Download - Chapter 4_teknik Pemurnian Enzim
-
PEMURNIAN ENZIM
CHAPTER 4
-
TUJUAN PEMURNIAN ENZIM
Mempelajari enzim dan segala sifatnya
Untuk memproduksi antibodi spesifik
terhadap enzim tersebut
-
PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (1)
Tetapkan tujuan (langkah setelah mendapatkan enzim murni)
Tetapkan kemurnian enzim yang diperlukan
menentukan langkah dan teknik seleksi
Segera singkirkan bahan lain yang merusak enzim Misalnya protease
Kembangkan metoda analisis
Deteksi cepat aktivitas enzim untuk pemilihan
-
MENYINGKIRKAN BAHAN PERUSAK ENZIM
Metoda adsorpsi
Paling umum menggunakan kromatografi penukar ion
Kropmatografi afinitas (lebih mahal dan rumit) menghasilkan
penyingkiran bahan perusak dan pemurnian sekaligus
-
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
-
KROMATOGRAFI AFINITAS
Menggunakan ligan berupa molekul
kecil (logam atau antibodi) yang
terikat pada matriks
Protein akan berikatan secara
spesifik dengan ligan
Elusi melepaskan protein dari ligan
-
DETEKSI PROTEIN
Spektroskopi
A280 untuk protein
Assay Protein
Bradford (pewarna coomassie)
Biuret (tembaga)
Lowry (modifikasi biuret campuran fosfomolibdotungstatdireduksi oleh Cu2+ dan asam amino F,Y,W membentukheteropolimolibdenum yang berwarna biru (A750)
A550
-
ASSAY ENZIM
Amilum (berwarna biru dengan penambahan KI) dihidrolisismenjadi glukosa (berwarna kecoklatan dengan penambahan KI)
PNPP dihidrolisis menjadi PNP dan Pi Assay waktu tetap
Enzim dan substrat dicampur, direaksikan selamawaktu tertentu,
Reaksi dihentikan dengan basa kuat,
Konsentrasi PNP ditentukan pada pH>10 Assay berkelanjutan
Produksi PNP diikuti menggunakan spektrofotometripada ph 8
-
PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (2)
Gunakan teknik yang berbeda untuk setiap
langkah
Memanfaatkan watak sample yang dapat
digunakan untuk pemisahan (ukuran,
muatan, hidrofobisitas, spesifisitas terhadap
ligan)
-
SKEMA LANGKAH PEMURNIAN ENZIM
-
PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (3)
Minimalkan penanganan terhadap sample di setiap tahap Untuk mencegah prosedur berkepanjangan yang
dapat mengakibatkan hilangnya/menurunnya aktivitas
Minimalkan penggunaan bahan tambahan Bahan tambahan mungkin perlu dihilangkan
sehingga memerlukan tahap tambahan untuk menghilangkannya
Minimalkan jumlah tahap - SEDERHANAKAN Tambahan langkah mengurangi hasil dan
menambah waktu
-
PEMURNIAN PROTEIN
Strategi
Bahan awal,
Perolehan enzim, Purifikasi tengahan, Pemolesan
Metode deteksi, kuantifikasi dan dokumentasi
-
TEKNIK DASAR
Pemekatan (berdasar ukuran)
pengendapan
ultrafiltrasi
dialisis
sentrifugasi
Kromatografi (berdasar ukuran/muatan/kimia)
ion exchange
size exclusion
affinity
Elektroforesis
(berdasar ukuran/muatan)
"native"
denaturing
isoelectric focusing
2-dimensional
Imunologis
(berdasar ukuran/muatan/kimia)
kromatografi
in situ imaging
immunoblotting
-
PENGENDAPAN PROTEIN
"Salting Out" jika sejumlah garam ditambahkan, maka protein akan
mengendap
Suhu rendah mengurangi kemungkinan denaturasi
Dikumpulkan dengan filtrasi dan sentrifugasi
Disuspensikan kembali dalam larutan berkadar garam rendah.
Bekerja terbaik dengan anion divalen, seperti sulfat, amonium sulfat
berkelarutan tinggi sekalipun dalam es.
-
METODA MENINGKATKAN KONSENTRASI
Ultra Filtrasi: Suspensi protein dilewatkan
saringan ultra halus. Air dan garam dapat lewat,
protein tertinggal
-
PERTUKARAN LARUTAN PENYANGGA
Seluruh langkah pemurnian menggunakan larutan
penyangga dengan pH tertentu dan kekuatan
garam tertentu
Larutan penyangga yang digunakan
mempengaruhi sifat biofisika protein
Kenapa perlu ditukar? Contoh, jika protein diendapkan menggunakan amonium sulfat,
jelas lingkungan protein itu penuh/jenuh garam.
-
METODA MENGHILANGKAN GARAM
Dialisis: Suspensi protein yang mengandung garam
dimasukkan kantong dialisis yang memiliki pori ultra
halus. Air (yang melarutkan garam) bebas melalui pori,
sedangkan protein tertinggal
-
BAHAN AWAL
Sumber alami atau hasil rekayasa
Inang,
Bakteri, khamir, tumbuhan, hewan transgenik
Konsentrasi (jumlah), senyawa ikutan
-
BAHAN AWAL
Prosedur lisis dan klarifikasi
Kondisi alami atau terdenaturasi
Lokasi subseluler
Pengendapan selektif
PEI, Streptomicin Sulfat, CTAB untuk RNA/DNA
Amonium Sulfat untuk Protein
-
PEROLEHAN ENZIM
Segera hilangkan kontaminan yang sifatnya sangat merusak enzim
Metoda pemekatan dan penyerapan Paling umum menggunakan Ion Exchange Kromatografi afinitas merupakan kombinasi langkah-
langkah perolehan enzim, pemurnian tengahan, danpemolesan
Pada tahap ini kontaminan paling merusak dihilangkan
-
PREPARASI ENZIM
Untuk kepentingan riset, enzim mungkin perludimurnikan berkali-kali dengan resiko terjadikehilangan yang cukup besar (hingga 90 %).
Enzim untuk kepentingan industri sedapat mungkindicegah dari kehilangan, sehingga sesedikitmungkin dilakukan pemurnian hanya untukmenghilangkan senyawa yang mengganggu proses.
Selain dapat menghilangkan enzim, langkahpurifikasi juga terkait dengan beaya (alat dantenaga).
-
Fraksi Volume (ml)
Total
protein (mg)
Aktivitas
Total
Aktivitas Spesifik
Perolehan kembali (%)
Tingkat Pemurnian
Extrak kasar
3,800 22,800 2460 0.108 100 0
Garam ppt.
165 2,800 1190 0.425 48 3.9
IEC 65 100 720 7.2 29 66
SEC 40 14.5 555 38.3 23 355
Afinitas 6 1.8 275 152 11 1407
Pengaruh jumlah langkah pemurnian enzim terhadap hasil dan beaya
-
SEE U NEXT.........