33
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode true eksperimental laboratory with
randomized post test only controlled group design secara in vivo yang bertujuan
untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanolik kulit buah manggis
terhadap perubahan ketebalan Perivascular Adipose Tissue (PVAT) pada tikus
Rattus Novergicus Strain Wistar yang diberikan High Fat Diet (HFD). Dalam
penelitian ini, intervensi yang dilakukan berupa pemberian HFD dan pemberian
ekstrak kulit manggis (EKM) dengan dosis 200 mg/kgBB, 400 mg/kgBB dan 800
mg/kgBB. ( Wihastuti, 2015)
4.2 Variabel Penelitian
4.2.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak etanolik kulit buah
manggis.
4.2.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah ketebalan PVAT.
4.3 Sampel Penelitian
34
Sampel penelitian berupa Tikus Rattus Novergicus strain Wistar . Untuk
mendapatkan data yang valid, banyak pengulangan ditentukan dengan Rumus
Federer :
t : jumlah kelompok perlakuan
r : jumlah pengulangan
Pada penelitian ini, terdapat lima jumlah perlakuan. Berikut ini adalah
pembagian kelompok perlakuan:
1. Kontrol negatif (KN) : tikus sehat dengan diet normal selama 3 bulan.
2. Kontrol positif (KP) : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan.
3. EKM 1 : tikus dengan pemberian HFD selama 1 bulan dan
dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 200
mg/kgBB selama 2 bulan.
4. EKM 2 : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan dan
dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 400
mg/kgBB selama 2 bulan.
5. EKM 3 : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan dan
dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 800
mg/kgBB selama 2 bulan.
Sehingga perhitungan jumlah pengulangan yang dilakukan adalah
Dari rumus diatas, didapatkan hasil pengulangan yang digunakan untuk
masing-masing kelompok sebanyak 5 atau lebih. Sehingga penelitian ini
menggunakan 25 ekor Tikus Rattus Novergicus strain Wistar.
(t-1) (r-1) ≥ 15
(t-1) (r-1) ≥ 15
(5-1) (r-1) > 15
r > 4,75 ≈ 5
35
4.4 Tempat dan Waktu Penelitian
Pemeliharaan dan perlakuan hewan coba dilakukan di Laboratorium
Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Pengamatan
serta pengukuran ketebalan PVAT dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
4.5 Alat dan Bahan Penelitian
4.5.1 Alat dan Bahan untuk Pemeliharaan Hewan Coba
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Kandang tikus untuk subjek penelitian
2. Neraca elektronik untuk menimbang sisa pakan
3. Sekam
4. Botol minum tikus
4.5.2 Alat dan Bahan untuk Pembuatan Diet Normal
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Neraca elektronik
2. Pakan standar tikus
4.5.3 Alat dan Bahan untuk Pembuatan HFD
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Neraca elektronik
2. Baskom
3. PARS 62%
36
4. Tepung terigu 20%
5. Kolesterol 1%
6. Asam kolat 0,2%
7. Kurvet 16,8%
4.5.4 Alat dan Bahan untuk Ekstraksi Kulit Manggis
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Kulit manggis kering
2. Metanol
3. Blender kering
4. Kertas saring
5. Beker glass
6. Oven timbangan analitik
7. Alat sekker
8. Erlemeyer
9. Alat evaporasi
4.5.5 Alat dan Bahan untuk Pembedahan Tikus
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Spuit untuk anastesi
2. Ketamin (anastesi)
3. Papan bedah
4. Jarum pentul untuk memfiksasi tikus dipapan bedah
5. Gunting bedah untuk membedah tikus
6. Pinset untuk membantu pembedahan
37
7. Kapas
8. Botol organ
9. Spidol marker
10. Wadah untuk mencuci organ tikus
11. Larutan PBS untuk mencuci organ tikus
12. Formalin 10%
4.5.6 Alat dan Bahan untuk Pembuatan Preparat Aorta
1. Mesin Tissue Tex Processor
2. Microtome
3. Slide
4. Cover glass
4.5.7 Alat dan Bahan untuk Pengukuran Ketebalan PVAT
Alat dan bahan yang digunakan adalah:
1. Preparat aorta
2. Pewarnaan HE (Hematoxilen Eosin)
3. Mikroskop
4. Komputer dengan software scan dotslide olyvia
4.6 Definisi Operasional
1. Pemberian High Fat Diet (HFD)
Perlakuan pemberian pakan dengan penambahan kolesterol 2%, asam kolat
0,2%, dan minyak babi 5% yang diberikan setiap hari 30 gram secara ad
libitum (Murwani, 2006).
38
2. Ekstrak etanolik kulit manggis
Ekstrak etanolik kulit manggis merupakan hasil dari proses ekstraksi kulit
manggis dengan pelarut etanol. Ekstrak kulit manggis diberikan bersamaan
dengan pemberian HFD. Dosis pemberian ekstrak kulit manggis adalah 200
mg/kg BB, 400 mg/kg BB dan 800 mg/kg BB dan diberikan selama 2 bulan
setelah pemberian HFD selama 1 bulan.
3. Perivascular Adipose Tissue (PVAT)
Perivascular adipocyte tissue (PVAT) adalah jaringan adiposit yang
mengelilingi pembuluh darah. Ketebalan dari PVAT berhubungan dengan
parameter sindroma metabolik seperti perbesaran lingkar pinggang,
hipertrigliseridemia, hiperglikemia dan pembentukan plak aterosklerotik.
Pengukuran rata-rata ketebalan PVAT dilakukan dengan cara mengukur
pada ketebalan terendah, sedang, dan tertinggi. Pengukuran dilakuakan
dengan menggunakan software scan dot slide olyvia di Laboratorim Patoloigi
Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
39
4.7 Prosedur Penelitian
Pengajuan Ethical Clearance ke Komisi Etik Penelitian Kesehatan (KEPK) FKUB, pembelian
alat dan bahan penelitian, serta pengurusan administrasi laboratorium.
Pembelian tikus Rattus Novergicus strain Wistar sebanyak 25 ekor
Pengecekan tikus dan aklimatisasi tikus selama 2 minggu
Pengelompokan tikus menjadi 5 kelompok berdasarkan simple random sampling
Kontrol
negatif
(dengan
diet
normal)
Kontrol
Positif
(dengan
HFD)
Kelompok
HFD + EKM
200 mg/kgBB
Kelompok
HFD + EKM
400 mg/kgBB
Kelompok
HFD + EKM
800 mg/kgBB
Pembedahan dan pengambilan profil lipid
Pembuatan preparat aorta, Pewarnaan dengan HE dan Pengukuran Ketebalan PVAT
Analisis Data
Perlakuan selama 3 bulan
Gambar 4.1 Alur penelitian
40
4.7.1 Pengurusan Administrasi
Langkah awal yang dilakukan dalam penelitian ini adalah mengurus
kelayakan etik (ethical clearance) yang meliputi proposal penelitian dan
pengajuan formulir layak etik. Bersamaan dengan itu, dilakukan juga
pendaftaran laboratorium serta pembelian alat dan bahan untuk perawatan tikus.
4.7.2 Persiapan Hewan Coba
Proses aklimatisasi tikus dilakukan selama 2 minggu di laboratorium
farmakologi FKUB. Selama proses aklimatisasi ini, semua tikus diberikan normal
diet dengan pakan standard sekali selama 24 jam dan kemudian diganti pada
hari berikutnya. Berat pakan standard masing-masing 30 gram. Setelah masa
aklimatisasi selesai, dilakukan pengelompokan hewan coba sesuai dengan
kelompok perlakuan.
4.7.3 Pembagian Kelompok Perlakuan
Terdapat 5 kelompok perlakuan dalam penelitian ini. Kelompok kontrol
negatif yaitu tikus sehat dengan diet normal selama 3 bulan, lalu kelompok
kontrol positif yaitu tikus sehat dengan pemberian HFD (high fat diet) selama 3
bulan. Lalu tikus kelompok 1, 2, dan 3 diberikan HFD dan Ekstrak Kulit Manggis
dengan berbagai dosis, 200 mg/kgBB, 400 mg/kgBB, dan 800 mg/kgBB selama 3
bulan dengan sonde.
4.7.4 Pemberian Pakan dan Pembuatan Tikus Model Aterosklerosis
Pemberian pakan tikus sesuai dengan kelompok perlakuan. Kelompok
negatif tetap diberikan normal diet yang sama dengan pakan selama masa
aklimatisasi. Kelompok dengan HFD diberikan perlakuan pemberian pakan
41
dengan penambahan kolesterol 2%, asam kolat 0,2%, dan minyak babi 5% yang
diberikan setiap hari 30 gram secara ad libitum.
4.7.5 Prosedur Ekstraksi Kulit Manggis
Kulit manggis dicuci bersih sebelum dikeringkan, Potong kecil-kecil
kemudian dioven dengan suhu 80 derajat atau dengan panas matahari sampai
kering ( bebas kandungan air). Setelah kering dihaluskan dengan blender
sampai halus. Timbang sebanyak 100 gram sampel kering (kulit manggis) ke
dalam gelas erlenmeyer ukuran 1 liter, Kemudian rendam dengan etanol sampai
volume 1000 ml, Kocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit), Didiamkan
1 malam sampai mengendap. Ambil lapisan atas campuran etanol dengan zat
aktif yang sudah terambil, Masukan dalam labu evaporasi 1 liter. Pasang labu
evaporasi pada evaporator, Isi water bath dengan air sampai penuh, Pasang
semua rangkaian alat termasuk rotary evaporator, pemanas water bath ( atur
sampai 90 derajat), sambungkan dengan aliran listrik, Biarkan larutan etanol
memisah dengan zat aktif yang sudah ada dalam labu, Tunggu sampai aliran
etanol berhenti menetes pada labu penampung (± 1,5 sampai 2 jam untuk 1
labu), Hasil yang diperoleh kira-kira 1/3 dari bahan alam kering, Masukan hasil
ekstraksi dalam botol plastik, Simpan dalam freezer.
4.7.6 Pembedahan Hewan Coba
Pembedahan tikus dilakukan setelah 2 bulan pemberian EKM.
Pembedahan dilakukan setelah hewan coba diberikan anastesi ketamin. Setelah
itu, tikus ditaruh di tempat pembedahan dan difiksasi keempat kaki tikus dengan
menggunakan jarum. Kemudian dilakukan pembedahan tikus dan diambil aorta
42
nya. Aorta lalu ditaruh dalam botol organ dan diawetkan dengan menggunakan
formalin 10%.
4.7.7 Pembuatan Parafin Blok
Setiap jaringan harus menjadi smear atau section terlebih dahulu sebelum
dilihat di bawah mikroskop karena identifikasi hubungan suatu penyakit dan
perubahan terhadap histopatologi dilakukan dengan melihat sediaan jaringan
dibawah mikroskop. Section merupakan pemotongan jaringan menjadi berukuran
mikro kemudian diwarnai untuk bisa di lihat di bawah mikroskop. Parafin blok
merupakan proses awal pembuatan sediaan. Untuk membersihkan dari
kontaminan, jaringan dicuci dengan PBS 3-5x. Lalu difiksasi pada formalin 10%.
Kemudian dehidrasi masing-masing selama 60 menit menggunakan alkohol
bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96%, dan absolut). Clearing menggunakan
xilol 2x masing-masing selama 60 menit. Setelah itu dilakukan infiltrasi selama 60
menit dengan parafin lunak pada suhu 48 derajat celcius. Lakukan block dalam
parafin keras, pada cetakan, didiamkan selama 1 hari. Lalu keesokan hari
ditempelkan pada holder dan dipotong setebal 4-6 µm dengan rotary microtome.
Dilakukan mounting dengan gelatin 5% pada gelas objek. Selanjutnya dilakukan
proses deparafinasi. Gelas obyek dari Parafin Block direndam di dalam Xilol 2x
masing-masing selama 5 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi masing-masing
selama 5 menit menggunakan alkohol berseri (Absolut, 96%, 80%, 70%, 50%dan
30%). Pada tahap terakhir slide dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit. Lalu
diwarnai dengan Hematoxilen selama 10 menit. Kemudian selama 10 menit
direndam di dalam tap water lalu dibilas dengan H2O. Dilakukan dehidrasi
dengan alkohol berseri (30% dan 50%) masing-masing selama 5 menit.
43
Selanjutnya selama 3 menit diwarnai dengan larutan eosin. Selanjutnya dibilas
dengan alkohol 30%. Dicuci dengan H20 selama 5 menit dan dikering anginkan.
Setelah itu dilakukan mounting dan tutup dengan cover glass (Chandra et al.
2014).
4.7.8 Pembuatan Preparat Aorta
Sampel yang diambil adalah potongan arkus aorta tikus. Aorta yang telah
diambil dari tikus kemudian dipotong dengan ketebalan ± 2-3 mm dan kemudian
dimasukkan kedalam formalin 10% untuk difiksasi. Jaringan yang telah difiksasi
kemudian diproses dengan menggunakan alat tissue tex processor, kemudian di
blok dengan paraffin untuk selanjutnya dipotong dengan mesin microtome
dengan ketebalan 3-5 mikron. Kemudian ditaruh dalam oven selama 1-2 jam
dengan suhu 600C, lalu dimasukkan ke dalam larutan xylol selama 15 menit,
alkohol 96% selama 3 menit, dan kemudian dicuci bersih denganair mengalir
selama 10 menit. Jaringan kemudian siap untuk diberi cat utama yaitu
Hematioxilin Eosin selama 10-15 menit. Lalu dicuci kembali dengan air mengalir
selama 15 menit. Masukkan ke dalam alkohol asam 1% sebanyak 2-5 celup ,
lalu ke dalam amoniak air 3-5 celup. Setelah itu diberi cat pembanding yaitu
eosin 1% selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan
memasukkan ke dalam alkohol 80% selama 3 menit, alkohol 96% selama 3
menit, dan alkohol 96% selama 3 menit, kemudian dilakukan penjernihan dengan
larutan xylol selama 15 menit sebanyak 2 kali, lalu mounting dengan entelan dan
deck glass. Preparat siap digunakan.
44
4.7.9 Pengukuran Ketebalan PVAT
Ketebalan PVAT diukur dengan melakukan pengamatan pada preparat
aorta. Preparat aorta discan terlebih dahulu dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 400x, kemudian dilihat dan diukur dengan menggunakan
software Scan Dot Slide Olyvia pada komputer. Ketebalan PVAT pada setiap
sampel diukur sebanyak tiga kali dengan mengukur pada ketebalan terendah,
sedang, dan tertinggi. Ketiga pengukuran tersebut kemudian dibagi tiga,
sehingga didapatkan rata-rata ketebalan PVAT. Kemudian, pengukuran
ketebalan PVAT harus tegak lurus dengan tunika media pembuluh darah.
Pengukuran PVAT pada penelitian ini dilakukan dengan cara double blind, yaitu
dengan dihitung lebih dari dua pemeriksa, sehingga dapat dipastikan hasilnya
adalah objektif.
Keterangan:
P (min) : Ketebalan PVAT terendah (µm)
P (med) : Ketebalan PVAT sedang (µm)
P (max) : Ketebalan PVAT tertinggi (µm)
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝐾𝑒𝑡𝑒𝑏𝑎𝑙𝑎𝑛 𝑃𝑉𝐴𝑇 =𝑃 𝑚𝑖𝑛 + 𝑃 𝑚𝑒𝑑 + 𝑃 𝑚𝑎𝑥
3
T. Media Pembuluh Darah
PVA
x
Gambar 4.2
Skema cara Pengukuran Ketebalan PVAT
Pengukuran menggunakan garis tarik (x) yang
tegak lurus dengan penampang tunika media
pembuluh darah aorta (Heriansyah et al. 2015)
45
4.8 Pengolahan Data
Data dari hasil penelitian ini disajikan dalam bentuk ±SD. Lalu data
dianalisis dengan statistik parametric menggunakan SPSS (Software Statistical
Product and Service Solution) versi 16 dengan tingkat signifikansi 0.05 (p =0.05)
dan taraf kepercayaan 95% (α = 0.05). Berikut langkah-langkah uji hipotesis
komparatif dan korelatif:
4.8.1 Uji Normalitas (dengan menggunakan Shapiro-Wilk)
Uji normalitas digunakan untuk menginterpretasikan apakah suatu data
memilki persebaran data yang normal atau tidak. Hal ini dikarenakan
pemilihan penyajian data dan uji hipotesis tergantung dari normal tidaknya
distribusi data. Untuk penyajian data yang terdistribusi normal, ukuran
pemusatan dan penyebaran menggunakan mean dan standar deviasi.
Sedangkan untuk penyajian data yang tidak terdistribusi normal, ukuran
pemusatan dan penyebaran menggunakan median dan minimum-
maksimum. Lalu untuk melakukan uji hipotesis, jika persebaran data normal,
maka digunakan uji parametrik. Sedangkan jika persebaran data tidak
normal, maka digunakan uji non parametrik.
Penelitian ini menggunakan uji normalitas Shapiro-Wilk. Hal ini karena
jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini kurang dari 50 (n ≤ 50)
dan uji Shapiro-Wilk akan lebih akurat jika jumlah sampel kurang dari 50.
4.8.2 Uji Homogenitas (mengguakan Levene)
Uji homogenitas digunakan untuk menguji berlaku atau tidaknya asumsi
ANOVA, yaitu apakah data yang diperoleh dari setiap perlakuan memiliki
46
varian yang homogen atau tidak. Suatu data dikatakan memiliki varian yang
homogen bila memiliki nilai signifikansi lebih dari 0.05 (p ≥ 0.05).
Penelitian ini menggunakan uji homogenitas Levene. Dan apabila
penelitian ini memiliki varian yang homogen maka analisa dapat dilanjutkan
dengan uji ANOVA.
4.8.3 Uji One Way ANOVA
Uji One Way ANOVA merupakan uji hipotesis komperatif numerik lebih
dari dua kelompok perlakuan tidak berpasangan berdistribusi normal. Uji ini
bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang berbeda terhadap
rata-rata ketebalan PVAT. Perbedaan rata-rata ketebalan PVAT dinyatakan
bermakna apabila nilai signifikansi kurang dari 0.05 ( p < 0.05)