Download - BAB III Metode Penelitian

7/15/2019 BAB III Metode Penelitian

http://slidepdf.com/reader/full/bab-iii-metode-penelitian-56327fad55680 1/12

16

3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-April 2012. Penelitian

analisis komposisi kimia dan pembuatan bioetanol buah lindur dilakukan di

Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi

Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, penelitian histologi buah lindur dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas

Kedokteran Hewan, Intitut Pertanian Bogor dan pengujian kadar bioetanol di

Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari bahan utama,

yaitu dari buah lindur ( B. gymnorrhiza) yang diperoleh dari Pulau Kaya, Kota

Tual, Kabupaten Maluku Tenggara dan bahan untuk perhitungan proksimat misalakuades, HCl, NaOH, katalis selenium, H2SO4, H3BO3 dan pelarut heksana.

Bahan untuk pembuatan bioetanol adalah gula pasir, HCl, NaOH, pupuk NPK

(Natrium, Posfor, Kalium), pupuk ZA ( zwavelzuur ammonia), isolat

Saccharomyces cerevisiae, PDA ( Potato Dextrose Agar ), PDB ( Potato Dextrose

Broth). Sedangkan bahan – bahan yang digunakan untuk pewarnaan preparat adalah

parafin, xylol, toluidine blue, etanol, larutan seri Johansen, FAA.

Alat-alat yang digunakan antara lain mikroskop merk Olympus BH-2,

kromatografi gas SupelcoTM 37 Component FAME Mix, beker glass 2 L, kompor

listrik, alat pengaduk, timbangan digital, pH meter, gelas ukur 100 ml, saringan,

spatula, pipet volumetrik, piknometer, selang (d=3 mm), toples kaca 300 ml,

alumunium foil, jarum ose, blender, parutan kelapa, pisau, plastik, baskom,

inkubator, autoclave, thermometer, cawan porselen, oven, desikator, tabung

reaksi, gelas erlenmeyer, tabung Kjeldahl, tabung soxhlet , buret, mortar, tanur,

kertas saring, homogenizer , botol vial, waterbath, dan syringe.



17

3.3 Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimen di Laboratorium sesuai

dengan prosedur kerja. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian

pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi karakterisasi

bahan baku (buah lindur), analisis histologi, uji proksimat, pembuatan starter

(regenerasi kultur dan starter media cair), pembuatan media fermentasi,

penambahan nutrient , pengaturan pH dan pasteurisasi. Penelitian utama meliputi

pembuatan bioetanol, yaitu fermentasi alkohol, pelakuan inkubasi, dan pengujian

(uji pH akhir dan uji kadar etanol).

3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel

Penelitian ini diawali dengan pengambilan dan preparasi sampel buah

lindur ( B. gymnorrhiza). Buah lindur ditemukan di daerah mangrove dan banyak

terkena sinar matahari. Setelah sampel buah lindur diperoleh kemudian dibawa

dengan cool box hingga ke laboratorium kemudian dicuci dengan air bersih untuk

menghilangkan benda asing yg menempel lalu dikeringkan di bawah sinar

matahari.

3.3.2 Pembuatan preparat dengan metode parafin dan pengamatan

Pengamatan jaringan tanaman diawali dengan pembuatan preparat

tanaman lindur ( B. gymnorrhiza) kemudian pengambilan gambar objek pada

mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode parafin. Tahapannya

terdiri atas fiksasi, pencucian, dehidrasi dan penjernihan, infiltrasi, pemurnian

dalam blok, penyayatan, perekatan, dan pewarnaan. Bagian tanaman lindur yang

diambil adalah daun, batang dan daun.

Fiksasi dilakukan selama >24 jam (5 hari) dalam larutan FAA, setelah itu

larutan fiksasi dibuang dan sampel dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 kali

dengan waktu penggantian masing-masing selama 30 menit. Kemudian

didehidrasi dan dijernihkan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan

seri Johansen pada suhu ruang. Proses infiltrasi dimulai dari perendaman sampel

dalam TBA dengan minyak parafin dengan perbandingan 1 : 1 dan 1/3 parafin

beku dan disimpan pada suhu ruang selama 4 jam yang dilanjutkan pengovenan

pada suhu 58 oC selama 18 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 5 jam sekali

sebanyak 4 kali.



18

Proses penanaman dilakukan dengan cara sampel dari tahap infiltrasi

dimasukkan ke dalam blok kotak yang berisi parafin cair dan disimpan pada suhu

ruang hingga benar-benar membeku. Proses penyayatan dilakukan dengan

menggunakan mikrotom putar setebal 10 µm. Blok parafin terlebih dahulu

dipotong dan dirapihkan kemudian ditempelkan pada holder lalu disayat. Hasil

sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi albumin-gliserida dan

ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot plate dengan

suhu 45 oC selama 3-5 jam. Pewarnaan dilakukan dengan toluidin blue.

Proses selanjutnya adalah penutupan dengan pemberian entellen atau

canada balsam pada gelas objek dan ditutupi dengan gelas penutup. Proses

pengambilan gambar dilakukan dengan mikroskop cahaya. Diagram alir

pembuatan preparat dengan metode parafin, pewarnaan dan pengamatan disajikan

pada Gambar 5.

Tumbuhan Lindur

(daun, batang dan buah)

Pewarnaan

Pengamatan dengan mikroskop

Pemotongan dengan panjang 2 cm dan tebal 0,1 mm

Fiksasi FAA

Pencucian dengan etanol

Infiltrasi dengan parafin

Penanaman dalam parafin

Penyayatan blok parafin

Perekatan dengan gelas objek



19

Gambar 5 Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin.

3.3.3 Analisis Proksimat

Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk

mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat

dilakukan untuk mengetahui kandungan gizi secara kasar (crude) yang meliputi

kadar air dengan menggunakan metode oven (AOAC 2005), kadar abu dengan

menggunakan tanur (AOAC 2005), protein dengan menggunakan metode kjeldahl

(AOAC 2005) dan lemak dengan menggunakan metode sokhlet (AOAC 2005).

a. Analisis Kadar air (AOAC 2005)

Kadar air dalam suatu bahan dapat diukur dengan berbagai cara. Metode

pengukuran kadar air yang umum digunakan di laboratorium adalah dengan cara

pengovenan atau destilasi. Tahap pertama yang dilakukan adalah mengeringkan

cawan porselen pada suhu 102-105 oC selama 30 menit. Cawan tersebut

diletakkan dalam desikator kurang lebih 30 menit hingga dingin kemudian

ditimbang. Sampel buah lindur ditimbang sebanyak 1-2 gram setelah terlebih

dahulu dipotong kecil-kecil, lalu dihomogenkan. Sampel yang telah

dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Cawan porselen beserta

sampel ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Setelah 6 jam

cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator hingga dingin kemudian ditimbang

bobotnya.

Rumus

Keterangan: A = Berat cawan porselen kosong (gram)

B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum dioven

C = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) setelah dioven

b. Analisis Kadar Abu (AOAC 2005)

Analisis kadar abu dilakukan dengan mengabukan sampel di dalam tanur.

Tahap pertama cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit



20

dengan suhu 105 oC, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang.

Sampel buah lindur sebanyak 1-2 gram yang telah dipotong kecil-kecil

dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan porselen beserta sampel buah

lindur didalamnya dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu 105 oC sampai

tidak berasap. Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu

600 oC selama 2-3 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih.

Setelah itu cawan abu porelin didinginkan dalam desikator selam 30 menit,

kemudian ditimbang bobotnya.

Perhitungan kadar abu:

Keterangan: A = Berat cawan porselen kosong (gram)

B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum ditanur

C = Berat cawan porselen dengansampel (gram) setelah ditanur

c. Analisis Kadar Protein (AOAC 2005)

Tahap – tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap

yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. Pertama –

tama, sampel dimasukkan sebanyak 0,1 gram ke dalam tabung kjelhdal. Selanjutnya ditambahkan selenium dan 3 ml

H2SO4 ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan

ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 0C. Proses dekstruksi dilakukan sampai

larutan berwarna bening (Tahap destruksi). Selanjutnya isi labu dituangkan ke

dalam labu destilasi, lalu ditambahkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan

larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor

ditampung dalam Erlenmeyer 125 ml berisi larutan H3BO3 indikator yang ada di

bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang

bercampur dengan H3BO3 indikator dalam erlenmeyer (Tahap destilasi). Terakhir

dilakukan titrasi dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan

Erlenmeyer berubah menjadi pink. Kadar protein ditentukan dengan rumus:



21

Keterangan:

fp = Faktor pengenceran = 10

fk = Faktor konversi = 6,25

d. Analisis Kadar Lemak (AOAC 2005)

Lemak adalah senyawa yag larut dalam pelarut non polar. Sifat kelarutan

lemak sangat tergantung pada strukturnya. Metode yang sering digunakan di

Laboratorium adalah metode ekstraksi soxhlet, yakni secara langsung

mengekstraksi lemak dari bahan degan pelarut organik non polar, misal heksana,

petroleum eter, dan dietil eter. Mula – mula sampel seberat 5 gram (W1)

dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak,

kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya

(W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan

ke dalam ruang reaktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung

ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 oC

dengan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak

didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan

tertampung diruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke

dalam labu lemak, selanjutnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 oC,

setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).

Perhitungan kadar lemak yaitu :

% Kadar lemak =

Keterangan: W1 = berat sampel (g)

W2 = berat labu lemak tanpa lemak (g)

W3 = berat labu lemak dengan lemak (g)

e. Analisis Karbohidrat (AOAC 2005)

Pengukuran kadar karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil

pengurangan dari 100% dari penjumlahan kadar air, kadar abu, kadar protein, dan

kadar lemak sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangan. Hal

ini karena karbohidrat sangat berpengaruh terhadap zat gizi lainnya.

Kadar karbohidrat dapat dihitung dengan mengunakan rumus:



22

[

[

3.3.4 Pembuatan starter (Fardiaz 1992)

Pembuatan starter untuk fermentasi diantaranya melalui proses regenerasi

kultur dan starter pada media cair. Metode regenerasi kultur yang digunakan untuk

menumbuhkan khamir atau S. cerevei adalah pada PDA ( Potato Dextrose Agar )

dengan metode tebar. Isolat S. cerevei dimasukkan ke dalam agar miring. PDA

( Potato Dextrose Agar ) sebanyak 10 ml dengan cara ditebar dipermukaan media

PDA ( Potato Dextrose Agar ) sebanyak 3-5 jarum ose dan dibiakkan dalam

inkubator selama ± 48 jam dengan kondisi aerobik pada suhu 25-30 oC. Setelah

itu, biakan pada PDA ( Potato Dextrose Agar ) diinokulasi sebayak 5 jarum ose ke

dalam PDB ( Potato Dextrose Broth) 100 ml, kemudian diinkubasi selama ± 48

jam dengan kondisi aerobik pada suhu 25-30 oC. Hasil biakan ini akan dipakai

pada fermentasi utama. Diagram alir pembuatan starter disajikan pada Gambar 6.

3.3.5 Pembuatan media fermentasi (Junk dan Pancoast 1980)

Pembuatan media fermentasi yaitu dengan preparasi buah lindur,

penambahan nutrient, pengaturan pH dan pasteurisasi. Tepung buah lindur

( B. gymnorrhiza) sebanyak 100 g dibuat menjadi larutan suspensi, yakni tepung

buah lindur dicampur dengan HCl 5% (v/v) dengan perbandingan 1:20 (b/v),

kemudian diaduk hingga rata sambil dipanaskan pada suhu 100 oC selama 1 jam.

Kemudian hidrolisis dilanjutkan di autoclave pada suhu 121 oC, tekanan 1 kg/m2

dengan waktu 1 jam. Hasil hidrolisis diendapkan ± 1 jam, lalu disaring

menggunakan nilon mesh 150, dan diambil filtratnya sebagai media untuk difermentasi. Selanjutnya, cairan hasil hidrolisis ditambah dengan nutrient berupa

0,5% NPK (b/b), 1% ZA (b/b) dan 2% gula pasir (b/b), diaduk hingga rata.

Kemudian pH larutan diatur 4-5, diambil nilai tengahnya ± 4,6 dengan cara

ditambah NaOH sedikit demi sedikit. Langkah selanjutnya adalah pasteurisasi

pada suhu 80 oC selama 5 menit, lalu didinginkan hingga 30 menit. Diagram alir

pembuatan media fermentasi diperlihatkan pada Gambar 7.

3.3.6 Pembuatan bioetanol



23

Pembuatan bioetanol ini terdiri dari fermentasi alkohol dan perlakuan

inkubasi. Fermentasi utama dilakukan pada toples kaca 200 ml. Substrat berupa

cairan glukosa hasil hidrolisis dimasukkan ke dalam 3 toples kaca 250 ml masing-

masing 200 ml. Starter ditambahkan sebanyak 10 %. Fermentasi dilakukan pada

kondisi anaerobik. Pipa kecil dipasang pada kepala toples kaca yang sebelumnya

ditutup, ujung pipa tersebut dibenamkan ke dalam air untuk menangkap CO2 dan

menghambat adanya sirkulasi udara bebas.

Perlakuan yang diberikan yaitu saat inkubasi atau waktu fermentasi (X)

adalah 3, 5, 7 hari. Terbentuknya gelembung-gelembung udara menunjukkan

proses fermentasi pembentukan alkohol sedang berjalan. Fermentasi berlangsung

pada suhu kamar (25-30 oC). Setelah masing-masing toples kaca dan isinya

mendapat perlakuan inkubasi, kemudian dilakukan pengujian jumlah alkohol yang

didapat dari tiap perlakukan dengan menggunakan Gas Chromatography (GC).

Diagram alir proses fermentasi diperlihatkan pada Gambar 8.

3.3.7 Pengujian

Pengujian yang dilakukan diantaranya uji pH akhir fermentasi, uji kadar

dan etanol (penetapan berat jenis). Diagram alir penentuan uji pH akhir, serta

kadar alkohol disajikan pada Gambar 8.

1) Uji pH akhir fermentasi (AOAC 2005)

Media yang sudah difermentasi di uji pH akhirnya dengan menggunakan

pH meter. Katoda pH meter dibilas dengan akuades kemudian dikeringkan dengan

kertas tisu. Katoda dimasukkan ke dalam buffer dengan pH 6,8, ditunggu sampai

ada tanda bunyi yang menunjukkan bahwa pH meter siap digunakan. pH meter

dimasukkan ke dalam media uji, hasilnya dicatat.

2) Uji kadar etanol (Subekti 2006)

Pengukuran konsentrasi etanol yang dihasilkan dengan menggunakan

Gas Chromatography (GC). Identifikasi kadar etanol dilakukan dengan

menginjeksikan metil ester pada kromatografi gas SupelcoTM 37 Component Fame

Mix dengan kondisi sebagai berikut: gas yang digunakan sebagai fase bergerak

adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit, sebagai bahan

pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 ml/menit, dan oksigen



24

dengan aliran 200-300 ml/menit, kolom yang digunakan adalah kolom kapiler

(capillary column) dB-23 berisi cyanopropil methylsil sepanjang 60 m dengan

diameter dalam 0,25 mm, dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Temperatur

terprogram sebesar 125 oC, kemudian suhu dinaikkan 5 oC per menit hingga suhu

akhir 225 oC, suhu injektor 220 oC, dan suhu detektor 240 oC.

Konsentrasi etanol diperoleh dari perhitungan rasio Area dimana luas area

etanol sampel dibagi dengan luas area n-propanol sampel. Kemudian hasil rasio

area tersebut dibagi dengan slope hasil kurva kalibrasi etanol.

Konsentrasi etanol standar = 99,9 %

Berat Jenis etanol standar = 798,21 g/L

Rasio Area = Luas area etanol sampel : Luas area n-propanol sampel

Konsentrasi (%) = Rasio/Slope



25

Gambar 6 Diagram alir pembuatan kultur starter.

(Rinaldy 1987 dalam Devis 2008 dimodifikasi)

Isolat

Sacharomyces cerevei

Inokulasi 3-5 jarum ose

Inkubasi 48 jam suhu 25-30 oC

Inokulasi (5 jarum ose)

Ditumbuhkan pada PDB 200 ml

Inkubasi 48 jam suhu 25-30oC

Diambil 10 % dari media,

dimasukan ke dalam 200 ml

Kultur starter

Kultur starter

dan media

Ditumbuhkan pada PDA 10 ml



26

Buah Lindur ( B. gymnorrhiza)

Pengeringan dan

en halusan

Diambil 200 gr

Hidrolisis (HCl 5 % 1:20

b/v, 121 oC, 2 am)

Penyaringan (Nilon mesh 150)

Pasteurisasi 80 oC, 5 menit

Penambahan nutrisi

Perlakuan 1 (X1)

200 ml media

(toples kaca)

Media

Filtrat

Gula 2 % NPK 0,5 %

ZA 1%

Media

Perlakuan 3 (X3)200 ml media

(toples kaca) Perlakuan 2 (X2)

200 ml media

(toples kaca)

Preparasi pemisahan daging

dan kulit buah lindur



27

Gambar 7 Diagram alir pembuatan media fermentasi dari buah lindur

( B. gymnorrhiza).(Rinaldy 1987 dalam Devis 2008 dimodifikasi)

Gambar 8 Diagram alir proses fermentasi dan penentuan kadar alkohol.(Rinaldy 1987 dalam Davis 2008 dimodifikasi)

Uji pHUji Kadar etanol

Inkubasi 3 hari

(X1)

Kultur starter dan media

fermentasi 660 ml

Alkohol

Inkubasi 7 hari

(X5) Inkubasi 5 hari

(X3)

Download - BAB III Metode Penelitian

Top Related