hitam Papua. Pada
individu yang memiliki alel gen CYP2A6*7 dapat menurunkan kemampuan
aktivitas dalam memetabolisme nitrosamin menyebabkan menurunnya kadar
senyawa karsinogenik nitrosamin yang telah teraktivasi dalam tubuh dan risiko
kanker. Hasil yang didapat dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan
untuk pengendalian wilayah asap rokok pada nonperokok ras kulit hitam Papua di
Indonesia.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah sampel darah dari populasi nonperokok ras
kulit hitam Papua. Primer forward: 5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3’
dan primer reverse: 5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ yang diadopsi dari
Minematsu et al. (2006), Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA
polimerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH
8,3 (Vivantis), Nuclease-Free Water (Promega Medison), agarosa (GeneDireX),
aqua pro injection, DNA loading dye 6X 10 mL (berisi glycerol 3,3 mL,
bromphenol blue 25 mg, aqua pro injection 6,7 mL), etanol absolute, 1KB (0,25-
10 kb) DNA ladder (SMOBiO), reagen FavorPrepTM
Blood Genomic DNA
Extraction Mini Kit, dan FluoroVueTM
Nucleic Acid Gel Stain.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Alat Penelitian
Tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL, vorteks, HeraeusTM
PicoTM
17
Microcentrifuge–Thermo Fisher Scientific, collection tube, microtube (0,2 mL),
tabung sentrifugasi, kolom FABG, elution tube, ice box, blue tip, white tip, yellow
tip, mikropipet ukuran 1-10 µL (Socorex Swiss), mikropipet ukuran 100-1000 µL
(Socorex Swiss), kamera mirrorless Fujifilm XA3, gelas ukur 50 mL dan 100 mL
(Pyrex), gelas beker 200 mL (Pyrex), erlenmeyer 250 mL (Pyrex), UV
Transilluminator, disposable gloves, hot plate, magnetic stirrer, vacutainer K2,
Thermal cycler Perkin Elmer 2400 dan neraca timbangan analitik ketelitian
0,0001 (Mettler Toledo).
Kriteria Subjek Uji
Penelitian ini menggunakan isolat DNA yang berasal dari subjek uji
nonperokok ras kulit hitam Papua di Indonesia. Kriteria subjek uji yaitu
nonperokok berjumlah 30 orang, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal
third degree relatives (kakek dan nenek orang Papua asli), pernah terpapar asap
rokok, dan sehat jasmani dan rohani. Subjek uji diwawancara terlebih dahulu,
dengan sadar bersedia menandatangani inform consent. Penelitian yang dilakukan
telah memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran
Universitas Kristen Duta Wacana Yogyakarta.
Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji
Pada penelitian ini dilakukan pengambilan sampel darah subjek uji oleh
petugas perawat. Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan
ditampung dalam vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4 mg. Darah segar
yang diperoleh disimpan pada suhu ± 4˚C sebelum dilakukan analisis. Darah ini
kemudian digunakan untuk mengidentifikasi alel CYP2A6*7.
Isolasi DNA
Reagen yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel darah yaitu
reagen FavorPrepTM
Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sebanyak 200 µL
sampel darah diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge 1,5 mL.
Sebanyak 20 µL Proteinase K dan 200 µL FABG buffer ditambahkan ke dalam
sampel kemudian divorteks secara cepat untuk mencampurkan larutan tersebut,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 60˚C untuk melisiskan sampel dan
divorteks setiap 3 menit selama 30 detik. Setelah diinkubasi, sampel disentrifugasi
dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Sampel yang telah disentrifugasi
ditambahkan 200 µL etanol absolute, dihomogenkan menggunakan vorteks
selama 30 detik dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 30 detik.
Kolom FABG dipasangkan pada collection tube dan sampel dipindahkan dari
tabung sentrifugasi ke dalam collection tube, kemudian disentrifugasi selama
13000 rpm selama 1 menit. Setelah disentrifugasi cairan yang terdapat di dalam
collection tube dibuang, lalu dipasangkan kolom FABG pada collection tube baru.
Kolom FABG yang telah dipindahkan dicuci dengan 500 µL W1 buffer lalu
disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 1,5 menit, kemudian cairan yang
terbentuk pada collection tube setelah sentrifugasi dibuang. Kolom FABG dicuci
kembali dengan 750 µL wash buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm
selama 1,5 menit, kemudian cairan yang terbentuk pada collection tube setelah
sentrifugasi dibuang. Setelah cairan tersebut dibuang kemudian disentrifugasi
selama 4 menit untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG yang telah kering
dipindahkan pada elution tube, lalu ditambahkan 200 µL elution buffer pada
kolom FABG kemudian didiamkan dalam posisi berdiri selama 3 menit. Setelah
didiamkan selama 3 menit, sampel disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit untuk mengelusi DNA. Fragmen DNA yang terbentuk setelah
disentrifugasi disimpan pada suhu -70°C.
Penyiapan Gel Agarosa
Pada penelitian ini digunakan agarosa 1% pada elektroforesis dengan
menimbang 250 mg agarosa dilarutkan dalam 25 mL 1X TBE (10 mL 1X TBE
yang telah dilarutkan dalam 100 mL aquabidest) kemudian dipanaskan di atas hot
plate sambil diaduk hingga mendidih menggunakan magnetic stirrer hingga larut
lalu ditambahkan 2,5 µL larutan nucleic acid gel stain dan diaduk hingga
homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel sebanyak 25 ml yang telah diberi
sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel
mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Agarosa dengan konsentrasi 1 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian isolat DNA, sedangkan untuk
mengidentifikasi hasil PCR menggunakan agarosa konsentrasi 1,5%.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Isolat DNA disiapkan sebanyak 4,0 µL, kemudian ditambahkan aqua pro
injection sebanyak 1,0 µL dan dicampurkan dengan loading dye sebanyak 1,0 µL.
Campuran tersebut diambil sejumlah 6 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-
sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA
ladder sebanyak 4,0 µL sebagai marker. Gel agarosa ditempatkan ke dalam gel
tray elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer 1X TBE, dilakukan
elektroforesis dengan tegangan 110 volt selama 45 menit. Molekul DNA pada gel
tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil
elektroforesis berupa gel agarosa dideteksi di bawah UV transilluminator dan
didokumentasikan menggunakan kamera. Panjang pita DNA dapat diketahui
dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi
pita DNA ladder.
Amplifikasi Alel CYP2A6*7
Fragmen DNA dari alel CYP2A6*7 dilakukan amplifikasi menggunakan
primer forward: 5'-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3', primer reverse: 5’-
AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ (Minematsu et al., 2006). Reaksi PCR
dilakukan dengan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix 12,5 μL,
primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA 5,0 µL, ditambahkan
dengan nuclease free water sampai volume akhir campuran 25,0 µL. Amplifikasi
dilakukan menggunakan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi
PCR yang telah dioptimasi oleh Tirtawamsa (2018) dan Karut (2018) yaitu: initial
denaturasi pada suhu 95°C (5 menit), dilanjutkan dengan denaturasi pada 95°C
(20 detik), kemudian annealing pada suhu 56,5°C (30 detik) dan ekstensi pada
suhu 72°C (30 detik). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan
selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.
Keberhasilan amplifikasi dapat dilihat dengan menggunakan fase diam agarosa
1,5% pada elektroforesis dan dievaluasi menggunakan lampu UV transilluminator
kemudian didokumentasikan menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Analisis Produk PCR
Hasil produk PCR dianalisis menggunakan teknik elektroforesis.
Sebanyak 5,0 µL hasil PCR ditambahkan loading dye sebanyak 1,0 µL, kemudian
diambil 6,0 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang ada pada gel
menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder
sebanyak 3,0 µL sebagai marker. Hasil produk PCR dielektroforesis
menggunakan agarosa 1,5% sebagai fase diam yang telah ditambahkan dengan
nucleic acid gel stain dan dievaluasi menggunakan lampu UV transilluminator
kemudian didokumentasikan menggunakan kamera. Produk PCR yang terbentuk
yaitu alel normal CYP2A6*1 dengan panjang pita 439 bp.
Analisis Hasil
Hasil yang akan dianalisis yaitu ada tidaknya alel CYP2A6*1 dan alel
CYP2A6*7, serta frekuensi kedua alel tersebut pada nonperokok ras kulit hitam
Papua dilihat dengan menggunakan elektroforesis. Bila hasil elektroforesis pada
panjang pita 439 bp, menunjukkan adanya alel CYP2A6*1 dan jika hasil
elektroforesis tidak terdeteksi menunjukkan adanya alel CYP2A6*7.
Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 dapat dihitung menggunakan
rumus sebagai berikut:
Frekuensi alel CYP2A6*1 =
Frekuensi alel CYP2A6*7 =
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi polimorfisme CYP2A6.
Terdapat tiga tahapan utama yang dimiliki yaitu analisis kualitatif isolat DNA,
amplifikasi alel CYP2A6*7 dan analisis hasil produk polymerase chain reaction
(PCR) menggunakan teknik elektroforesis. Polymerase chain reaction (PCR)
merupakan suatu proses penggandaan (amplifikasi) untaian basa-basa DNA yang
dibatasi dengan adanya pasangan primer pengapit. Proses ini menggunakan teknik
pengaturan suhu dan penggunaan enzim yang tahan terhadap suhu tinggi. Enzim
dan primer spesifik terhadap target yang akan diamplifikasi mempengaruhi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
keberhasilan metode PCR. Metode ini digunakan untuk mendeteksi polimorfisme
yang terjadi pada suatu gen (Maftuchah, et al., 2014).
Pemilihan Subjek Uji
Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 subjek nonperokok
yang terdiri dari 11 perempuan dan 19 laki-laki. Subjek uji yang digunakan
berasal dari ras kulit hitam Papua minimal sampai tiga generasi (kakek dan nenek
orang Papua asli), pernah terpapar asap rokok karena nitrosamin yang akan
dideteksi terdapat di dalam asap rokok, serta sehat jasmani dan rohani. Pada
penelitian ini subjek uji yang digunakan memiliki rata-rata usia 20 tahun dengan
syarat dapat mengerti tujuan, manfaat dan bersedia mengikuti penelitian ini, serta
dengan sadar mengisi inform consent. Menurut Manti dan Licari (2018), usia
lebih dari 18 tahun telah memenuhi syarat untuk mengikuti penelitian dan dapat
mengisi inform consent tanpa persetujuan dari pihak lain. Ukuran sampel
minimum menurut B-Rao (2001) dalam penelitian ini adalah 30 sampel yang
dapat dilihat pada lampiran (Lampiran 9).
Isolasi DNA dari Sampel Darah
Tahap isolasi DNA dari sampel darah pada penelitian ini bertujuan untuk
melisiskan sel karena DNA terdapat pada nukleus, denaturasi nukleoprotein, tahap
menonaktifkan nuklease dan enzim lainnya, menghilangkan kontaminan biologis
maupun kimia, dan mengendapkan DNA (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014).
Surzycki (2000) menyatakan bahwa dalam proses mengisolasi DNA, perlu
diperhatikan bahwa harus menghasilkan DNA tanpa mengandung kontaminan
seperti protein maupun RNA. Sampel darah akan diisolasi menggunakan FABG
buffer untuk proses melisiskan sel karena DNA terdapat di dalam nukleus.
Penambahan larutan buffer pada isolasi DNA berfungsi untuk mencegah
degradasi DNA atau kerusakan DNA oleh ion logam berat yang dapat
mempengaruhi hasil deteksi menggunakan gel elektroforesis (Chacon-Cortes and
Griffiths, 2014; Hearn and Arblaster, 2010; Handoyo and Rudiretna, 2001). DNA
yang telah dilisiskan kemudian diendapkan menggunakan etanol absolute (Hearn
and Arblaster, 2010). Proses pengendapan DNA bertujuan agar DNA yang telah
lisis tidak larut pada saat proses menghilangkan kontaminan dari DNA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
menggunakan W1 buffer dan wash buffer (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014).
DNA yang telah dicuci, dilarutkan menggunakan elution buffer yang juga dapat
berfungsi untuk menjaga agar DNA yang dihasilkan tidak mengalami kerusakan
(Chacon-Cortes and Griffiths, 2014) dan kemudian disimpan di dalam freezer
dengan suhu sekitar -70°C untuk penyimpanan yang lebih lama yaitu 5 tahun atau
lebih serta dapat menjaga untai DNA tidak mengalami kerusakan pada saat
penyimpanan (Surzycki, 2000). Kemurnian hasil isolasi DNA dapat dilihat secara
kualitatif dengan menggunakan teknik elektroforesis.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Penelitian ini menggunakan isolat DNA yang berasal dari sampel darah
populasi nonperokok ras kulit hitam Papua. Proses analisis kemurnian isolat DNA
menggunakan elektroforesis dengan fase diam gel agarosa 1,0% (Arbeli and
Fuentes, 2007). Menurut Patramurti et al. (2014), molekul DNA yang memiliki
pita berukuran lebih dari 3000 bp serta menghasilkan pita tebal dan tunggal,
menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan murni, tidak terdegradasi dan
tidak tercemar. Apabila terbentuk pita ganda dan tipis menunjukkan bahwa isolat
yang digunakan sudah tercemar atau terdegradasi (Patramurti et al., 2014). Hasil
elektroforesis isolat DNA dapat dilihat menggunakan lampu UV transilluminator.
Pada hasil elektroforesis yang telah dilakukan menunjukkan terbentuknya pita
tunggal yang tebal dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1). Pita tunggal
menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan dalam keadaan murni dan tidak
terkontaminasi, terbentuknya pita yang tipis disebabkan karena konsentrasi isolat
DNA yang kecil. Kualitas dan kemurnian DNA yang diekstraksi merupakan
faktor penting dalam analisis PCR, sehingga DNA yang diperoleh dari proses
isolasi harus sangat murni bebas dari kontaminan-kontaminan yang dapat
menghambat kinerja analisis PCR (Tan and Yiap, 2009). Berdasarkan hasil
analisis kemurnian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa isolat DNA yang
dihasilkan murni dan terbebas dari kontaminan. Oleh karena itu, proses PCR yang
akan dilakukan tidak terhambat dan terganggu oleh kontaminan, sehingga hasil
yang didapatkan dari penelitian ini akurat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan elektroforesis
Keterangan:
M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker
5, 10, 15, 20, 25 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarosa 1%; fase gerak larutan TBE 1X;
kecepatan 110 V/cm; total volume injeksi 6 µL
Amplifikasi Alel CYP2A6*7
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel
CYP2A6*7 menggunakan metode PCR (Minematsu et al., 2006). Pada proses
PCR, kondisi tiap-tiap tahap PCR yang diadopsi dari penelitian Tirtawamsa
(2018) dan Karut (2018) yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit
dilanjutkan dengan denaturasi pada 95°C selama 20 detik, annealing pada suhu
56,5°C selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus
amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan selanjutnya diakhiri dengan
final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.
Tahap denaturasi merupakan tahap awal dalam melakukan proses PCR.
Proses denaturasi dilakukan pada suhu tinggi yaitu 95°C untuk memisahkan dua
untai DNA dengan cara mengganggu ikatan hidrogen dan interaksi susunan basa
yang menyatukan untai DNA menggunakan suhu tinggi, sehingga DNA beruntai
ganda akan menjadi untai DNA tunggal (Kadri, 2014; Handoyo and Rudiretna,
2001). DNA beruntai ganda yang telah terpisah, kemudian mengalami penurunan
suhu pada tahap annealing untuk memungkinkan primer yang digunakan dalam
proses amplifikasi terpasang pada daerah komplementer dari cetakan DNA
beruntai tunggal. Primer yang telah melekat pada untai tunggal DNA yang
Isolat DNA 3000 bp 10000 bp
bp
M 5 10 15 20 25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
diinginkan, digunakan untuk membuat salinan DNA yang identik (Joshi, 2010).
Primer dalam reaksi PCR berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang
akan diamplifikasi sehingga diperlukan primer yang spesifik sehingga dapat
membentuk DNA sesuai yang diinginkan (Kalendar et al., 2011; McPherson and
Moller, 2006). Menurut Lorenz (2012), primer yang baik yaitu spesifik dan tidak
menempel pada organisme lain. Primer yang baik mengandung 18-30 basa
nukleotida, spesifisitas primer rendah apabila panjang primer kurang dari 18 basa.
Panjang primer lebih dari 30 basa tidak mempengaruhi peningkatan spesifisitas
primer secara bermakna. Kandungan basa nukleotida G dan C dalam suatu primer
sebesar 40-60% sebab apabila primer dengan % G dan C rendah diperkirakan
tidak mampu menempel secara efektif pada DNA cetakan sehingga dapat
menurunkan efisiensi proses PCR. Pada urutan nukleotida ujung 3’ harus
mengandung G atau C yang berperan dalam proses pengikatan primer dengan
DNA cetakan dan menghindari terjadinya mismatch.
Pada penelitian ini, digunakan primer yang diadopsi dari penelitian
Minematsu et al. (2006) yang dapat mengamplifikasi CYP2A6*1 yaitu primer
forward: 5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3’ dan primer reverse: 5’-
AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ yang akan menempel pada exon ke-9
pada CYP2A6*1. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1 dapat dilihat
pada gambar 2.
Alel CYP2A6*1
Primer forward
5’ 3’
CTCCCAGTCACCTAAGGACAT TTTTACCCGTACTTGCGGG
GAGGGTCAGTGGATTCCTGTA AAAATGGGCATGAACGCCC
5’ 3’
Primer reverse
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1
Keterangan:
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse
Tahap terakhir pada proses PCR yaitu tahap ekstensi. Tahap ekstensi
merupakan tahap memperpanjang untai DNA baru, dimulai dari posisi primer
yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target. Proses
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
memperpanjang untai DNA dilakukan oleh Taq polymerase. Taq polymerase
memiliki kecepatan penyusunan nukleotida pada suhu 72°C yaitu sekitar 35-100
basa nukleotida/detik, sehingga untuk produk PCR dengan panjang 1000 pasang
basa, waktu 30 detik merupakan waktu yang tepat untuk tahap perpanjangan
primer. Pada akhir ekstensi, dilakukan penambahan waktu 5 menit untuk
memastikan seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Tahap-
tahap PCR dapat diulangi sebanyak 35 siklus sehingga pada akhir siklus
amplifikasi akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang
merupakan hasil polimerase dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan
dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan.
Tahap amplifikasi pada penelitian ini menghasilkan produk PCR berupa
fragmen DNA berukuran 439 bp yang merupakan produk dari alel CYP2A6*1.
Pada gambar 3 ditunjukan potongan urutan basa nukleotida CYP2A6*1 yang
diadopsi dari Gen Bank. Pada gen alel CYP2A6*7 terjadi perbedaan satu basa
dengan gen alel CYP2A6*1 yaitu basa T (timin) menjadi C (sitosin) pada exon 9
menyebabkan penurunan fungsi alel (Mwenifumbo et al., 2005). Perbedaan satu
basa ini terjadi pada urutan basa primer forward gen alel CYP2A6*1 ke-21
menyebabkan primer tidak dapat menempel pada DNA target sehingga produk
yang diharapkan tidak dapat terbentuk akibat proses amplifikasi tidak
berlangsung. Perbedaan yang terjadi dapat dilihat dengan mencocokkan potongan
alel normal CYP2A6*1 menurut Gen Bank dengan urutan basa CYP2A6*7
menurut Minematsu et al. (2006) yang dapat dilihat pada gambar 3. Selain primer
forward, terdapat primer reverse yang hanya dapat digunakan untuk
mengamplifikasi gen alel CYP2A6*1 sehingga produk yang diharapkan terbentuk
yaitu hanya produk CYP2A6*1. Hal ini dapat membantu dalam menentukan
frekuensi keberadaan alel gen CYP2A6*7 pada isolat DNA ras kulit hitam Papua.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
A. CTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTT B. CTCCCAGTCACCTAAGGACACTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTT
A. TGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGC B. TGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGC
A. GAGGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGA B. GAGGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGA
A. CCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGA B. CCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGA
A. AAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGCGGCT B. AAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGCGGCT
A. CAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAA B. CAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAA
A. CCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTC B. CCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTC
A. CTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCACGCT B. CTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCACGCT
A. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT
B. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7
(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan abu-abu, primer
ditunjukkan oleh warna merah)
Keterangan:
A. : Potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank
B. : Urutan basa CYP2A6*7 menurut Minematsu et al. (2006)
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis
Produk PCR hasil amplifikasi alel CYP2A6*1 dalam mengidentifikasi
alel CYP2A6*7 dilihat menggunakan teknik elektroforesis dengan gel agarosa
1,5% dan didokumentasikan menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3.
Produk PCR yang didapatkan yaitu berukuran 439 bp dari 30 sampel isolat DNA
ras kulit hitam Papua (Gambar 4). Pita yang terbentuk pada ukuran 439 bp
menunjukkan terbentuknya alel aktif yaitu CYP2A6*1 dengan frekuensi 100%
dari 30 sampel (Tabel 1).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat
DNA
Keterangan:
M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker
1-7 : Produk PCR dari isolat DNA yang berbeda
Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE
1X; kecepatan 110 V/cm; volume injeksi 6 µL
Tabel 1. Frekuensi Alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7
Alel Jumlah Frekuensi (%)
CYP2A6*1/CYP2A6*1 30 100
CYP2A6*1/CYP2A6*7 0 0
Fujieda (2004) dan Tanner et al. (2018) mengatakan bahwa individu
yang memiliki alel CYP2A6*7 akan mengalami penurunan aktivitas enzim dalam
mengaktivasi nitrosamin, sehingga nitrosamin tidak berubah menjadi karsinogenik
yang dapat menyebabkan risiko kanker. Pada gambar 4 menunjukkan hasil yaitu
sebanyak 30 sampel nonperokok ras kulit hitam Papua tidak memiliki alel
CYP2A6*7 namun memiliki alel CYP2A6*1 yang memiliki aktivitas enzim
normal dalam memetabolisme nitrosamin menjadi karsinogenik, sehingga
individu tersebut kemungkinan berisiko terkena kanker. Hasil amplifikasi pada
gambar 4 memperlihatkan terbentuknya 2 pita yaitu pita pertama berukuran 439
bp merupakan produk CYP2A6*1, sedangkan pita kedua berukuran 398 bp. Pita
kedua dimungkinkan merupakan produk yang dapat dikode oleh primer yang
digunakan pada penelitian ini. Hasil tersebut dapat diduga bahwa primer yang
M 7 1 2 3 4 6 5
250 bp
500 bp
Pita 2 berukuran
398 bp
10000 bp
Pita 1 berukuran
439 bp
(CYP2A6*1)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
digunakan pada penelitian ini tidak mengkode secara spesifik pada CYP2A6*1,
namun dapat mengkode CYP yang lain.
Enzim CYP2A6 tidak hanya bertanggung jawab memetabolisme
nitrosamin namun dapat juga memetabolisme senyawa obat (Raunio et al., 2001).
Hubungan yang ditunjukkan antara polimorfisme gen dengan penggunaan obat
dalam terapi suatu penyakit tertentu sangat erat. Pada studi metabolisme obat yang
dilakukan oleh Endo et al., (2007), ditemukan bahwa metabolisme pilokarpin
menjadi 3-hydroxypilocarpine diperantarai oleh enzim CYP2A6, sehingga apabila
terjadi polimorfisme pada gen CYP2A6 yaitu CYP2A6*7 dapat menurunkan
aktivitas enzim dalam memetabolisme obat menyebabkan efek terapi yang
diharapkan tidak tercapai (Sumirtanurdin et al., 2019; Tanner et al., 2018; Park et
al., 2011). Selain pilokarpin, terdapat beberapa obat yang proses metabolismenya
diperantarai oleh CYP2A6 yaitu asam valproat, efavirenz, letrozole dan tegafur
(Tabel 2).
Tabel 2. Efek polimorfi gen CYP2A6 pada beberapa obat
Jenis
Alel Nama Obat Efek Pustaka
*4 Asam
Valproat
Terjadi penurunan kecepatan proses
hidroksilasi asam valproat menjadi 3-
OH asam valproat; 4-OH asam
valproat dan 5-OH asam valproat.
(Tanner and
Tyndale, 2017).
*9, *10,
*17, *19
Efavirenz Terjadi penurunan kecepatan proses
hidroksilasi efavirenz menjadi 7-OH-
efavirenz
(Tanner and
Tyndale, 2017;
McDonagh et
al., 2012).
*4, *4C,
*7 *11,
*18, *19
Tegafur Menurunkan bentuk aktif dari tegafur
(5-fluorourasil)
(Yamamiya et
al., 2014;
McDonagh et
al., 2012).
*4, *7,
*9, *10,
Letrozole Menurunkan kecepatan pada proses
oksidasi letrosol menjadi karbinol
(McDonagh et
al., 2012).
Berdasarkan tabel 2, dapat dilihat bahwa polimorfisme CYP2A6 dapat
mempengaruhi nasib obat dan respon obat di dalam tubuh. Oleh karena itu perlu
dilakukan penggalian informasi terhadap CYP yang dimiliki oleh pasien agar
mencapai target terapi yang diharapkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
KESIMPULAN
Penelitian ini bertujuan untuk melihat keberadaan dan frekuensi gen
sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) alel *7 pada isolat DNA nonperokok ras kulit
hitam Papua. Hasil yang didapatkan yaitu tidak ditemukan isolat DNA yang
memiliki alel CYP2A6*7 atau memiliki frekuensi 0% pada nonperokok ras kulit
hitam Papua di Indonesia.
SARAN
1. Dilakukan penelitian identifikasi alel lain yang diduga dapat mempengaruhi
tingkat risiko terkena kanker pada ras kulit hitam Papua selain perokok
maupun nonperokok seperti CYP2A6*8, CYP2A6*10, dan CYP2A6* 11.
2. Dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi alel CYP2A6*7 pada
nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia, dengan kriteria subjek uji yang
berbeda seperti sedang mengalami penyakit tertentu.
3. Dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap pita 2 yang terbentuk pada produk
amplifikasi penelitian ini dengan menggunakan primer yang sama untuk
melihat sub family sitokrom P450 (CYP) yang dikode oleh primer tersebut
pada ukuran 398 bp.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
DAFTAR PUSTAKA
Arbeli, Z., Fuentes, C.L., 2007. Improved Purification and PCR Amplification of
DNA from Environmental Samples. Federation of European
Microbiological Societies (FEMS) Microbiological Letters, 272, 269-
275.
Ashley, D.L., O’Connor, R.J., Bernert, J., Watson, C.H., Polzin, G.M., 2010.
Effect of Differing Levels of Tobacco-Specific Nitrosamines in Cigarette
Smoke on the Levels of Biomarkers in Smokers. Cancer Epidemiology
Biomarkers and Prevention, 19, 1389–1398.
B-rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.
Human Heredity, 52, 191–200.
Chacon-Cortes, D., Griffiths, L.R., 2014. Methods for Extracting Genomic DNA
from Whole Blood Samples: Current Perspectives. Journal of
Biorepository Science for Applied Medicine, 2, 1-9.
Chiang, H., Wang, C., Lee, H., Tsou, T., 2011. Metabolic effects of CYP2A6 and
CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)-
induced gene mutation. A mammalian cell-based mutagenesis approach.
Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2), 145–152.
Dede, C., dan Cinar, N., 2016. Environmental Tobacco Smoke and Children’s
Health. Iranian Journal of Pediatrics, 26(5), 4–5.
Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M.A., Dosaka-akita,
H., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., Kamataki, T., 2004.
Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of
smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese
smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451–2458.
Handoyo, D., Rudiretna, A., 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(10), 17-29.
Hearn, R.P., Arblaster, K.E., 2010. DNA Extraction Techniques for Use in
Education. Biochemistry Molecular Biology Education, 38(3), 161-166.
IARC, 2007. IARC Monographs On The Evaluation Of Carcinogenic Risks To
Humans; “Smokeless Tobacco And Some Tobacco-Specific N-
Nitrosamines”. World Health Organization International Agency For
Research On Cancer. Volume 89.
Jordjevic, N.D., Arrillo, J.A.C., Roek, M.P.J.V.D.B., Ishikawa, J.K., Oh, H.R.,
Ertilsson, L.B., Klillu, E.A., 2013. Comparisons of CYP2A6 Genotype
and Enzyme Activity between Swedes and Koreans. Japanese Society for
the Study of Xenobiotics, 28(2), 93-97.
Joshi, M., dan D, Deshpande J. 2011. Polymerase Chain Reaction; Methods,
Principles and Application. International Journal of Biomedical
Research, 5, 81-97.
Kadlubar, S., Anderson, J.P., Sweeney, C., Gross, M.D., Lang, N.P., Kadlubar,
F.F., Anderson, K.E., 2009. Phenotypic CYP2A6 Variation and the Risk
of Pancreatic Cancer. Journal of the Pancreas, 10(3), 263–270.
Kalendar, R., Lee, D., Schulman, A.H., 2011. Java Web Tools for PCR, in silico
PCR, and Oligonucleotide Assembly and Analysis. Elsevier Genomics,
38, 137-144.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Karki, R., Pandya, D., Elston, R.C., Ferlini, C., 2015. Defining “mutation” and “
polymorphism” in the era of personal genomics. BMC Medical
Genomics, 8, 1–7.
Karut, A.K., 2018. Identifikasi Gen CYP2A6 Alel *7 pada Isolat DNA Perokok
Suku Tionghoa di Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction.
Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, 1-16.
Liu, T., David, S.P., Tyndale, R.F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y.-H., Yu,
X.-Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X.-Z., Chen, W.-Q., 2011.
Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern
China. National Institute of Health Public Access, 106(5), 985-994.
López-Flores, L.A., Pérez-Rubio, G., Falfán-Valencia, R., 2017. Distribution of
Polymorphic Variants of CYP2A6 and Their Involvement in Nicotine
Addiction. Experimental and Clinical Sciences Journal, 16, 174-196.
Lorenz, T.C., 2012. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus
Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized
Experiment, 63, 1-15.
Maftuchah, Winaya, A., Zainudin, A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi
Molekuler. Deepublish Publisher, Sleman.
Manti, S., Licari, A., 2018. How to Obtain Informed Consent for Research.
Breathe, 14(2), 145-152.
McDonagh, E.M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B.,
Whirl-Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB Summary – Very
Important Pharmacogene Information for Cytochrome p-450, Family 2,
Subfamily A, polypeptide 6 (CYP2A6). National Institutes of Health
Public Access Pharmacogenet Genomics, 22(9), 695-708.
McPherson, M.J., Moller, S.G., 2006. PCR. 2nd
Edition. New York: Taylor &
Francis, 305.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., 2006.
Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4, *7 and *9
polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.
Mwenifumbo, J.C., Myers, M.G., Wall, T.L., Lin, S., Sellers, E.M., Tyndale, R.F.,
2005. Ethnic variation in CYP2A6*7, CYP2A6*8 and CYP2A6*10 as
assessed with a novel haplotyping method. Pharmacogenetics and
Genomics, 15(3), 189–192.
Nakajima, M., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,
Kwon, J.-T., McLeod, H.L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive evaluation
of variability in nicotine metabolism and CYP2A6 polymorphic alleles in
four world populations. Kanazawa University Repository for Academic
resources, 1-33.
Park, S.R., Kong, S.Y., Nam, B.H., Choi, I., Kim, C.G., Lee, J.Y., Cho, S.J., Kim,
Y.W., Ryu, K.W., Lee, J.H., Rhee, J., Park, Y.I., Kim, N.K., 2011.
CYP2A6 and ERCCI Polymorphisms Correlate with Efficacy of S-I plus
Cisplatin in Metastatic Gastric Cancer Patients. British Journal of
Cancer, 104, 1126-1134.
Patramurti, C., Nurrochmad, A., Martono, S., Science, P., Mada, G., Chemistry,
P., 2014. Polymorphism Of Cytochrome P450 2a6 (Cyp2a6*1 And
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Cyp2a6*4) Among Javanese Indonesian Smoker And Non Smoker.
Indonesian Journals of Pharmacy, 26(1), 11–19.
PharmVar, 2012. CYP2A6. https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6, diakses
pada tanggal 14 April 2019 pukul 17.45 WIB.
Raunio, H., Rautio, A., Gullstén, H., Pelkonen, O., 2001. Polymorphisms of
CYP2A6 and its Practical Consequences. British Journal of Clinical
Pharmacology, 52(4), 357-363.
Schroeder, S.A., Warner, K.E., 2010. Don’t Forget Tobacco. The England Journal
of Medicine, 201–204.
Stephenson, F.H., Abilock, M.C., 2014. PCR Optimization.
Sumirtanurdin, R., Thalib, A.Y., Cantona, K., Abdulah, R., 2019. Effect of
Genetic Polymorphisms on Alzheimer’s Disease Treatment Outcomes;
An Update. Clinical Interventions in Aging, 14, 631-642.
Surzycki, S., 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, New York.
Tan, S.C., Yiap, B.C., 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and
The Present.. Journal of Biomedicine Biotechnology, 1-10.
Tanner, J.-A., Henderson, J.A., Buchwald, D., Howard, B. V., Henderson, P.N.,
Tyndale, R.F., 2018. Variation in CYP2A6 and nicotine metabolism
among two American Indian tribal groups differing in smoking patterns
and risk for tobacco-related cancer. HHS Public Access Pharmacogenet
Genomics, 27(5), 169–178.
Tirtawamsa, G.A., 2018. Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *7
Pada Isolat DNA Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia dengan
Metode Polymerase Chain Reaction. Skripsi. Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, 1-12.
Wassenaar, C.A., 2015. Variation in Nicotine and Nitrosamine Pharmacology
Genes and Smoking-Associated Lung Cancer by Smoking-Associated
Lung Cancer. Department of Pharmacology and Toxicology University of
Toronto, 27-40.
Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of Cancer Induction by Tobacco-
Specific NNK and NNN. Journal of Cancers, 6, 1138–1156.
Yamamiya, I., Kunihiro, Y., Ishii, Y., Yamada, H., Chiba, M., 2014. Effect of
CYP2A6 Genetic Polymorphism on the Metabolic Conversion of
Tegafur to 5-Fluorouracil and Its Enantioselectivity. American Society
for Pharmacology and Experimental Therapeutics (ASPET) Journal, 42,
1485-1492.
Yusuf, Z.K., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), 1-6.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certification of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 4. Usage information of FavorPrepTM
Blood Genomic DNA Extraction
Mini Kit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 5. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 7. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA
M 1 2 3 4 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 8. Elektroforegram Hasil PCR
1 2 3 4 5 6 7 M M 8 9 10 14
11 13 12 14
15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28
29 30
M
M M 29 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sampel
Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal
pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:
Nmin ≥ log (1 – π)/2log (1 – fmin)
Keterangan:
Nmin : Jumlah sampel minimal
π : probabilitas alel utama
fmin : frekuensi alel minor
Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:
CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*7 (alel minor). Maka menurut B-Rao
(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =
0,95 dan fmin = 0,05.
Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:
Nmin = log (1 – π)/2log (1 – fmin)
= log (1 – 0,95)/2log (1-0,05)
= 28,89
= 29 orang
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang.
Jumlah tersebut sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik
polimorfisme.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 10. Data Subjek
Subjek Genotip Tingkat risiko kanker
1p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
2p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
3p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
4p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
5p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
6p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
7p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
8p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
9p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
10p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
11p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
12p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
13p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
14p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
15p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
16p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
17p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
18p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
19p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
20p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
21p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
22p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
23p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
24p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
25p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
26p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
27p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
28p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
29p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
30p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 11. Formulir Kuisisoner Subjek Uji
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 12. Frekuensi Alel
Frekuensi alel CYP2A6*1 =
=
= 100%
Frekuensi alel CYP2A6*7 =
=
= 0%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Natasya Nora Rubiyo, lahir di
Merauke pada tanggal 25 November 1998 dan merupakan
anak ketiga dari pasangan Eddi Mulariman Rubiyo dan Judith
Yemima Pepiana. Pendidikan formal yang telah ditempuh
oleh penulis yaitu mulai dari TK St. Bernadeta (2002-2004),
melanjutkan ke tingkat sekolah dasar di SD YPPK St.
Fransiskus Xaverius 2 Merauke (2004-2010), tingkat sekolah
menengah pertama di SMP Negeri 2 Merauke (2010-2013), dan tingkat sekolah
menengah atas di SMA Stella Duce 2 Yogyakarta (2013-2016). Pada tahun 2016,
penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang perguruan tinggi di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam
kepanitiaan Pelepasan Wisuda tahun 2016 dan Pelepasan Wisuda tahun 2017
sebagai anggota seksi PDD, sebagai koordinator seksi dalam kegiatan kepanitiaan
TITRASI 2017, serta sebagai anggota seksi dalam kegiatan kepanitiaan Latihan
Alam 1 PSM Cantus Firmus pada tahun 2018. Selain aktif dalam kegiatan
kepanitiaan, penulis juga mengikuti beberapa perlombaan dalam bidang seni yaitu
perlombaan Pekan Olahraga dan Seni Farmasi Indonesia (PORSFI) pada tahun
2017 sebagai juara 1 dan perlombaan Paduan Suara Gerejawi Mahasiswa
Nasional XV pada tahun 2018 dengan membawa mendali emas dan perak.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI